調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在成人原發(fā)免疫性血小板減少癥中的表達(dá)研究

傅磊 李亮 卞建軍 沈磊 蘇玉璇 左金曼

成人原發(fā)免疫性PLT減少癥(ITP)曾稱特發(fā)性PLT減少性紫癜，是一種由自身抗體介導(dǎo)，以PLT破壞增加及生成減少為特征的獲得性自身免疫性出血性疾病[1-2]。ITP患者存在體液免疫功能異常，亦存在細(xì)胞免疫功能異常，特別是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg細(xì)胞)的數(shù)量和(或)功能異常在疾病發(fā)生發(fā)展中起到十分重要的作用[3]。本文應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成年ITP患者治療前后Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞水平變化，并與正常人進(jìn)行比較，旨在了解ITP患者細(xì)胞免疫功能異常情況，為其治療提供方向。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2017年1月～2020年6月于我科門診就診及住院的ITP患者82例(ITP組)，其中男45例，女37例，年齡16～72歲，平均年齡(44.52±11.26)歲，發(fā)病時(shí)平均PLT計(jì)數(shù)(10.25±6.32)×109/L。ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《成人原發(fā)免疫性PLT減少癥診斷與治療中國專家共識(shí)(2016年版)》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他自身免疫性疾病繼發(fā)PLT減少；(2)顱內(nèi)出血；(3)嚴(yán)重血栓病史；(4)嚴(yán)重肝、腎功能不全或心、肺功能障礙；(5)忌用糖皮質(zhì)激素；(6)妊娠或哺乳期。納入同期于我院體檢的健康者45例(對(duì)照組)，其中男25例，女20例，年齡19～65歲，平均年齡(43.78±10.59)歲。所有對(duì)照組受試者均已排除自身免疫性疾病和過敏性疾病史者。兩組受試者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

2.方法

(1)一般資料收集：收集所有受試者的一般資料，包括年齡、性別。收集ITP患者發(fā)病時(shí)的PLT計(jì)數(shù)。

(2)治療方案：根據(jù)治療方案將82例ITP患者分為地塞米松組(地塞米松單藥治療，10例)和地塞米松+重組人PLT生成素(rhTPO)組(地塞米松聯(lián)合rhTPO治療，72例)。地塞米松單藥治療方案：地塞米松40 mg，每日1次靜脈滴注，共4日。地塞米松聯(lián)合rhTPO治療方案：地塞米松40 mg，每日1次靜脈滴注，共4日；rhTPO 15 000 U，每日1次皮下注射(PLT計(jì)數(shù)≥100×109/L時(shí)停用，最多應(yīng)用14日)。

(3)療效判斷：參照《成人原發(fā)免疫性PLT減少癥診斷與治療中國專家共識(shí)(2016年版)》[4]，療效包括完全反應(yīng)(CR)、有效(R)及無效(NR)，治療有效例數(shù)=CR例數(shù)+R例數(shù)。根據(jù)療效將82例ITP患者分為治療有效組(75例)和治療無效組(7例)。

(4)Treg細(xì)胞及Breg細(xì)胞水平檢測(cè)：所有治療有效患者均在治療前、后留取血液樣本，治療無效患者在治療開始后4周留取血液樣本，對(duì)照組受試者于體檢時(shí)留取血液樣本。加入不同抗體采用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)，應(yīng)用BD Cell Quest軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別記錄CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞及CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞水平。

結(jié) 果

1.ITP患者治療后的臨床療效：82例ITP患者中地塞米松單藥治療10例，地塞米松聯(lián)合rhTPO治療72例。見表1。兩種方案治療后共75例有效(包括63例CR和12例R)，7例無效，總有效率為91.46%(75/82)。

表1 ITP患者治療后的臨床療效(例)

2.ITP組治療前和對(duì)照組受試者兩種細(xì)胞水平比較：ITP組治療前CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞及CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 ITP組治療前和對(duì)照組受試者兩種細(xì)胞水平比較

3.治療有效組和治療無效組患者治療前后兩種細(xì)胞水平比較：治療前兩組患者CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞及CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后治療有效組患者兩種細(xì)胞水平均高于同組治療前及同期治療無效組(P<0.05)，治療無效組患者治療前后兩種細(xì)胞水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 治療有效組和治療無效組患者治療前后兩種細(xì)胞水平比較

討 論

ITP是一種臨床常見出血性疾病，原因?yàn)楦鞣N免疫介導(dǎo)而致患者PLT過度破壞、PLT生成減少，引起發(fā)病[5]。T細(xì)胞及B細(xì)胞水平異常及功能改變?cè)诙喾N自身免疫性疾病中均起到重要作用。Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞具有低反應(yīng)性及免疫抑制性，通過獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)和維持機(jī)體的自身免疫耐受。Treg細(xì)胞可高表達(dá)CD25，分泌IL-10及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β等多種細(xì)胞因子，并表達(dá)特異性的FOXP3轉(zhuǎn)錄因子，因此CD4+CD25+FOXP3+是最經(jīng)典的Treg細(xì)胞免疫表型，此類Treg細(xì)胞可通過抑制T細(xì)胞的活化及自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子的分泌等作用，維持外周免疫耐受，可參與多種變態(tài)反應(yīng)性疾病及腫瘤免疫的發(fā)病[6-7]。Breg細(xì)胞是另一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的B細(xì)胞亞群[8]，可分泌IL-35、IL-10及TGF-β等細(xì)胞因子，參與自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、惡性腫瘤及過敏性疾病等多種疾病的免疫反應(yīng)。Breg細(xì)胞的常見表型有CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+、CD19+CD25highCD71high、CD19+CD24+FOXP3+等，目前研究最多的是CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞。

Treg細(xì)胞減少及其功能缺陷會(huì)引起多種自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[9-10]。ITP作為一種十分常見的自身免疫性疾病，越來越多的研究開始探討其發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中Treg細(xì)胞發(fā)揮的作用。現(xiàn)有研究表明，ITP患者外周血及脾臟中的Treg細(xì)胞水平均明顯下降[11-12]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在ITP患者中不僅存在水平減少，還有功能的下降，其伴隨增殖相關(guān)蛋白水平下降和細(xì)胞自噬功能降低，從而參與疾病的發(fā)生及發(fā)展[13]。有學(xué)者通過檢測(cè)ITP患者體內(nèi)Treg細(xì)胞全基因組微小RNA(miRNA，miR)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其中miR-155-5p、miR-146b-5p和miR-142-3p的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，推測(cè)在ITP患者中miRNAs的低表達(dá)可能影響Treg細(xì)胞的功能[14]。本研究檢測(cè)ITP患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ITP患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞水平明顯降低，與上述研究結(jié)果一致，提示Treg水平減少可能是影響ITP疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。有研究進(jìn)一步證明，ITP患者Treg細(xì)胞水平在進(jìn)行糖皮質(zhì)激素治療前明顯低于正常人，但治療后Treg細(xì)胞水平明顯升高[15]。特別是經(jīng)大劑量地塞米松治療后，ITP患者Treg細(xì)胞數(shù)量明顯升高，PLT水平迅速恢復(fù)[16]。Sakakura等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，ITP患者在進(jìn)行相關(guān)治療后處于完全緩解期時(shí)，特別是在脾臟切除術(shù)后，其Treg細(xì)胞水平明顯升高。另有學(xué)者通過系列針對(duì)成人和兒童ITP患者的研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞在外周血、骨髓和脾臟中的水平均顯著降低，Treg細(xì)胞功能明顯受損；在經(jīng)地塞米松、利妥昔單抗或PLT生成素受體激動(dòng)劑等方案治療后，Treg細(xì)胞失調(diào)情況得以改善，PLT水平恢復(fù)[18]。本研究所有ITP患者在地塞米松單藥或聯(lián)合rhTPO治療方案治療后，治療有效組患者CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞水平較同組治療前明顯升高，而治療無效組該細(xì)胞水平較同組治療前無明顯升高，提示ITP患者Treg細(xì)胞水平異常可能參與疾病發(fā)展。

Breg細(xì)胞水平減少及功能缺陷可參與SLE、再生障礙性貧血等多種自身免疫性疾病的發(fā)展過程[19-20]。目前Breg細(xì)胞在ITP中的作用得到越來越多的研究證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者體內(nèi)Breg細(xì)胞水平明顯下降，并可通過調(diào)節(jié)體液免疫影響IL-10及TGF-β等細(xì)胞因子的表達(dá)，使患者Breg細(xì)胞功能下降[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞水平明顯低于對(duì)照組，與上述研究結(jié)果一致，提示Breg細(xì)胞水平減少可能是ITP發(fā)病的重要因素。相關(guān)研究顯示，ITP患者應(yīng)用地塞米松治療后，體內(nèi)Breg細(xì)胞水平升高，并促進(jìn)IL-10的分泌增加，療效顯著[22]。另有學(xué)者通過應(yīng)用rhTPO聯(lián)合沙利度胺方案治療難治性ITP患者發(fā)現(xiàn)，加用rhTPO后患者Breg細(xì)胞和Treg細(xì)胞水平均顯著升高，總緩解率明顯提高[23]。本研究中，ITP患者應(yīng)用地塞米松單藥或聯(lián)合rhTPO方案經(jīng)有效治療后CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞水平明顯恢復(fù)，而治療無效者該細(xì)胞水平無明顯變化，提示Breg細(xì)胞水平異常可能參與ITP患者的疾病發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)ITP患者體內(nèi)CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞及CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞水平較對(duì)照組明顯下降，經(jīng)有效治療后兩者細(xì)胞水平顯著升高，治療無效時(shí)則無明顯變化，提示Treg細(xì)胞及Breg細(xì)胞可能參與ITP的發(fā)生和發(fā)展。其可能機(jī)制是患者體內(nèi)Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞水平的減少無法有效抑制免疫作用，使細(xì)胞免疫抑制功能出現(xiàn)缺陷，并導(dǎo)致各種細(xì)胞因子分泌下降，打破自身免疫平衡，最終引起自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B細(xì)胞激活增多，導(dǎo)致PLT大量破壞。而經(jīng)過免疫抑制和(或)促PLT生成藥物治療后，患者Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞水平升高，免疫功能恢復(fù)，PLT水平升高，提示Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞在ITP的發(fā)生、發(fā)展中均起到重要作用，是ITP治療的兩個(gè)潛在生物靶點(diǎn)，如能及時(shí)有效地提高Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞水平并改善其功能，糾正機(jī)體免疫功能紊亂狀態(tài)，可作為ITP的一個(gè)新的治療方法。