蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究進(jìn)展

王英鵬，楊曉峰

1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000

2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，太原 030000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)第二大惡性腫瘤和第二常見致死原因[1]。根據(jù)臨床病理特征，可將膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）及肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），其中，MIBC是膀胱癌患者腫瘤特異性死亡的主要原因[2-3]。雖然NMIBC患者的生存率比MIBC高，但30%～50%的NMIBC患者都會復(fù)發(fā)，10%～20%的復(fù)發(fā)將進(jìn)展為MIBC[4]。因此，尋找新的有效標(biāo)志物來預(yù)測膀胱癌的治療效果和預(yù)后具有重要的臨床意義。蛋白質(zhì)比基因和RNA轉(zhuǎn)錄物能更好地反映細(xì)胞行為，蛋白質(zhì)分子功能的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有著密不可分的關(guān)系。因此，對人膀胱癌組織樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析成為尋找生物標(biāo)志物的一種可行方法。尋找有效可用的生物標(biāo)志物，不僅要發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，更要探索該標(biāo)志物在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制，才能更好地去指導(dǎo)臨床?，F(xiàn)結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 凝溶膠樣加帽蛋白（capping actin protein，gelsolin like；CAPG）

CAPG是凝溶膠蛋白/絨毛蛋白家族的成員，它與肌動蛋白結(jié)合，并以鈣依賴的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)。已經(jīng)確定，細(xì)胞質(zhì)中的CAPG影響細(xì)胞運動。在正常情況下，推測CAPG對細(xì)胞具有冗余效應(yīng)，該蛋白的失活僅顯示細(xì)胞功能的輕微缺陷。在病理條件下，CAPG通過調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的周轉(zhuǎn)來控制細(xì)胞侵襲[5]。

1.1 CAPG與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系

目前，關(guān)于CAPG與腫瘤臨床療效及預(yù)后關(guān)系的報道逐漸增多，在許多其他腫瘤領(lǐng)域，肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白被認(rèn)為是潛在靶點，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CAPG的表達(dá)水平與人膠質(zhì)細(xì)胞瘤[6]、肝細(xì)胞肝癌[7]等腫瘤的遷移性和侵襲性呈正相關(guān)，高CAPG表達(dá)預(yù)示著腫瘤患者的不良預(yù)后。然而關(guān)于CAPG在膀胱癌中的臨床意義及與預(yù)后關(guān)系的報道還很少。一項包括113例患者的研究表明，膀胱癌及癌旁組織中CAPG表達(dá)水平明顯高于正常膀胱組織，且CAPG蛋白和CAPGmRNA高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、腫瘤分級和無復(fù)發(fā)生存期顯著相關(guān)[8]。而Lyu等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，CAPG過表達(dá)與T分期及M分期無關(guān)，但與家族史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分級相關(guān)，這可能與兩項研究采用的蛋白質(zhì)分析方法不一樣相關(guān)?；谶@兩項研究及以下CAPG在膀胱癌中的作用機制，可以相信CAPG不僅是潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，也可作為治療膀胱癌的可能靶點。

1.2 CAPG高表達(dá)抑制Hippo信號通路

Hippo信號通路是一種高度保守的發(fā)育通路，其核心是由哺乳動物Hippo同系物巨噬細(xì)胞刺激蛋白1/2（macrophage stimulating 1/2，MST1/2）和大腫瘤抑制基因1/2（large tumor suppressor 1/2，LATS1/2）組成的激酶級聯(lián)反應(yīng)，在限制器官大小、腫瘤抑制、組織再生和干細(xì)胞自我更新方面發(fā)揮著重要作用[10]。Lyu等[9]首次在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)CAPG過表達(dá)使Hippo信號通路核心組分LATS1和其共激活因子單極紡錘體-結(jié)合蛋白1（mps one binder kinase activator protein 1，MOB1）去磷酸化，導(dǎo)致Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失活，進(jìn)一步引起Hippo信號通路下游效應(yīng)物Yes-相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）磷酸化降低，YAP移位入核并起到轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用。另一方面，移位入核的YAP可與轉(zhuǎn)錄增強相關(guān)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（TEA do-main transcription factor，TEAD）結(jié)合并激活致癌基因，從而引起膀胱癌。同時發(fā)現(xiàn)YAP抑制劑維替泊芬可抑制體內(nèi)的YAP移位入核，抑制腫瘤生長。然而目前調(diào)節(jié)Hippo通路的上游信號在很大程度上是未知的。已經(jīng)表明的是，影響F-肌動蛋白細(xì)胞骨架的各種操作可以調(diào)節(jié)Hippo通路[11]。因此CAPG是否還可以通過F-肌動蛋白或其他因素抑制Hippo信號通路還需要進(jìn)一步探索。

1.3 CAPG誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是導(dǎo)致靜止上皮細(xì)胞獲得作為單細(xì)胞遷移和侵襲能力的重要過程，其在各種人類疾病，尤其是在腫瘤中具有關(guān)鍵作用[12-13]。Lyu等[9]在探索CAPG在膀胱癌中作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)，在CAPG高表達(dá)時，間充質(zhì)標(biāo)志物（波形蛋白和N-鈣黏蛋白）的表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)志物（E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白）的表達(dá)下調(diào)，并通過體內(nèi)及體外細(xì)胞系實驗證實了CAPG可作為EMT的誘導(dǎo)因子，增強膀胱癌的遷移及侵襲能力。這為CAPG作為潛在的膀胱癌預(yù)后生物標(biāo)志物提供了一定的證據(jù)。但該研究僅是發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，并未深入探究CAPG是通過何種途徑來誘導(dǎo)EMT。目前關(guān)于CAPG與膀胱癌臨床療效及預(yù)后關(guān)系的報道還很少，單獨或者聯(lián)合其他預(yù)后標(biāo)志物輔助臨床醫(yī)師做出正確的預(yù)后判斷還需大量且深入的研究來提供證據(jù)支持。

2 異質(zhì)核糖核蛋白 F（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F，hnRNP-F）

hnRNP-F屬于hnRNP家族的RNA結(jié)合蛋白，其功能涉及RNA代謝和基因表達(dá)調(diào)控的多個步驟，例如可變剪接、mRNA穩(wěn)定化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾[14]。hnRNP-F被證明在包括膀胱癌在內(nèi)的許多腫瘤中發(fā)揮致癌作用[15]。

2.1 hnRNP-F結(jié)合靶向爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白 2（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX 2）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖

TPX2是一種微管相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞周期并主要在G1/S期轉(zhuǎn)換的增殖細(xì)胞中表達(dá)[16-17]，并被證明可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1和p21的表達(dá)，在包括膀胱癌在內(nèi)的各種腫瘤中發(fā)現(xiàn)TPX2顯著異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。hnRNP-F和TPX2蛋白之間的關(guān)系由Li等[19]首次報道，指出TPX2是hnRNP-F介導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程所必需的。TPX2是hnRNP-F的下游靶標(biāo)，二者表達(dá)水平呈正相關(guān)且可物理結(jié)合。二者結(jié)合后使細(xì)胞周期相關(guān)蛋白D1表達(dá)增加和p21表達(dá)降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)換，加速腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。但該研究僅通過體外細(xì)胞系實驗證明了hnRNP-F在膀胱癌中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并未通過小鼠腫瘤模型來證明hnRNP-F在體內(nèi)膀胱癌中是否存在同樣的情況。但在接下來的一項研究中證實了hnRNP-F在體內(nèi)可加速腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[22]。

2.2 hnRNP-F調(diào)節(jié)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子 1（Snail 1）mRNA穩(wěn)定性，誘導(dǎo)EMT

Snail1是EMT轉(zhuǎn)錄激活因子的核心組分之一，在EMT過程中廣泛表達(dá)，是EMT的關(guān)鍵標(biāo)志物[20]。目前，人們普遍認(rèn)為Snail1是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過直接抑制E-鈣黏蛋白基因（一種維持上皮表型所必需的基因）來啟動EMT[21]。Li等[22]首次證實hnRNP-F高表達(dá)可誘導(dǎo)EMT。在包括103例患者的隊列研究中，利用免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）證明了hnRNP-F的高表達(dá)與膀胱癌患者高臨床T分期及預(yù)后不良有關(guān)，并建立了正交各向異性轉(zhuǎn)移裸鼠模型，表明hnRNP-F在體內(nèi)可加速腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，同時發(fā)現(xiàn)hnRNP-F與Snail1表達(dá)水平呈正相關(guān)，而其他EMT轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)水平與hnRNP-F無關(guān)。進(jìn)一步研究證實hnRNP-F與Snail1mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）結(jié)合顯著增加了Snail1mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)了Snail1蛋白的表達(dá)，Snail1蛋白觸發(fā)EMT，增強了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.3 hnRNP-F表達(dá)受磷脂酰肌醇- 3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI 3 K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）介導(dǎo)的叉頭框蛋白 O 1（forkhead box O 1，F(xiàn)OXO 1）磷酸化調(diào)節(jié)

在各種腫瘤中，活化的PI3K磷酸化并激活A(yù)KT，AKT在廣泛的細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和代謝[23-24]。FOXO1是PI3K/AKT下游的分子，可被磷酸化抑制[25]。研究表明，與非腫瘤性膀胱黏膜組織相比，膀胱癌組織中FOXO1表達(dá)降低，并且FOXO1與良好的預(yù)后相關(guān)，并被認(rèn)為是膀胱癌中的腫瘤抑制因子[26-28]。Li等[29]通過京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑分析發(fā)現(xiàn)，hnRNP-F與PI3K/AKT通路顯著相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)hnRNP-F是FOXO1的直接下游靶標(biāo)，二者表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。未磷酸化的FOXO1與hnRNP-FmRNA啟動子區(qū)域結(jié)合可顯著抑制hnRNP-F的表達(dá)，同時腫瘤細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。但是當(dāng)前的研究受到一些限制，首先，該研究結(jié)果是在人膀胱癌細(xì)胞系EJ和UMUC-3中進(jìn)行的實驗，需要通過體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步證實。其次，該研究未考慮遺傳多態(tài)性因素。因此并不能排除可能影響關(guān)聯(lián)的可能性。

3 DEAD盒解螺旋體31（DEAD-box helicase 31，DDX31）/突變型 p53（mutant p53，mutp53）/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路

DDX31是DEAD盒蛋白7（DEAD-box protein 7，DBP7）的人類同源物，其最初作為新的ATP依賴性RNA解旋酶在啤酒糖酵母基因組數(shù)據(jù)庫（BLAST）中被鑒定出來[30]。然而迄今為止，對DDX31的生物學(xué)功能還知之甚少。p53蛋白由抑癌基因腫瘤蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）編碼，TP53突變后，mutp53不僅失去了野生型p53（wild typep53，wtp53）的腫瘤抑制功能，而且還通過調(diào)節(jié)剩余的wtp53或獨立于wtp53獲得促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的功能[31]。

3.1 DDX31/mutp53與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系

Daizumoto等[32]對77例膀胱癌組織標(biāo)本進(jìn)行p53和DDX31的IHC分析，結(jié)果顯示，pT分期和病理分級與DDX31表達(dá)顯著相關(guān)，而與p53無關(guān)，并且DDX31和p53蛋白均高表達(dá)的膀胱癌患者預(yù)后明顯差于DDX31低表達(dá)且p53蛋白高表達(dá)的患者，在膀胱癌病例中，特別是MIBC，細(xì)胞質(zhì)中DDX31的高表達(dá)和p53的高表達(dá)對應(yīng)著顯著較差的預(yù)后。這些發(fā)現(xiàn)提示著DDX31和p53的組合可能是膀胱癌預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

3.2 DDX31與wtp53/mutp53相互作用

Daizumoto等[32]在不伴TP53突變的人膀胱癌SW780細(xì)胞系中觀察到，DDX31低表達(dá)較DDX31高表達(dá)有更高的凋亡特異性p53靶基因（p53upregulated modulator of apoptosis，PUMA）和EI24自噬相關(guān)跨膜蛋白（EI24 autophagy associated transmembrane protein，PIG8）的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。該團(tuán)隊并未探究其機制，但結(jié)合該團(tuán)隊之前在DDX31與腎細(xì)胞癌方面的研究[33]，DDX31可能是通過與核磷脂 1（nucleophosmin 1，NPM1）相互作用來穩(wěn)定wtp53蛋白水平，并且還直接與wtp53結(jié)合，從而抑制PUMA和EI24基因誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞凋亡。

紅細(xì)胞膜蛋白條帶4.1樣4B（erythrocyte membrane protein band 4.1 like 4B，EPB41L4B）在具有高遷移潛能的腫瘤細(xì)胞（如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤）中上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[34]。核DDX31、mutp53、Sp1轉(zhuǎn)錄因子（Sp1 transcription factor，SP1）形成復(fù)合物使mutp53獲得腫瘤促進(jìn)功能，結(jié)合并增強其靶基因EPB41L4B的表達(dá)，從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移。

3.3 DDX31、核仁素（nucleolin，NCL）和EGFR的三聯(lián)體調(diào)控EGFR/AKT信號通路

NCL是一種多功能穿梭蛋白，存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和某些類型的細(xì)胞表面，且DDX31、磷酸核仁素（p-NCL）和EGFR形成的三聯(lián)體與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[35]。EGFR/AKT信號通路的激活參與了膀胱癌細(xì)胞的侵襲行為[36]。Daizumoto等[32]在伴有TP53突變的人膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞系中觀察到，DDX31、p-NCL、EGFR形成三聯(lián)體，起到了穩(wěn)定EGFR的作用，從而促進(jìn)EGFR/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的EGF配體非依賴性組成激活，并導(dǎo)致伴有TP53突變的MIBC細(xì)胞進(jìn)展。并且該團(tuán)隊制備了DDX31肽，可明顯抑制DDX31-NCL復(fù)合物的形成，成功抑制了小鼠體內(nèi)腫瘤的生長?？梢奃DX31肽是治療晚期MIBC的一種有效藥物。

4 脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）

FTO是一種常見的N6-甲基腺嘌呤（m6A）去甲基化酶，F(xiàn)TO的高表達(dá)與肥胖關(guān)系密切[37]，而且已被證明在胃癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和膀胱癌中具有促癌活性[38-40]。

4.1 FTO與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系

Zhou等[41]對20例膀胱癌組織標(biāo)本進(jìn)行了IHC分析，指出在膀胱癌組織中FTO的表達(dá)水平較正常尿路上皮組織顯著提高，并鑒定了人膀胱癌細(xì)胞系（T24、5637）中的FTO高表達(dá)，同時指出FTO的表達(dá)與TNM分期相關(guān)且FTO高表達(dá)患者的T分期較高。Tao等[40]對144例膀胱癌組織標(biāo)本進(jìn)行IHC分析后也給出了相似意見，指出FTO高表達(dá)的膀胱癌患者的總體生存率降低，F(xiàn)TO蛋白表達(dá)與膀胱癌患者的吸煙情況、病理分期和pT分期顯著相關(guān)。但是Wen等[42]給出了不同意見，其分析了30例膀胱癌組織與正常對照組之間FTOmRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FTOmRNA在膀胱尿路上皮癌組織中顯著下調(diào)，蛋白質(zhì)印跡分析顯示與正常膀胱上皮細(xì)胞系相比，膀胱癌細(xì)胞系（5637、T24）中FTO表達(dá)降低，并且FTO在Ⅱ～Ⅳ期膀胱癌中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。這可能與標(biāo)本來源以及細(xì)胞培養(yǎng)基不同有關(guān)，相較前兩項研究的細(xì)胞培養(yǎng)基，后者在胎牛血清培養(yǎng)基中添加了1%青霉素和鏈霉素。

4.2 FTO通過FTO/miRNA-576/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 6（cyclin dependent kinase 6，CDK 6）通路以m 6 A依賴的方式促進(jìn)腫瘤增殖

RNA甲基化修飾占所有RNA修飾的60%以上，m6A是mRNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）水平上最常見的修飾之一。這種修飾的異常調(diào)節(jié)與許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[43]。Zhou等[39]通過體外細(xì)胞系實驗及小鼠腫瘤模型證實了FTO高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤組織的生長，而miRNA-576的高/低表達(dá)明顯逆轉(zhuǎn)了FTO低/高表達(dá)對細(xì)胞增殖和集落形成能力的影響，證明了二者存在直接關(guān)系。miRNA-576可與CDK6mRNA的3'-UTR結(jié)合位點結(jié)合，抑制CDK6的表達(dá)，而CDK6過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖并降低DNA修復(fù)能力[34]，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

4.3 FTO改變肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本 1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT 1）的m 6 A水平并促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展

MALAT1廣泛表達(dá)于人類正常組織，并在惡性腫瘤組織及血漿中出現(xiàn)異常表達(dá)，幾乎參與基因調(diào)控過程的各個層面。越來越多的研究表明，MALAT1在肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、宮頸癌、膀胱癌以及結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)量升高[44]，與惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、預(yù)后等密切相關(guān)。Tao等[40]首次闡述了FTO基于其去甲基化的能力減少MALAT1mRNA 5'-末端的m6A修飾，從而延長MALAT1mRNA的半衰期，促進(jìn)了膀胱癌進(jìn)展。并且當(dāng)抑制小鼠腫瘤中的FTO，可發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的生長明顯受到限制。同時發(fā)現(xiàn)了miRNA-384模擬物可抑制MALAT1的表達(dá)，明顯延長小鼠存活時間，但并未進(jìn)行miRNA-384在高表達(dá)狀態(tài)下是否仍存在相同結(jié)果的研究。

5 小結(jié)

近年來，關(guān)于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物與膀胱癌關(guān)系的研究日益增多，也證實了很多蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物與膀胱癌預(yù)后相關(guān)。但目前，臨床判斷膀胱癌患者的預(yù)后依然是根據(jù)腫瘤大小、TNM分期、病理學(xué)分級及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等來進(jìn)行粗略預(yù)測，尚未開始大規(guī)模應(yīng)用生物標(biāo)志物來判斷患者的預(yù)后，其原因可能是因為膀胱癌異質(zhì)性較強。綜上所述，可以看到膀胱癌組織中的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物可以存在多種不同作用機制，同時，一種生物標(biāo)志物可以存在多種不同的作用機制，這可能是利用生物標(biāo)志物判斷預(yù)后效果較差的原因之一。存在多種不同致癌路徑也可能與腫瘤異質(zhì)性相關(guān)。隨著分子生物學(xué)及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，會對了解蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在膀胱癌中的作用及改善患者預(yù)后提供極大幫助。