miRNA-5585-5p靶向調(diào)控多聚免疫球蛋白受體在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

梅 帥,裴文浩,吳 倩，黃 馳，李怡彤，許培海,劉俊濤,丁勇興

乳腺癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率逐年上升，已位居女性癌癥首位；也是全球癌癥發(fā)病的主要原因之一，占所有癌癥病人的11.7%，每年死亡人數(shù)為68.5萬人，死亡率高達(dá)6.9%，是全球第五大癌癥死亡原因[1]。根據(jù)病人的激素受體及人上皮生長因子受體2(HER-2)表達(dá)情況，可將乳腺癌分為4種分子亞型[2]，分子亞型與乳腺癌的治療和預(yù)后密切相關(guān)，探索乳腺癌預(yù)后相關(guān)因素有利于早期診斷和靶向治療。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度在19～25個核苷酸的非編碼RNA，其可以通過和靶基因mRNA的堿基配對，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，miR-5585-5p可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，多聚免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)在癌癥組織中表達(dá)較癌旁組織降低，且與miR-5585-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。本研究旨在進(jìn)一步分析乳腺癌組織中miR-5585-5p和pIgR的差異表達(dá)情況，并分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 臨床病理標(biāo)本選自2020年1-12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院甲乳外科及中德乳腺科手術(shù)治療的44例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌BRCR石蠟包埋組織(BRCR組)，另選取同期5例非癌癥病人的正常乳腺組織標(biāo)本作為對照組(NCT組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：病人手術(shù)前無長期服用非甾體類抗炎藥物史；無其他惡性腫瘤病史；其中乳腺癌病人術(shù)前檢查時未發(fā)現(xiàn)明顯的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且手術(shù)前、手術(shù)中均未進(jìn)行內(nèi)分泌或放化療治療等。觀察組病人均為女性，年齡35～55歲。由2位病理醫(yī)生對所有標(biāo)本的病理結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，其中組織學(xué)分級Ⅰ～Ⅱ級22例，Ⅲ期22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥3個16例；病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌。對照組病人均為女性，年齡37～54歲。2組性別、年齡均具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測BRCR及NCT中pIgR表達(dá)情況 將石蠟包埋的乳腺組織塊做4 μm厚連續(xù)石蠟切片，脫蠟至水化，滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 洗3遍；修復(fù)抗原，37 ℃ 濕盒中孵育一抗2 h，PBS洗3遍；37 ℃濕盒中孵育二抗1 h，PBS洗3遍；DAB顯色；顯微鏡下觀察拍照。pIgR免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)，不著色或著色陽性的細(xì)胞數(shù)≤10%計(jì)0分，>10%為陽性，其中著色弱且不連續(xù)計(jì)1分，著色中等或部分不連續(xù)計(jì)2分，著色強(qiáng)且連續(xù)計(jì)3分。將0分、1分判定為PIGR低表達(dá)；2分、3分判定為PIGR高表達(dá)。

1.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測miR-5585-5p對pIgR調(diào)控作用

1.3.1 材料與試劑 Trizol試劑(Invitrogen公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC)采購于Sigma公司；qRT-PCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Genecopoeia 公司)； DEPC(Sigma公司)；兔抗人PIGR一抗(proteintech公司)。人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3采購于中國科學(xué)院細(xì)胞研究所；新生胎牛血清采購于LONSA公司；DMEM培養(yǎng)基采購于Gibco公司；has-miR-5585-5p mimics采購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) SKBR-3細(xì)胞使用含10%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞密度生長至70%左右時分瓶傳代或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞鋪板 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，1 000 g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔10萬個細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的SKBR-3細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)50%～60%時，設(shè)空白對照組與實(shí)驗(yàn)組，其中空白對照組加入2 mL無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔加入500 μL轉(zhuǎn)染試劑(A液為250 μL Opti-MEM+5 μL Lipofectamine 2000，B液為250 μL Opti-MEM+5 μL miR-5585-5p mimics，has-miR-5585-5p mimics序列：UGA AGU ACC AGC UAC UCG AGA G，將A、B液混合均勻后靜置一段時間即可)和1.5 mL無血清培養(yǎng)基，輕輕搖晃均勻后移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 RNA提取 利用胰酶消化細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清液，加入1 mL Trizol(裂解液)重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打，充分混勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL無酶Ep管中，冰上靜置10 min；加入0.2 mL三氯甲烷劇烈振蕩15 s成乳狀，冰上放置5 min；冷凍離心機(jī)12 000 g、4 ℃離心15 min；吸取上清液至新的1.5 mL無酶Ep管中，以槍頭不吸到中層的情況下盡量多吸，加入與上清液相同體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置15 min，每隔5 min混勻一次；冷凍離心機(jī)12 000 g、4 ℃ 離心10 min，棄上清液，倒扣干凈；加入1 mL 75%乙醇，洗滌RNA，旋渦震蕩均勻；冷凍離心機(jī) 7 600 g、4 ℃離心5 min，棄上清液，加入適量DEPC水，充分溶解RNA，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.6 qRT-PCR 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將上述提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用SYBR熒光染料法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，所用引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。獲得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析miR-5585-5p對pIgR調(diào)控作用 利用TargetScanHuman7.2 miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫，檢索pIgR是否與miR-5585-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫，分析pIgR在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的差異表達(dá)，并進(jìn)行生存分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和四格表確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析miR-5585-5p與pIgR潛在結(jié)合位點(diǎn) 利用TargetScanHuman7.2數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，miR-5585-5p與pIgR存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖1)，表明pIgR可能為miR-5585-5p的潛在靶基因之一。

2.2 miR-5585-5p下調(diào)pIgR表達(dá) 為進(jìn)一步證實(shí)miR-5585-5p對pIgR表達(dá)的調(diào)控，以miR-5585-5p類似物轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞SKBR-3，利用qRT-PCR檢測pIgR mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組pIgR表達(dá)明顯低于空白對照組(P<0.01)(見表2)。

表2miR-5585-5p對乳腺癌細(xì)胞SKBR-3中pIgR表達(dá)的影響

2.3 生物信息學(xué)分析乳腺癌組織中pIgR表達(dá)及臨床意義 為分析pIgR在乳腺癌組織中差異表達(dá)情況，從TCGA數(shù)據(jù)集(https://portal.gdc.com)獲取1 090個乳腺癌腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù)(第3級)和相應(yīng)的臨床信息，另從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取對照組113例良性病例組織樣本數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，pIgR在乳腺癌病人癌組織中表達(dá)明顯低于良性對照組(P<0.01)(見表3)，且不同分期乳腺癌病人腫瘤組織中pIgR表達(dá)均低于良性對照組(P<0.01)，但不同分期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。根據(jù)pIgR表達(dá)，將乳腺癌病人分為pIgR低表達(dá)組(n=545)和高表達(dá)組(n=545)進(jìn)行生存分析，pIgR低表達(dá)組5年生存率為20.18%，病人生存時間中位數(shù)為2.07年，上四分位數(shù)為4.28年，下四分位數(shù)為1.12年；pIgR高表達(dá)組5年生存率為25.69%，病人生存時間中位數(shù)為2.58年，上四分位數(shù)為5.13年，下四分位數(shù)為1.37年，pIgR低表達(dá)組病人5年生存率低于高表達(dá)組(χ2=5.38，P<0.05)。

表3TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌與正常組織中pIgR的差異表達(dá)

表4pIgR在不同分期乳腺癌病人腫瘤組織中的表達(dá)

2.4 pIgR在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病人腫瘤組織中表達(dá) 利用免疫組織化學(xué)方法比較pIgR在BRCR組與NCT組中表達(dá)情況，結(jié)果顯示，pIgR在BRCR組表達(dá)明顯低于NCT組(見圖2)。

2.5 pIgR的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病人臨床病理關(guān)系 基于pIgR在BRCR組病人中表達(dá)水平，分析pIgR表達(dá)與病人臨床病理的相關(guān)性，結(jié)果顯示，不同年齡段、PR表達(dá)病人的pIgR表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而不同組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和HER-2、ER表達(dá)病人的pIgR表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見表5)。

表5pIgR表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病人臨床病理特征關(guān)系(n)

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，目前臨床針對乳腺癌主要采用手術(shù)為主、化療為輔的治療方式，但不同分子分型的乳腺癌病人治療方案各不相同[4-5]。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，其組織中的生物學(xué)指標(biāo)ER、PR、HER-2的表達(dá)情況往往是治療方法選擇及評估病人預(yù)后的決定性因素[6-7]。因此，初期診斷時準(zhǔn)確評估乳腺癌病人臨床病理特征和分子分型，在治療方案的選擇、預(yù)后評估等方面具有重要意義。

miRNA是一種長度在19～23 nt的一段非編碼小RNA，通過與mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合來抑制基因的表達(dá)。研究[8]顯示，與ER陰性腫瘤組織樣本相比，ER陽性的乳腺腫瘤中miR-196a表達(dá)水平更高，且miR-196a通過靶向抑制SPRED1表達(dá)增強(qiáng)了人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。KUDO等[9]研究表明，miR-183-5p靶向調(diào)控PLK1基因，有效降低其蛋白表達(dá)，這種miRNA驅(qū)動的PLK1表達(dá)調(diào)節(jié)使乳腺癌細(xì)胞對PLK1特異性抑制劑NMS-P937敏感，從而協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，miR-5585-5p在乳腺癌紫杉醇耐藥誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。本研究通過TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測pIgR可能是miR-5585-5p的靶基因之一，在人乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-5585-5p模擬物后，pIgR mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，證實(shí)miR-5585-5p可下調(diào)pIgR的表達(dá)。

pIgR是二聚體IgA和五聚體IgM的特異性受體，廣泛分布于上皮細(xì)胞基底，介導(dǎo)IgA與IgM的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在固有免疫及適應(yīng)性免疫之間起充當(dāng)鏈接的橋梁作用，是黏膜免疫與抗感染免疫中的重要成分[10]。近年研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，pIgR在不同癌癥中發(fā)揮不同作用，如在肺癌、胰腺癌、鼻咽癌中呈低表達(dá)，而在結(jié)腸癌、卵巢癌、食管癌及肝癌等癌癥中表達(dá)上調(diào)。LIU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，pIgR陽性表達(dá)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中pIgR表達(dá)陽性病人的總生存期明顯低于pIgR表達(dá)陰性病人，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中pIgR陽性是肝切除術(shù)后總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。QI等[14]研究證實(shí)，pIgR低表達(dá)與晚期臨床分期、T分期、N分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，pIgR低表達(dá)的鼻咽癌病人總生存期明顯短于高表達(dá)病人，可作為判斷鼻咽癌病人預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

BAO等[15]利用測序技術(shù)，鑒定乳腺癌差異表達(dá)基因(DEGs)，發(fā)現(xiàn)pIgR在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，分析其可能通過與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用，在乳腺癌中發(fā)揮重要作用。XIAO等[16]研究發(fā)現(xiàn)，pIgR在相對低風(fēng)險的乳腺癌病人中表達(dá)水平高于高風(fēng)險組，提示pIgR的低表達(dá)可能與乳腺癌病人的預(yù)后不良相關(guān)。本研究首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌病人腫瘤組織與良性病例間pIgR的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pIgR在乳腺癌組織中表達(dá)明顯低于良性組織；生存預(yù)后分析結(jié)果亦表明，低表達(dá)pIgR病人的5年生存率明顯低于高表達(dá)病人，表明pIgR表達(dá)可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。因此，本研究進(jìn)一步采用乳腺癌臨床樣本，分析pIgR表達(dá)與乳腺癌臨床病理的相關(guān)性，結(jié)果顯示，相對于乳腺良性腫瘤，乳腺癌組織中pIgR表達(dá)下調(diào)，且不同年齡段、PR表達(dá)情況的乳腺癌病人pIgR表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和HER-2、ER表達(dá)病人的pIgR表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其可能可作為生物標(biāo)志物，幫助進(jìn)行乳腺癌的分子分型和預(yù)后判斷。

綜上，miR-5585-5p可靶向調(diào)控pIgR表達(dá)，乳腺癌病人pIgR低表達(dá)可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER-2過表達(dá)相關(guān)，這為乳腺癌的早期篩查、分子分型及治療方案的制定提供了一定參考價值。