Vγ9Vδ2 T細胞聯(lián)合順鉑增強對鼻咽癌細胞的殺傷作用

蘇 凱，趙 報，馬瑩曄，李 慧，周 帥，王曉敏，張俊杰，馬士崟

鼻咽癌在世界范圍內(nèi)每年的發(fā)生病例接近87 000例，死亡病例約51 000例，約占世界腫瘤疾病的0.7%[1]。鼻咽癌在中國南方和東南亞地區(qū)呈高發(fā)趨勢，這與地理位置傾向、遺傳以及環(huán)境等因素相關(guān)，如高危的HLA基因型HLA-A亞型，以及飲食中富含亞硝胺及亞硝胺前體，均是鼻咽癌發(fā)生的危險因素[2-3]。由于鼻咽癌對放療比較敏感，因此放療適用于所有臨床階段的未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌。對于原位晚期病人，通常采用放療和化療聯(lián)合治療，該方法可以實現(xiàn)大于85%的原位疾病控制和80%的生存率。盡管鼻咽癌的臨床治療具有很好的效果，但是仍然有約18%原位腫瘤控制失敗或者產(chǎn)生遠處轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要開發(fā)新的針對晚期鼻咽癌的治療方法[4-5]。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)的發(fā)展和相互滲透，腫瘤細胞免疫治療由于特異性強、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，已在抗腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[6-7]。Vγ9Vδ2 T細胞具有良好的抗腫瘤特性，識別惡性腫瘤細胞，在腫瘤的細胞治療和聯(lián)合治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，基于Vγ9Vδ2 T細胞腫瘤免疫療法在一些癌癥中已經(jīng)表現(xiàn)出一定的療效[8]。Vγ9Vδ2 T細胞的聯(lián)合治療可以調(diào)節(jié)細胞免疫功能，增強對癌細胞的殺傷作用[9-11]。本研究探討Vγ9Vδ2 T細胞聯(lián)合順鉑(CDDP)對鼻咽癌細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 唑來膦酸(ZOL)購自上海麥克林生物科技公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶購自Gibco公司，人外周血淋巴細胞分離液購自Solarbio公司，CCK8檢測試劑盒購買自Biosharp公司，MICA、MICB和GAPDH蛋白抗體購買自Abcam公司。

1.2 細胞及培養(yǎng) 鼻咽癌CNE2Z和HNE1細胞購買自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，并于蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理實驗室進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)采用RPMI 1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗，于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3 外周血單個核細胞體外擴增Vγ9Vδ2 T細胞 從3名健康獻血者獲得外周血樣本，加入淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞，吸取單個核細胞層，0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×108/L，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察細胞生長狀況，及時更換細胞培養(yǎng)液[12]。收集培養(yǎng)第7天的Vγ9Vδ2 T細胞進行細胞表面標(biāo)記物檢測和后續(xù)實驗。

1.4 低濃度CDDP、ZOL聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞對鼻咽癌細胞增殖的影響 通過CCK8實驗檢測鼻咽癌CNE2Z細胞的活性。將CNE2Z細胞接種于96孔板中，調(diào)整細胞密度至5×103/孔，Vγ9Vδ2 T細胞以指定的效/靶比(10∶1)添加，CDDP濃度為0、0.5、1、2.5、5.0 μg/mL，ZOL濃度為0、5、10、15、20、25 μmol/L，作用24 h后使用酶標(biāo)儀檢測細胞增殖活性。為觀察CDDP、ZOL和Vγ9Vδ2 T細胞聯(lián)合對鼻咽癌細胞殺傷作用，設(shè)置Vγ9Vδ2 T細胞、Vγ9Vδ2 T細胞+ZOL、Vγ9Vδ2 T細胞+CDDP和Vγ9Vδ2 T細胞+ZOL+CDDP 4個實驗組，其中CDDP濃度為1 μg/mL，ZOL濃度為10 μmol/L。Vγ9Vδ2 T細胞以不同的效/靶比添加(0∶1、2.5∶1、5∶1、10∶1)，作用24 h后使用酶標(biāo)儀檢測細胞增殖活性。

1.5 CDDP、ZOL誘導(dǎo)對Vγ9Vδ2 T細胞表面腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、CD107a的影響 為檢測低濃度CDDP和ZOL對Vγ9Vδ2 T細胞免疫因子分泌的影響，設(shè)置對照組、CDDP組、ZOL組和ZOL+CDDP組4個處理組，CDDP濃度為1 μg/mL，每組加入10 μmol/L ZOL，流式細胞術(shù)檢測Vγ9Vδ2 T細胞CD107a、TNF-α和IFN-γ的分泌。

1.6 檢測CDDP對MICA、MICB蛋白表達的影響 分別使用0、0.25、0.5、1.0 μg/mL CDDP溶液處理CNE2Z和HNE1鼻咽癌細胞，處理48 h后，使用流式細胞儀檢測細胞表面MICA和MICB的表達。Western blotting檢測CDDP對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷鼻咽癌細胞CNE2Z和HNE1的影響，CDDP濃度為1 μg/mL，于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使用裂解液收集細胞總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，MICA和MICB一抗在4 ℃孵育過夜。然后在室溫下用二抗孵育2 h，并使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、q檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 低濃度CDDP、ZOL增強Vγ9Vδ2 T細胞對鼻咽癌CNE2Z細胞的殺傷作用 隨著CDDP濃度的增加，CNE2Z細胞存活率降低，CDDP+Vγ9Vδ2 T細胞的殺傷作用均強于單獨使用CDDP對CNE2Z細胞的殺傷作用(P<0.05)(見表1)。ZOL對Vγ9Vδ2 T細胞的增殖有促進作用，與單獨使用ZOL比較，ZOL+Vγ9Vδ2 T細胞對CNE2Z細胞的殺傷作用增強(P<0.05)(見表2)。CDDP、ZOL、Vγ9Vδ2 T細胞聯(lián)合時對CNE2Z細胞的殺傷效率最高(P<0.05)(見表3、4)。

表1 不同濃度CDDP對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷CNE2Z細胞敏感性的影響

表2 不同濃度ZOL對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷CNE2Z細胞敏感性的影響

表3 低濃度CDDP、ZOL聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞殺傷CNE2Z細胞的作用

表4 低濃度CDDP、ZOL聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞殺傷HNE1細胞的作用

2.2 低濃度CDDP、ZOL處理鼻咽癌細胞對Vγ9Vδ2 T細胞細胞因子分泌的影響 CDDP組、ZOL組和ZOL+CDDP組鼻咽癌細胞的CD107a、TNF-α、IFN-γ分泌量均高于對照組，ZOL+CDDP組鼻咽癌細胞的CD107a、TNF-α、IFN-γ分泌量最多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表5)。

2.3 CDDP聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞上調(diào)鼻咽癌細胞表面MICA和MICB的表達 CDDP和Vγ9Vδ2 T細胞共同作用后，鼻咽癌細胞表面MICA和MICB表達升高(見圖1A)。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，CDDP聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞處理后，鼻咽癌細胞表面MICA和MICB蛋白的表達量明顯升高(P<0.01)(見圖1B、表6)。

表5 低濃度CDDP、ZOL處理鼻咽癌細胞增強Vγ9Vδ2 T細胞細胞因子的分泌

3 討論

Vγ9Vδ2 T細胞作為參與人類先天免疫系統(tǒng)的淋巴細胞亞群，可以對抗腫瘤和微生物感染。Vγ9Vδ2 T細胞以MHC非依賴的方式直接識別和應(yīng)答抗原，從而有效殺傷腫瘤細胞和微生物，可以通過體外培養(yǎng)在短時間內(nèi)從外周血單個核細胞中有效產(chǎn)生，被認為是癌癥免疫治療的良好候選細胞[13-14]。已經(jīng)進行的幾項研究[15-17]表明，Vγ9Vδ2 T細胞對卵巢癌等展現(xiàn)出良好的殺傷作用，實驗顯示了很高有效性和安全性。因此，更好地了解Vγ9Vδ2 T細胞在腫瘤微環(huán)境中的功能作用將有助于開發(fā)更好的抗腫瘤療法。

CDDP是目前鼻咽癌治療的常見化療藥，然而單獨化療對晚期鼻咽癌的效果并不理想，所以急需探索新的治療方法。已有文獻[18]顯示，化療藥物聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞的治療方法對惡性腫瘤的效果良好且安全可靠。本研究旨在觀察Vγ9Vδ2 T細胞聯(lián)合CDDP和ZOL對鼻咽癌細胞殺傷作用的影響，結(jié)果顯示，ZOL可以誘導(dǎo)Vγ9Vδ2 T細胞的增殖，增強Vγ9Vδ2 T細胞對鼻咽癌細胞的殺傷作用。低濃度CDDP、ZOL可增強Vγ9Vδ2 T細胞對鼻咽癌細胞的殺傷作用。經(jīng)過低濃度CDDP和ZOL處理后的鼻咽癌細胞對Vγ9Vδ2 T細胞會產(chǎn)生什么影響，我們的研究發(fā)現(xiàn)，Vγ9Vδ2 T細胞CD107a、TNF-α和IFN-γ的分泌量顯著升高，從而產(chǎn)生對鼻咽癌細胞的更有效的殺傷作用。Vγ9Vδ2 T細胞具有廣泛的先天抗腫瘤和抗感染活性，通過多種信號通路發(fā)揮對癌癥的殺傷作用，主要包括γδTCR和NKG2D-NKG2DL兩種。腫瘤細胞在其細胞表面表達NKG2DL，是NK細胞活化受體NKG2D的配體，NKG2D和NKG2DL之間相互作用觸發(fā)腫瘤細胞的細胞溶解。NKG2D受體也在Vγ9Vδ2 T細胞表面表達，Vγ9Vδ2 T細胞對腫瘤細胞具有與NK細胞相同的細胞毒作用[19]。本研究結(jié)果表明，Vγ9Vδ2 T細胞與CDDP聯(lián)合使用時對鼻咽癌細胞的殺傷作用增強，提示CDDP可能增強鼻咽癌細胞對Vγ9Vδ2 T細胞介導(dǎo)的細胞毒性的敏感性；CDDP聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞作用于鼻咽癌細胞，NKG2D-NKG2DL通路相關(guān)分子(MICA、MICB等)表達量升高，提示CDDP聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞可能通過NKG2D-NKG2DL通路殺傷鼻咽癌細胞。

表6CDDP聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細胞增強鼻咽癌細胞表面MICA、MICB蛋白的表達

綜上，CDDP可以增強鼻咽癌細胞對Vγ9Vδ2 T細胞細胞毒性的敏感性，其機制可能與促進鼻咽癌細胞表面MICA和MICB的表達及增加Vγ9Vδ2 T細胞TNF-α和IFN-γ的分泌有關(guān)。Vγ9Vδ2 T細胞的過繼轉(zhuǎn)移聯(lián)合CDDP治療可能代表一種治療鼻咽癌的新策略，本研究結(jié)果為這種聯(lián)合治療的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。