FBXO22在急性髓系白血病中的表達(dá)分析

吳冬會，楊艷麗，周黎黎，馬 麗，汪 晶，程 陽，徐旺旺，李玉云

急性髓系白血病(AML)為骨髓造血細(xì)胞惡性增殖疾病，主要表現(xiàn)為造血系統(tǒng)異常，包括白細(xì)胞異常、不同程度貧血、凝血功能障礙，還伴有發(fā)熱和肝脾淋巴結(jié)腫大，以造血細(xì)胞分化障礙和造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞無限增殖為主要發(fā)病機(jī)制，如不及時(shí)治療,可導(dǎo)致病人迅速骨髓衰竭并最終死亡。AML是成人最常見的白血病類型，隨著科學(xué)研究的不斷深入，AML的治療手段也更加多樣化，多種治療手段相互補(bǔ)充，使AML的治療水平得到很大提升，但仍然存在不良反應(yīng)大、微小殘留細(xì)胞白血病難以根治等難題[1]，仍需繼續(xù)深入探討AML的發(fā)病機(jī)制，為AML的診療提供新的思路。FBXO22已被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是其在AML病人體內(nèi)的表達(dá)情況和臨床作用尚未被闡明。本研究探討AML病人骨髓細(xì)胞中FBXO22 mRNA表達(dá)情況及其與病人臨床指征的相關(guān)關(guān)系?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年5-12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的AML病人92例。AML病人篩選和分組標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第四版[2]，排除由骨髓增生異常綜合征和骨髓增殖性腫瘤轉(zhuǎn)化的AML。所有研究對象均知情同意。其中初發(fā)組41例，男25例，女16例，年齡19～85歲；完全緩解(CR)組28 例，男18例，女10例，年齡15～71歲；部分緩解(PR)組23例，男14例，女9例，年齡25～77歲。另選取同期腎性貧血、缺鐵性貧血病人30例作為對照組，男17例，女13例，年齡28～84歲。各組年齡、性別等一般資料均具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 Ficoll試劑購自索萊寶公司(北京)，Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher公司(美國)，PCR引物由金斯瑞公司合成(南京)，SYBR Premix Dimer Eraser 購自Takara 公司(日本)，全自血液動(dòng)分析儀購自希森美康公司(日本)，熒光定量PCR儀購自ABI公司(美國)。

1.2.2 骨髓中單個(gè)核細(xì)胞提取 采集各組病人骨髓血2～4 mL，加入等量PBS洗液混勻，按3∶2延管壁緩緩加入Ficoll試劑，離心，吸取中間白膜層，為單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2次，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定FBXO22 mRNA相對表達(dá)量 用Trizol試劑分離細(xì)胞總RNA，檢測其濃度和純度。RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再進(jìn)行定量PCR試驗(yàn)，每個(gè)樣本平行測定3次。引物序列為GAPDH(F：5′-GGA AGC TTG TCA TCA AT GGA AAT C-3′;R:5′-TGA TGA CCC TTT TGG CTC CC -3′)，F(xiàn)BXO22(F:5′-CGG AGC ACC TTC GTG TTG A-3′;R:5′-CAC ACA CTC CCT CCA TAA GCG-3′)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT表示，所得結(jié)果表示FBXO22 mRNA相對于內(nèi)參基因的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析、q檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組病人FBXO22 mRNA相對表達(dá)量比較 各組FBXO22 mRNA表達(dá)水平間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中PR組和初發(fā)組均低于對照組和CR組(P<0.05)，而對照組和CR組、PR組和初發(fā)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組病人FBXO22 mRNA相對表達(dá)量比較

表2 不同臨床指標(biāo)的初發(fā)組病人FBXO22 mRNA相對表達(dá)量比較

2.2 不同臨床指標(biāo)的初發(fā)組病人FBXO22 mRNA相對表達(dá)量比較 不同性別、年齡、貧血程度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、臨床分型的初發(fā)組病人FBXO22 mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而不同血小板計(jì)數(shù)病人的FBXO22 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。相關(guān)分析顯示，初發(fā)組病人血小板計(jì)數(shù)與FBXO22 mRNA相對表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.492，P<0.01)。

3 討論

AML是由粒系造血細(xì)胞發(fā)生不同階段分化障礙、凋亡受阻以及惡性克隆性增殖而引起的，主要發(fā)病機(jī)制有融合基因發(fā)生、信號通路異常、造血細(xì)胞畸變、造血微環(huán)境改變，近年新興治療藥物和治療手段不斷發(fā)展，大部分病人病情可得到改善，30.0%～50.0%病人可以痊愈，但仍有約30.0%病人存在臨床預(yù)后較差，生存期較短，大多只有3～6個(gè)月[3]。

蛋白酶體降解系統(tǒng)是各種真核生物體內(nèi)機(jī)體降解蛋白質(zhì)重要機(jī)制之一[4-5]。泛素-蛋白酶體降解途徑已被證實(shí)參與多種腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展，但其在AML發(fā)病過程中所起的作用較少被探討，其主要由三個(gè)關(guān)鍵酶和26s蛋白酶體參與完成[6]。其中泛素蛋白酶體中的一個(gè)關(guān)鍵酶——泛素連接酶，能夠識別并降解特定蛋白質(zhì)，F(xiàn)BXO22蛋白屬于F-box蛋白家族，它與接頭蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin、RING鋅指蛋白組成泛素連接酶，識別指定目標(biāo)蛋白質(zhì)，泛素化的蛋白質(zhì)再通過與26s蛋白酶體，達(dá)到靶向介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的作用。

本研究采qRT-PCR法檢測AML病人和對照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中FBXO22 mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)PR組和初發(fā)組均低于對照組和CR組，而對照組和CR組、PR組和初發(fā)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還分析了初發(fā)組病人FBXO22 mRNA相對表達(dá)量與相關(guān)臨床指征關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)BXO22 mRNA相對表達(dá)量與血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。FBXO22被證實(shí)與多種調(diào)控因子組成信號通路，調(diào)控細(xì)胞各種生命活動(dòng)，其上游調(diào)控因子有miR-155、p53、TP53和miR-433-3p，下游控制靶點(diǎn)包括KDM4A、 KDM4B、 Methylated p53、p21、 KLF4、 LKB1、CD147、Bach1、PTEN、Snail、HDM2、PHLPP1、TFEB。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO22在不同系統(tǒng)、組織、器官內(nèi)參與疾病進(jìn)程，主要有腫瘤發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移[7-16]，調(diào)控細(xì)胞生命周期[17]，動(dòng)態(tài)監(jiān)測神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療效果[18]，參與細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)[19]，逆轉(zhuǎn)腫瘤靶細(xì)胞的耐藥性[20]等。在消化道腫瘤、肺癌、骨肉瘤、卵巢癌中，高表達(dá)的FBXO22發(fā)揮促腫瘤作用，包括導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，加速腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤向其他組織侵襲、轉(zhuǎn)移等，但是在腎細(xì)胞癌中FBXO22卻發(fā)揮截然相反的作用，低表達(dá)的FBXO22與腎細(xì)胞腫瘤直徑、TMN分期以及較差的預(yù)后和無病生存期相關(guān)，且FBXO22可以抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外FBXO22還可不通過蛋白酶體降解途徑，直接與絲氨酸消旋酶結(jié)合，影響其亞細(xì)胞定位，從而促進(jìn)D-絲氨酸合成[21]。對于兒童AML，姜艷紅等[22]證實(shí)血小板不減低對初發(fā)兒童AML的治療起保護(hù)作用并且預(yù)后良好。對于成人AML，有研究[23]發(fā)現(xiàn)AML治療后血小板升高是提示腫瘤細(xì)胞解除抑制正常造血重要指征，是觀察治療效果的重要因素。向丹等[24]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血小板動(dòng)態(tài)監(jiān)測在白血病的治療和良好預(yù)后發(fā)揮一定作用，且化療后血小板增多是AML治療取得預(yù)后良好的重要標(biāo)志。

綜上，AML病人骨髓細(xì)胞FBXO22基因表達(dá)水平降低，且其表達(dá)與外周血血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，而FBXO22如何在分子水平調(diào)控AML的發(fā)生發(fā)展，以及FBXO22如何調(diào)控血小板的生成，仍需進(jìn)一步研究探討。