基于因子分析的不同楸樹無性系耐銻綜合評價

劉振華，王軍輝，童方平，孫 良，李 貴，陳 瑞，吳 敏，劉作群，麻文?。?/p>

(1.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，楸樹國家創(chuàng)新聯(lián)盟，北京 100091；2.湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004；3.瀏陽市瀏陽湖國有林場，湖南 瀏陽 410300；4.寧鄉(xiāng)市園林綠化維護中心，湖南 寧鄉(xiāng) 410600)

近年來，隨著工業(yè)廢棄物的排放和化肥等使用的不斷增多，重金屬污染已經(jīng)成為一個嚴重的環(huán)境問題，影響人類健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]。McCallum[2]研究表明，銻（Sb）和銻的化合物是一類具有潛在毒性的重金屬物質(zhì)，具有致癌作用。我國銻資源豐富，儲量和產(chǎn)量均為世界第一位，主要分布在湖南、廣西和貴州等南方省區(qū)[3-5]。由于長年的開采和冶煉造成當?shù)赝寥绹乐氐匿R污染，何孟常等[6]研究表明，位于湖南省的錫礦山銻礦區(qū)土壤中銻含量的最高濃度達5 045 mg·kg-1。因此，銻污染土壤的治理成為迫切需要解決的問題。植物修復具有綠色、成本低和適合大面積修復的特點，被廣泛應(yīng)用。目前，報道的銻礦區(qū)具有修復潛力的草本植物主要有芒（Miscanthus sinensisAnderss.）[7]、狗牙根（Cynodon dactylon(L.) Pers.）、蜈蚣草（Eremochloa ciliarisL.）、長葉車前草（Plantago depressaL.）、大葉井口邊草（Pteris creticavar.nervosa）[8]；木本植物有臭椿（Ailanthus altissima(Mill.) Swingle）、構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera(Linn.) L'Hér.ex Vent.）、大葉黃楊（Buxus megistophyllaLevl.）和紫穗槐（Amorpha fruticosaLinn.）[9]，其中，高大喬木尤其是珍貴樹種較少，因此，尋求一種既具有修復作用，且經(jīng)濟價值高的樹種顯得尤為重要。楸樹（Catalpa bungeiC.A.Mey.）為中國特有的珍貴樹種，木材可用作高檔家具、地板、特種設(shè)備的材料[10-11]。楸樹也具有較強的耐污染能力，已有研究表明，楸樹對銻具有較好的吸收和轉(zhuǎn)運能力[12]。作為一個生長快且經(jīng)濟價值高的喬木樹種，其產(chǎn)品不會進入食物鏈，對人類健康沒有風險，因此，利用楸樹來修復銻污染土壤具有廣闊的前景。有報道證實，不同無性系植物對重金屬的累積和吸收具有差異[13-14]，如柳樹(Salixspp．)[15]、栓皮櫟（Quercus variabilisBl.）[16]。本研究旨在運用因子分析法對不同無性系楸樹耐銻能力進行綜合評價，以期選擇出較強耐銻能力的無性系，為銻污染土壤提供具有修復潛力的植物材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為中國林業(yè)科學研究院選育的10個楸樹優(yōu)良無性系，分別為8402、20-01、5-8、63、5-2、0、1、2-8、1-1和72。

1.2 試驗設(shè)計

試驗地點位于湖南省林業(yè)科學院龍伏科研基地（28°24′0″ N，113°29′35″ E），屬于亞熱帶季風濕潤氣候，年平均氣溫17.5 ℃，年平均降水量1467 mm，土壤為第四紀紅壤。參試無性系均為組培苗，移植成活后1個月選取長勢基本一致的幼苗進行銻脅迫試驗，培養(yǎng)基質(zhì)為當?shù)責o污染的紅壤，土壤pH值為4.8，土壤的化學元素背景值：銻1.94 mg·kg-1、全氮0.74 g·kg-1、全磷0.15 g·kg-1、全鉀11.3 g·kg-1、有機質(zhì)10.5 g·kg-1、有效磷0.51 mg·kg-1、速 效鉀39.2 mg·kg-1、水 解性氮63.7 mg·kg-1。2020年6月15日進行銻脅迫處理，采用土培盆栽的方法，塑料盆規(guī)格為30 cm×18 cm（直徑×高，盆底帶有5個約1 cm2的透水孔），土壤過2 mm塑料篩，每盆裝土5 kg。根據(jù)Li等[17]對湖南省婁底市冷水江銻礦區(qū)土壤重金屬銻檢測的含量（185.6～2081.3 mg·kg-1），設(shè)置4個處理濃度（以銻計）：0、600、1200、2000 mg·kg-1，采用澆灌的方式進行土壤脅迫處理。用酒石酸銻鉀（KSbC4H4O7·1/2H2O，分析純，國藥集團化學試劑有限公司）配置相應(yīng)的水溶液3L，在6月15日、6月18日、6月21日分3批次進行澆灌，每批次澆灌1 L,每次以溶液不滲透出盆底為準。試驗采取隨機區(qū)組設(shè)計，每個盆中栽植4株幼苗，3次重復，每個處理3盆，共12株。為保持與外界氣候條件一致性，盆栽植物置于僅具有遮雨功能的透光通風遮陰棚中，6月21日以后每隔3 d澆1次水，以保持土壤濕潤即可。

1.3 樣品采集與測定

培養(yǎng)90 d后，每個處理每盆中隨機選取1株，共3株，用去離子水沖洗3次，將根系等部位的泥土沖洗干凈，測定株高和地徑后按根、莖和葉三部分收獲，每個處理選取5 g鮮葉置于液氮中用于測定抗逆相關(guān)酶與非酶物質(zhì)；另選取5 g鮮葉置于干冰上用于測定葉綠素及石蠟切片；其余105 ℃烘箱中殺青30 min，然后80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，分別測定各處理根、莖和葉生物量。各處理的根、莖、葉分別用粉碎機粉碎，過100目篩備用。

1.3.1 銻含量測定 稱取0.5 g各部位烘干樣品置于微波消解儀（CEM Mars6）中加入10 mL濃硝酸進行硝化，硝化完定容至50 mL，采用ICPMS（Thermo ICAP7000）測定各部分銻含量。

1.3.2 葉綠素含量測定 采用丙酮乙醇浸提法[18]測定葉片中葉綠素含量。

1.3.3 生理生化指標測定 過氧化氫（H2O2）含量、超氧陰離子（O2-·）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、還原型谷胱甘肽（GSH）活性、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性選用Solarbio公司試劑盒測定。

1.3.4 柵欄組織/海綿組織 采用石蠟切片法，用FAA固定48 h-脫水-透明-包埋-切片-番紅、固綠染色-中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察拍照測量。

1.4 統(tǒng)計分析方法

所有試驗結(jié)果都以3個重復的均值±標準誤表示，每個重復有3株。數(shù)據(jù)分析采用Spss 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(ANOVA),因子分析參照張連金等[19]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 銻脅迫對不同無性系楸樹生長的影響

圖1、2表明：隨銻濃度的增加，大部分無性系株高、地徑增長量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。方差分析表明：不同濃度銻脅迫下，8402、63、1無性系的株高增長量差異不顯著，5-8、5-2、0、2-8、72無性系的地徑增長量差異不顯著，其他均存在差異。0 mg·kg-1銻脅迫下，株高和地徑增長最大的分別為5-2和0無性系，最小的分別為8402和20-01；600 mg·kg-1銻脅迫下，株高和地徑增長最大的均為20-01，最小的分別為8402和72；1200 mg·kg-1銻脅迫下，株高和地徑增長最大的分別為72和63無性系，最小的分別為1-1和8402；2000 mg·kg-1銻脅迫下，株高和地徑增長最大的分別為72和5-2無性系，最小的分別為1-1和8402無性系。

圖1 銻脅迫下不同無性系株高增長量Fig.1 Effects of Sb concentration on height increment of Catalpa bungei.

圖2 銻脅迫下不同無性系地徑增長量Fig.2 Effects of Sb concentration on ground diameter increment of Catalpa bungei.

2.2 銻對不同無性系楸樹生物量的影響

由表1可知：不同脅迫處理下，除8402無性系根生物量差異不顯著外，其余無性系地上部分和根生物量在不同銻濃度間存在差異；2000 mg·kg-1銻脅迫下，除8402和72無性系，根生物量比對照高外，其余無性系根生物量均小于對照。5-2和63無性系地上生物量隨脅迫濃度升高逐漸降低，2-8無性系地上生物量隨脅迫濃度升高先降低再升高后降低，其它無性系在銻脅迫未超過600 mg·kg-1促進了地上生物量的增加，超過1200 mg·kg-1生物量逐漸減少。600 mg·kg-1銻脅迫下，根和地上生物量最大的均為5-8，最小的分別為20-01和72；1200 mg·kg-1銻脅迫下，根和地上生物量最大的分別為5-8和2-8，最小的均為1-1；2000 mg·kg-1銻脅迫下，根和地上生物量最大的分別為8402和5-8，最小的均為1-1。

表1 銻脅迫下不同無性系楸樹生物量Table 1 The biomass of different clones of Catalpa bungei under Antimony stress

2.3 銻脅迫下不同無性系楸樹各器官銻含量

由表2可知：銻主要積累在楸樹的根部，600 mg·kg-1銻脅迫下，63無性系根、葉中的銻含量最高，8402無性系莖中的銻含量最高；1200 mg·kg-1銻脅迫下，5-2無性系根中的銻含量最高，1-1無性系莖和葉中的銻含量均最高；2000 mg·kg-1銻脅迫下，5-8無性系根中的銻含量最高，8402無性系莖中的銻含量最高，72無性系葉中的銻含量最高。

表2 銻脅迫下不同無性系楸樹各器官中銻含量Table 2 Antimony content in organs of different clones of Catalpa bungei under Antimony stress mg·kg-1

2.4 銻對不同無性系楸樹葉綠素含量的影響

由圖3可知：隨銻脅迫濃度的增加，8402、2-8、1-1和72無性系的葉綠素含量呈下降趨勢，20-01和63無性系葉綠素含量呈下降-上升-再下降趨，5-8、5-2和0無性系葉綠素含量呈先上升后下降的趨勢，1無性系葉綠素含量呈先上升后下降再上升趨勢。在銻脅迫下，5-2和1無性系葉片的葉綠素含量均大于對照，5-8無性系在600、1200 mg·kg-1銻脅迫下，葉綠素含量均大于對照，2000 mg·kg-1銻脅迫下，葉綠素含量小于對照，20-01在銻脅迫濃度2000 mg·kg-1時，葉綠素含量與對照相當。

圖3 銻脅迫下不同無性系楸樹葉綠素含量Fig.3 Chlorophyll content of different clones of Catalpa bungei under Antimony stress

2.5 銻脅迫下不同無性系楸樹葉中氧化物質(zhì)含量和抗氧化物酶活性

表3表明：隨銻脅迫濃度的增加，各無性系體內(nèi)的O2-·產(chǎn)生速率逐漸增大；600 mg·kg-1銻脅迫下，20-01無性系的O2-·產(chǎn)生速率最大，8402無性系的最小；1200 mg·kg-1銻脅迫下，72無性系的O2-·產(chǎn)生速率最大，8402無性系的最??；2000 mg·kg-1銻脅迫下，2-8無性系的O2-·產(chǎn)生速率最大，5-8無性系的最小。各無性系體內(nèi)的H2O2含量，600 mg·kg-1銻脅迫下，5-8無性系的最大，20-01無性系的最小；1200 mg·kg-1銻脅迫下，20-01無性系的最大，0無性系的最小；2000 mg·kg-1銻脅迫下，20-01無性系的最大，5-8無性系的最小。

表3 銻脅迫下不同無性系楸樹葉中氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性Table 3 Contents of oxidants substances and activity of antioxidant enzymes in leaves of different clones of Catalpa bungei under Antimony stress

在銻脅迫濃度小于2000 mg·kg-1時，各無性系體內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）活性隨銻脅迫濃度的升高而升高，在銻脅迫濃度2000 mg·kg-1時，除63和2-8無性系外，其它無性系葉片中的GSH活性均降低，這可能是銻濃度過高，GSH的合成受到了影響。H2O2等活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生誘導了過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶（CAT）活性的增加，而增加的酶活性用以清除大量產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)。在銻脅迫濃度小于2000 mg·kg-1時，各無性系體內(nèi)的APX活性隨銻脅迫濃度的增加而升高；在2000 mg·kg-1銻脅迫濃度時，APX活性比1200 mg·kg-1脅迫時低。POD活性和APX活性具有相似的變化趨勢，CAT活性隨銻脅迫濃度的增加而升高。

2.6 銻對不同無性系楸樹葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

圖4表明：10個無性系楸樹柵海比均隨銻脅迫濃度的增加呈先升后降的趨勢。600 mg·kg-1銻脅迫下，所有無性系的柵海比均比對照的高；1200 mg·kg-1銻脅迫下，除0和72無性系的柵海比均比對照低外，其余無性系的柵海比均比對照的高；2000 mg·kg-1銻脅迫下，除5-2無性系的柵海比比對照高外，其余無性系的均比對照的低。

圖4 銻脅迫下不同無性系楸樹柵海比Fig.4 Palisade tissue/spongy tissue of different clones of Catalpa bungei under antimony stress

2.7 基于因子分析的楸樹不同無性系耐銻綜合評價

對15個因素作KMO和Bartlett，判斷是否適合做因子分析。當KMO統(tǒng)計量＞0.5，說明可利用因子分析方法進行分析。本研究的效度分析中，KMO值為0.649＞0.5，P值為0.000，遠小于顯著性水平。因此，所選用的變量適合做因子分析。通過因子分析共提取了4個特征值大于1的因子，其特征值分別為4.981、2.341、1.920、1.127，其方差累積貢獻率為69.132%。因此，這4個因子包含了指標體系中的絕大部分信息，說明將這

4個因子作為綜合變量來評價不同無性系楸樹耐銻能力是可行的。以各公因子方差貢獻率占累計方差貢獻率的權(quán)重作為系數(shù)，分別乘以因子的得分數(shù)（C），從而獲得一個楸樹不同無性系耐銻綜合評價得分模型：

通過因子分析可知：10個楸樹無性系在銻脅迫下的平均得分情況見表4。在0～2 000 mg·kg-1銻脅迫下，10個楸樹無性系耐銻能力綜合評價為5-8＞0＞20-01＞2-8＞5-2＞63＞8402＞1＞72＞1-1。

表4 楸樹不同無性系耐銻綜合評價得分表Table 4 Comprehensive Evaluation score table of Antimony tolerance of different clones of Catalpa bungei

3 討論

重金屬通過植物根系吸收后轉(zhuǎn)運至地上部分對植物產(chǎn)生毒害作用[20]，地上生物量大可以降低植物單位面積中重金屬的含量，從而降低重金屬對植物的毒害作用。本研究中，除8402無性系根生物量差異不顯著外，其余無性系地上和根生物量在不同銻濃度間存在差異，這說明不同無性系對重金屬的響應(yīng)有差異，這與施翔等[16]和Yang等[21]的研究結(jié)果相似。所有處理的地上生物量均大于根生物量，地上部分分散了銻的積累，這可能是楸樹耐銻的一個原因。植物葉片中葉綠素含量是衡量植物耐重金屬的重要生理指標，植物遭受重金屬毒害會導致葉片中葉綠素含量降低，進而抑制光合作用導致生物量降低。有研究表明，銻破壞了植物光合系統(tǒng)（葉綠體、酶系統(tǒng)等）[22]。芥菜（Brassica juncea(Linnaeus) Czernajew）和玉米（Zea maysL.）進行高濃度銻處理，芥菜的葉片變黃，玉米的葉綠素合成受阻[4]。本研究結(jié)果表明，10個無性系楸樹葉綠素含量在銻脅迫下影響不大，有的處理甚至出現(xiàn)葉綠素含量有所提高，說明在銻濃度2000 mg·kg-1以下銻脅迫對楸樹無性系的葉綠素合成影響較小，這與上述研究結(jié)果不一致，銻脅迫尚未破壞葉綠體膜結(jié)構(gòu)，沒有造成葉綠體不可逆損傷[23]，更高濃度的銻脅迫對楸樹葉綠素合成的影響還需要進一步研究。

本研究中，不同無性系楸樹體內(nèi)銻含量主要集中在根部，向地上部分轉(zhuǎn)運少，這一結(jié)果與水稻（Oryza sativaL.）[24]、構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera(Linnaeus) L'Heritier ex Ventenat）、臭椿、大葉黃楊和紫穗槐[9]等銻脅迫下的研究結(jié)果相似。已有研究表明，重金屬可以通過抑制養(yǎng)分吸收和細胞分裂等來抑制根系的生長，耐性強的植物或者無性系表現(xiàn)出根的生物量大[25]。參試楸樹無性系根中富集銻最多的為5-8無性系，在2 000 mg·kg-1銻脅迫下，銻含量為5799 mg·kg-1；莖中銻含量最高的為無性系1-1，在1200 mg·kg-1銻脅迫下，銻含量為386 mg·kg-1；葉片中銻含量最高的為無性系72，在2000 mg·kg-1銻脅迫下，銻含量為165 mg·kg-1。有研究表明，大葉黃楊地上部分最高銻含量為35.37 mg·kg-1，根中含量最高為85.6 mg·kg-1；構(gòu)樹地上部分銻含量最高為108.33 mg·kg-1，根中含量最高為196.53 mg·kg-1；紫穗槐地上部分銻含量最高為55.97 mg·kg-1，根中含量最高為418.27 mg·kg-1[9]；而狗牙根根中銻含量為2209.3 mg·kg-1，芒根中銻含量為177.29 mg·kg-1，地上部分銻含量最高為75.81 mg·kg-1，苧麻（Boehmeria nivea(L.) Gaudich.）地上部分銻含量為748.7 mg·kg-1[4]。本研究中，楸樹根內(nèi)銻含量遠高于目前已經(jīng)報道植物根銻的含量，莖與葉片中銻的含量也高于大部分已報道植物地上部分銻的含量，楸樹具有生長快、生物量大的特點，即使沒有達到超富集植物的標準，但是地上部分較大的生物量也能夠吸收較多的銻。楸樹萌芽能力強，也可以通過收獲地上部分生物量，讓其萌發(fā)新的地上部分，再轉(zhuǎn)運根系中吸收的銻，通過多次采集地上部分，減少因為根系的分解，銻重新回到土壤的風險。楸樹生物量大、生長快、觀賞價值高、耐銻能力強和具有較高的經(jīng)濟價值，利用轉(zhuǎn)運系數(shù)較高的楸樹無性系對銻污染土壤修復具有重要的現(xiàn)實意義。

植物在正常生活條件下，體內(nèi)的自由基等氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和消除處于平衡，并且含量很低，不會對植物生長造成影響。一旦植物處于逆境條件下，細胞內(nèi)的自由基等氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和消除打破平衡，氧化物質(zhì)積累過多就會影響植物生長發(fā)育。本研究結(jié)果表明，在逆境條件下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的超氧陰離子和H2O2，隨著脅迫濃度的增加，各個無性系體內(nèi)的O2-·產(chǎn)生速率逐漸增大，在一定脅迫壓力內(nèi)抗氧化酶（CAT、POD、APX）活性和植物體內(nèi)的非酶抗氧化物質(zhì)（GSH）的濃度呈正相關(guān)性，這與李聰?shù)萚26]的研究結(jié)果相似。這說明抗氧化酶活性增強和非酶抗氧化物質(zhì)GSH含量的增加是楸樹耐銻的一個重要原因。

4 結(jié)論

在不同銻濃度脅迫下，大部分無性系隨著銻脅迫濃度的升高，株高增長量和地徑增長量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢；除8402和72無性系，在2000 mg·kg-1銻脅迫下根生物量比對照高外，其它無性系在較低濃度銻脅迫下促進了生物量增加，到了一定濃度隨著銻濃度的增加，生物量逐漸減少。

銻主要積累在楸樹的根部，在不同濃度銻脅迫下，各無性系各器官中銻濃度和耐銻能力具有差異。因子分析結(jié)果表明：在0～2000 mg·kg-1銻脅迫下，10個楸樹無性系耐銻能力綜合評價為5-8＞0＞20-01＞2-8＞5-2＞63＞8402＞1＞72＞1-1。但 受條件和材料的限制，筆者僅對苗期的不同無性系楸樹進行了分析評價，還需要后期的試驗進行驗證和篩選，以獲得適應(yīng)性較強的耐銻楸樹品種，提高銻污染土壤的修復效果。植物修復是一種具有綠色、成本低和相對安全的重金屬污染土壤修復技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。