YAP干擾下調(diào)MARCO受體表達(dá)抑制肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能*

冀彩麗， 王梓璇， 李 帆， 龐洪源， 蘇浩宇， 華夢(mèng)晴， 宋傳旺 △

蚌埠醫(yī)學(xué)院 1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，2慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠 233030 3蚌埠醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，蚌埠 233030

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由于多種因素導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)改變而引起的急性進(jìn)行性呼吸衰竭，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)一步發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征。ALI是臨床常見(jiàn)危重癥，死亡率高達(dá)30%～40%，其發(fā)病率與死亡率隨年齡增長(zhǎng)而增加[1-2]。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)是聚居在肺部氣道和肺泡腔的一線防御細(xì)胞。作為專(zhuān)職吞噬細(xì)胞，AMs通過(guò)識(shí)別和吞噬作用清除氣道內(nèi)隨呼吸進(jìn)入的病原體和顆粒物[3]，并且AMs還通過(guò)吞噬損傷、衰老和死亡的細(xì)胞在維持肺泡環(huán)境平衡和穩(wěn)定中起重要作用[4]。我們前期的研究表明，ALI小鼠AMs吞噬功能降低[5]，但具體的機(jī)制尚不清楚。

Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信號(hào)通路下游的主要效應(yīng)分子，分子量為65 kD，富含脯氨酸。它是調(diào)節(jié)機(jī)體多種生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄共激活因子，不僅能對(duì)機(jī)械信號(hào)做出響應(yīng)，而且能調(diào)節(jié)細(xì)胞的機(jī)械骨架[6]。YAP蛋白在心臟、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等多種器官和組織中發(fā)揮著重要作用，它可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能，從而控制器官大小和組織發(fā)育穩(wěn)態(tài)。YAP的失調(diào)會(huì)引起相關(guān)基因的表達(dá)改變，從而影響細(xì)胞的功能[7]。最新的研究表明，YAP可以通過(guò)增加絲狀偽足的形成從而促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞(airway epithelial cell，AEC)這種非專(zhuān)職吞噬細(xì)胞的吞噬功能[6，8-9]。但目前YAP是否可以調(diào)節(jié)如AMs這樣的專(zhuān)職吞噬細(xì)胞的吞噬功能還不甚清楚。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等技術(shù)觀察YAP是否可調(diào)節(jié)AMs的吞噬功能，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及急性肺損傷模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。小鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組和ALI模型組。ALI模型小鼠采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，5 mg/kg)經(jīng)鼻腔1次滴入激發(fā)，正常對(duì)照組使用PBS代替LPS鼻滴，造模24 h后，取肺泡灌洗液檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株MH-S為半貼壁半懸浮細(xì)胞，從武漢普諾賽生命科技有限公司購(gòu)入；實(shí)驗(yàn)中所使用的原代小鼠肺泡巨噬細(xì)胞均為從小鼠肺內(nèi)分離純化獲得，為貼壁細(xì)胞。

1.3 主要試劑

脂多糖購(gòu)于Sigma公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、胰酶消化液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、NP-40裂解液、PMSF、上樣緩沖液(5×)、PVDF(聚偏二氟乙烯)膜、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、胞質(zhì)蛋白提取試劑盒均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)于Hyclone公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)多抗、YAP單抗和GAPDH單抗購(gòu)于Proteintech公司；siRNA引物序列(FAM/YAP/Sc)購(gòu)于上海吉瑪公司；Engreen-R4000 RNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于北京英格恩有限公司；Verteporfin購(gòu)于MCE公司。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集和原代小鼠AMs的分離

使用頸椎脫位法將小鼠處死，在75%的乙醇中浸泡消毒，使用無(wú)菌注射器抽取無(wú)菌PBS緩慢注入到小鼠氣管內(nèi)，停留約1 min后再緩慢回抽，重復(fù)此步驟約10～15次；將抽出的BALF使用15 mL離心管收集保存?zhèn)溆?；離心后的細(xì)胞沉淀先經(jīng)裂解紅細(xì)胞處理，再離心棄去上清使用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁分離；4 h后吸棄培養(yǎng)液上清，無(wú)菌PBS輕輕沖洗，培養(yǎng)皿中貼壁的細(xì)胞即為原代小鼠AMs。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種在孔板中，當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到50%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將Engreen-R4000 RNA轉(zhuǎn)染試劑加入無(wú)血清培養(yǎng)液中混勻；取siRNA(FAM/YAP/Sc)，加入一定量的無(wú)血清培養(yǎng)液，充分混勻；將2種懸液混合，制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將復(fù)合物加入到孔板的細(xì)胞中；孵育48 h后在熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)干擾效率。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)AMs吞噬功能

將各處理組AMs按照1×105個(gè)/孔進(jìn)行布孔，待細(xì)胞貼壁后，將FITC-E.coli與細(xì)胞按照10∶1的比例加入到各組中，孵育1 h后每孔加入20 μL 4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液以淬滅細(xì)胞外熒光，并使用PBS沖洗殘留的E.coli和臺(tái)盼藍(lán)溶液，再加入0.25%的胰酶消化后收集細(xì)胞，加入300 μL多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)AMs對(duì)E.coli的吞噬率。

1.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

取小鼠AMs(原代AMs/MH-S細(xì)胞株)，采用NP-40裂解液提取總蛋白，試劑盒提取胞質(zhì)蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白以10%的SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%工業(yè)脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗(GAPDH 1∶50000，YAP 1∶5000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后與HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，然后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光顯影條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ALI小鼠AMs中YAP蛋白表達(dá)降低

本研究采用LPS經(jīng)鼻滴入氣道的方法誘導(dǎo)ALI小鼠模型，LPS滴入24 h后經(jīng)支氣管肺泡灌洗獲取原代小鼠AMs。與正常對(duì)照組小鼠AMs比較，ALI模型小鼠AMs總蛋白及胞質(zhì)蛋白中YAP的表達(dá)均降低(圖1A、1B)。ALI小鼠模型的BALF中TNF-α含量升高[10]，因此我們使用TNF-α(200 ng/mL)刺激MH-S細(xì)胞株構(gòu)建ALI巨噬細(xì)胞模型。TNF-α刺激24 h后，MH-S細(xì)胞總蛋白和胞質(zhì)蛋白中YAP的表達(dá)均降低(圖1C、1D)，與ALI動(dòng)物模型來(lái)源的原代AMs結(jié)果一致。上述結(jié)果說(shuō)明ALI環(huán)境下AMs中YAP的蛋白表達(dá)降低。

A：Western blot檢測(cè)獲取自ALI模型小鼠及正常對(duì)照小鼠(Normal)的原代AMs總蛋白和胞質(zhì)蛋白中YAP蛋白表達(dá)情況；B：A實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)圖，與Normal組比較，*P<0.05 **P<0.01；C：Western blot檢測(cè)經(jīng)200 ng/mL的TNF-α刺激24 h后的MH-S細(xì)胞與未刺激的對(duì)照細(xì)胞(Control)中YAP蛋白表達(dá)情況；D：C實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)圖，與Control組比較，*P<0.05 圖1 ALI小鼠AMs中YAP蛋白表達(dá)降低Fig.1 Reduced YAP protein expression in AMs of ALI mice

2.2 YAP干擾抑制AMs的吞噬功能

為探究YAP對(duì)AMs吞噬功能的影響，我們進(jìn)行了YAP干擾試驗(yàn)。熒光顯微鏡觀察證明siRNA轉(zhuǎn)入MH-S的效率大于95%(圖2A)，轉(zhuǎn)染后YAP總蛋白的表達(dá)減少了70%(圖2B)，說(shuō)明RNA干擾有效。YAP干擾組及其對(duì)照細(xì)胞與FITC標(biāo)記的E.coli孵育后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MH-S吞噬E.coli的情況。結(jié)果如圖2C，與對(duì)照組相比，YAP干擾組MH-S細(xì)胞吞噬E.coli的能力明顯降低(P<0.01，圖2D)。為進(jìn)一步證明YAP對(duì)AMs吞噬功能的影響，我們使用YAP抑制劑Verteporfin抑制YAP活性后觀察MH-S細(xì)胞吞噬功能的變化。與對(duì)照組相比，YAP活性抑制組MH-S吞噬E.coli的能力也明顯降低(圖2E、2F)，與YAP干擾的結(jié)果一致。上述結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論是YAP活性抑制還是干擾YAP表達(dá)，AMs吞噬E.coli的能力均下降。

2.3 AMs吞噬功能降低涉及MARCO受體下降

清道夫受體(scavenger receptor，SR)根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能可以分為A～J 10個(gè)亞類(lèi)，其中SR-A和SR-B與肺部炎性疾病的關(guān)系更為密切[11]。研究表明，SR-A(-/-)小鼠更易受到肺炎支原體的感染，并可通過(guò)靶向MARCO受體的表達(dá)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抵御流感病毒的能力[12]。我們首先觀察MARCO阻斷抗體對(duì)MH-S細(xì)胞吞噬E.coli的影響。使用MARCO抗體阻斷后，再使用APC-MARCO Ab表面染色MH-S細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，阻斷組MARCO平均熒光強(qiáng)度明顯降低(圖3A、3B)，說(shuō)明AMs表面MARCO受體阻斷有效。將MH-S細(xì)胞先用MARCO Ab阻斷后再與FITC標(biāo)記的E.coli一起孵育，流式檢測(cè)MH-S細(xì)胞吞噬情況，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，MARCO Ab作用組MH-S細(xì)胞吞噬能力顯著降低(圖3C、3D)。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明AMs吞噬E.coli的作用通過(guò)MARCO受體介導(dǎo)。進(jìn)一步觀察YAP對(duì)AMs表面MARCO受體表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)干擾YAP表達(dá)后，MH-S細(xì)胞表面MARCO受體表達(dá)降低(圖3E、3F)。

1：Control；2：Mock；3：Sc siRNA；4：YAP siRNA；A：熒光顯微鏡檢測(cè)MH-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM-Sc siRNA的效率(×200)；B：Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染YAP siRNA后MH-S細(xì)胞總蛋白中YAP蛋白表達(dá)情況，與Sc siRNA組比較，**P<0.01；C、D：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)FITC標(biāo)記E.coli的吞噬率，代表性流式圖(C)和統(tǒng)計(jì)圖(D)，與Sc siRNA組比較，**P<0.01；E、F：2 μmol/L的Verteporfin(VP)或溶劑DMSO對(duì)MH-S細(xì)胞吞噬功能的影響，代表性流式圖(E)和統(tǒng)計(jì)圖(F)，與Control組比較，**P<0.01；Control：空白對(duì)照組，Mock：轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，Sc siRNA：干擾對(duì)照組，YAP siRNA：YAP干擾組圖2 干擾YAP表達(dá)或抑制其活性對(duì)AMs吞噬功能的影響Fig.2 Effect of YAP expression interference or YAP activity inhibition on phagocytosis ability of AMs

3 討論

ALI是以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、低氧血癥和肺水腫為特征的急性全身性炎癥的肺部表現(xiàn)，屬于急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的輕度階段[4]。引起ALI的誘導(dǎo)因素中，細(xì)菌和病毒感染是常見(jiàn)的主要原因[13]。吞噬作用是吞噬細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列高度復(fù)雜且協(xié)調(diào)的分子機(jī)制與外源性顆粒異物識(shí)別、結(jié)合、攝取和消化的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)清除氣道中的病原體，消除炎癥至關(guān)重要[14]。

YAP是Hippo通路重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子[15]。應(yīng)激反應(yīng)中，YAP能促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的增殖和分化[16]，也能通過(guò)促進(jìn)傷口愈合和組織再生，緩解細(xì)菌所致的肺部炎癥[17-18]。YAP信號(hào)通路異常與多種肺部疾病相關(guān)，如肺癌、肺纖維化、肺動(dòng)脈高壓、COPD、哮喘、肺部感染等[19]。有研究表明，YAP基因敲除小鼠表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[20]；而且在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞[21]和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[22]中YAP的表達(dá)也受到抑制。以上的研究表明YAP表達(dá)與ALI存在關(guān)聯(lián)，而具體的機(jī)制還不清楚。

AMs是氣道內(nèi)的主要免疫細(xì)胞，是肺部抵御入侵病原微生物的第一道防線，在受到刺激后會(huì)發(fā)生極化產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[23]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其主要功能是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡、炎癥和自身免疫[24]。研究顯示，TNF-α刺激小鼠軟骨細(xì)胞[25]和大鼠肝臟祖細(xì)胞[26]后，YAP的表達(dá)顯著減少。這些研究與本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)ALI小鼠原代AMs中YAP表達(dá)和TNF-α刺激MH-S后YAP的表達(dá)結(jié)果相一致，說(shuō)明在炎癥環(huán)境下，無(wú)論是體內(nèi)還是體外AMs中YAP的表達(dá)均下降。

A、B：MH-S細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種6孔板，加入1 μg/mL的MARCO阻斷抗體(MARCO Ab)或者同型抗體(Iso Ab)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，對(duì)各組細(xì)胞使用APC-MARCO或者同型對(duì)照流式抗體進(jìn)行染色，檢測(cè)細(xì)胞表面MARCO受體的阻斷情況，代表性流式圖(A)和統(tǒng)計(jì)圖(B)，與Iso Ab組比較，*P<0.05；C、D：將各組MH-S細(xì)胞與FITC-E.coli共同孵育后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞吞噬率，代表性流式圖(C)和統(tǒng)計(jì)圖(D)，與空白對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05；E、F：MH-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染YAP siRNA及其對(duì)照Sc siRNA 48 h后，使用APC-MARCO或者同型對(duì)照流式抗體進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面MARCO受體的表達(dá)情況，代表性流式圖(E)和統(tǒng)計(jì)圖(F)，與Sc siRNA組比較，**P<0.01；Isotype：同型對(duì)照組，Control：空白對(duì)照組，Mock：轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，Sc siRNA：干擾對(duì)照組，YAP siRNA：YAP干擾組圖3 AMs吞噬功能降低涉及MARCO受體表達(dá)下降Fig.3 MARCO receptor expression reduction is involved in the phagocytosis ability decline of AMs

吞噬細(xì)胞吞噬功能變化會(huì)直接影響各種疾病的發(fā)生發(fā)展，比如阿爾茨海默病患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能下降會(huì)影響患者的生存且預(yù)后不佳[27]；吸入氫氣可以增強(qiáng)哮喘小鼠AMs吞噬功能以減輕哮喘癥狀[28]。我們前期的研究結(jié)果表明，YAP可以促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的吞噬功能[6]。但YAP與AMs這種專(zhuān)職巨噬細(xì)胞吞噬功能的關(guān)聯(lián)還不清楚，所以我們采用siRNA干擾YAP表達(dá)或以抑制劑抑制YAP活性后檢測(cè)其吞噬功能，發(fā)現(xiàn)其吞噬功能與對(duì)照組相比均下降，與上述研究結(jié)果相一致。說(shuō)明YAP活性能影響AMs吞噬功能，而吞噬作用對(duì)ALI的發(fā)展至關(guān)重要，所以探討YAP對(duì)吞噬功能的調(diào)控及其機(jī)制，對(duì)研究ALI的進(jìn)展有重要意義。清道夫受體參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，例如動(dòng)脈粥樣硬化[29]、代謝紊亂以及作為調(diào)節(jié)因子參與宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)等。MARCO是表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體，屬于SR-B家族，其對(duì)病原體的清除具有重要作用[30]。當(dāng)MARCO受體的表達(dá)減少時(shí)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬偽足數(shù)量明顯減少，從而導(dǎo)致吞噬功能下降[31]。本研究將MH-S細(xì)胞表面MARCO受體阻斷后，發(fā)現(xiàn)其吞噬E.coli的能力降低，表明MARCO受體在AMs吞噬E.coli過(guò)程中扮演著重要的角色。采用YAP siRNA干擾MH-S細(xì)胞后再去檢測(cè)MARCO受體表達(dá)，與對(duì)照組相比，YAP干擾組MARCO受體表達(dá)明顯下降，說(shuō)明AMs中MARCO受體的表達(dá)受到Y(jié)AP調(diào)控。但是當(dāng)機(jī)體受到刺激后，YAP具體是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控AMs表面MARCO受體表達(dá)還有待研究。

綜上所述，本研究證明ALI小鼠AMs中YAP蛋白表達(dá)下降，干擾YAP表達(dá)可以導(dǎo)致AMs表面MARCO受體表達(dá)降低和吞噬E.coli功能減弱。本研究說(shuō)明了ALI小鼠AMs吞噬功能降低的可能原因，對(duì)探討專(zhuān)職吞噬細(xì)胞其吞噬功能的機(jī)制具有重要意義。