基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的動物源性食品中33種農(nóng)藥及其代謝物的測定

李蔚然 鄭 鋅 湯曉艷

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，北京 100081；2.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，北京 100020）

動物源性食品中存在六六六、滴滴涕[1]、溴氰菊酯、氰戊菊酯[2]、氟蟲腈[3]等多種農(nóng)藥殘留問題，該情況已得到政府的高度重視。2019年，我國頒布的GB2763-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》就針對動物源性食品中703項(xiàng)農(nóng)藥殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，這標(biāo)志著我國農(nóng)藥殘留監(jiān)管從植物源性食品拓展到動物源性食品[4]。目前，最新頒布的2021版GB 2763標(biāo)準(zhǔn)[5]已經(jīng)對動物源性食品中903種農(nóng)藥殘留限量進(jìn)行了規(guī)定。此外，GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[6]也對部分養(yǎng)殖環(huán)境用殺蟲劑在動物源性食品中的殘留限量進(jìn)行了規(guī)定。然而，GB 2763-2021與GB 31650-2019標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、二嗪磷等19項(xiàng)限量指標(biāo)存在不一致的問題。同時(shí)，我國GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)中涉及的動物源食品中農(nóng)藥殘留限量與國際食品法典委員會（CAC）相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)也存在規(guī)定不一致的問題，共涉及有77項(xiàng)指標(biāo)。在GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)中，動物源性食品中農(nóng)藥殘留配套檢測方法標(biāo)準(zhǔn)共涉及30項(xiàng)，但存在標(biāo)準(zhǔn)年限久、檢測方法操作復(fù)雜、檢出限高于限量值等問題。

為了對GB 2763-2021與GB 31650-2019標(biāo)準(zhǔn)和CAC標(biāo)準(zhǔn)的不一致問題進(jìn)行評估，本研究擬建立GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)中33種農(nóng)藥及10種代謝物的基于QuEChERS前處理的LC-MS/MS檢測方法，并將方法應(yīng)用于檢測居民日常消費(fèi)的肉類、內(nèi)臟、蛋類、生乳等大宗動物源性食品進(jìn)行方法驗(yàn)證，以期為我國動物源食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)再評估提供方法支撐。

一、材料與方法

（一）儀器、試劑與材料LC-MS 8045三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；Eclipse XDB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美國安捷倫公司）；電子分析天平（感量0.01 g和0.000 1 g，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國密理博公司）；多管旋渦混合儀（江蘇恒敏儀器制造有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（北京天林恒泰科技有限公司）；氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

乙腈（色譜純，德國默克公司）；QuEChERS萃取鹽包［4 g無水硫酸鎂（MgSO4）、1 g氯化鈉（NaCl）、1 g檸檬酸鈉（TSCD）、0.5 g檸檬酸氫二鈉（DHS），蘇州納譜分析技術(shù)有限公司］；無水硫酸鎂（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；十八烷基硅烷（C18，蘇州賽分科技有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA，天津博納艾杰爾科技有限公司）；石墨化碳黑（GCB，美國Dikma公司）；38種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/L），多殺霉素A、多殺霉素D、氟啶蟲胺腈、5-羥基噻菌靈、殺線威標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L），均購于天津阿爾塔科技有限公司。

（二）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制將38種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃避光保存，有效期為1個月。

（三）樣品采集與制備

1.樣品采集。共采集238份來源于農(nóng)貿(mào)市場、養(yǎng)殖場和屠宰場的樣品。采樣地點(diǎn)涉及北京、江蘇、內(nèi)蒙古、甘肅、山東、河南、上海、四川、廣東、江西10個省（自治區(qū)、直轄市）。樣品具體包括豬肉36份、牛肉27份、羊肉17份、豬肝27份、雞肉41份、雞蛋40份、生乳50份。樣品采集后貯藏于-20℃，盡快送至實(shí)驗(yàn)室。

2.樣品制備。肉類和內(nèi)臟切塊后，用絞碎機(jī)充分絞碎均勻成糜狀；蛋類去殼后用攪拌機(jī)攪勻，制成勻漿；生乳混勻，置于-20℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

（四）試驗(yàn)方法

1.色譜條件。色譜柱為Eclipse XDB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫為40℃；流動相A為含0.01%甲酸的2 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5.0 μL；溶劑共進(jìn)為前后分別注入15 μL；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子和負(fù)離子同時(shí)掃描；檢測方式為多反應(yīng)離子檢測模式（MRM）；霧化氣流量為3 L/min；干燥氣流量為10 L/min；加熱氣流量為10 L/min；接口溫度為300℃；脫溶劑溫度為526℃；脫溶劑管（DL）溫度為150℃；加熱塊溫度為400℃；碰撞誘導(dǎo)解離（CID）氣為高純氬氣（純度99.999%），CID氣壓力為230 kPa；43種目標(biāo)物的離子對及碰撞能量參數(shù)見表2。

表2 43種目標(biāo)物的保留時(shí)間、離子對及碰撞能量

3.樣品提取。準(zhǔn)確稱取樣品5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中。肉類、內(nèi)臟、蛋類樣品先加入2 mL水，后加入10 mL乙腈提取；生乳樣品不加水直接加10 mL乙腈提取，用力混勻，渦旋振蕩1 min。之后加入QuEChERS萃取鹽包，迅速用力搖勻，渦旋振蕩1 min，在4℃條件下以10 000 r/min離心5 min后待凈化。

4.樣品凈化。取上清液3 mL轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱好凈化劑（450 mg無水MgSO4、50 mg C18和50 mg PSA）的15 mL離心管中，渦旋振蕩1 min，在4℃條件下以10 000 r/min離心5 min。

5.氮吹定容。取2 mL上清液于離心管中進(jìn)行氮吹，氮吹至1 mL，加水定容至2 mL，過0.22 μm有機(jī)相濾膜至進(jìn)樣小瓶，待上機(jī)測定。

二、結(jié)果與分析

（一）流動相的選擇本研究比較了水-乙腈和水-甲醇分別作流動相對目標(biāo)物分離和響應(yīng)效果的影響。結(jié)果顯示，在水-乙腈條件下，聯(lián)苯菊酯和敵敵畏的響應(yīng)值低，而在水-甲醇條件下，響應(yīng)值明顯提高，因此，有機(jī)相選擇甲醇。甲酸可提高[M+H]+離子的響應(yīng)強(qiáng)度，乙酸銨能夠提高[M-H]-離子的響應(yīng)強(qiáng)度以及改善峰形[7]，因此考察水相中添加不同濃度的甲酸（0.01%、0.05%、0.1%）、乙酸銨（2、5 mmol/L）對峰形、響應(yīng)值、保留時(shí)間的影響。經(jīng)考察比較，最終確定流動相的條件為含0.01%甲酸的2 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇，在此條件下，目標(biāo)物的響應(yīng)值高、峰形好，且能確保目標(biāo)物基本在雜質(zhì)洗脫前出峰。

（二）提取條件的選擇43種目標(biāo)物的極性差異大（極性排序見圖1），因此選擇的提取劑應(yīng)具有較強(qiáng)的提取能力。另外，動物源性食品含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分，共提物對目標(biāo)物信號產(chǎn)生干擾，因此應(yīng)選擇提取雜質(zhì)少的提取劑。已有研究中考察了乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷-丙酮等提取劑的提取效率，結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈為提取劑時(shí)，提取效率普遍更高、雜質(zhì)提取量更少[1，8]。因此，基于現(xiàn)有研究結(jié)果，本研究選擇乙腈為提取劑。肉類、內(nèi)臟、蛋類樣品具有一定的黏性，且有研究表明，乙腈會導(dǎo)致蛋白質(zhì)快速變性沉淀，造成目標(biāo)物因包裹難以釋放[9]，因此需加水使樣品分散得更加均勻，增強(qiáng)乙腈對樣品的滲透性以及對農(nóng)藥的提取效果[10]。

圖1 43種目標(biāo)物極性強(qiáng)度排序

本研究以豬肉為基質(zhì)，考察了在10 mL乙腈中添加不同水量（0、2、5 mL）對目標(biāo)物提取效率的影響，結(jié)果表明，加入適量的水可以使豬肉樣品更均勻地分散在液體體系中，避免成大塊團(tuán)狀，但加水量2 mL和5 mL對回收率沒有顯著差異，考慮到后續(xù)鹽析步驟中無水MgSO4、NaCl的用量，因此選擇2 mL水+10 mL乙腈進(jìn)行勻漿提取。

（三）凈化劑的選擇動物源性食品中的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素等雜質(zhì)會干擾目標(biāo)物的離子化效率及響應(yīng)強(qiáng)度，同時(shí)各種雜質(zhì)在色譜柱、儀器管路中的殘留堆積容易造成色譜柱和儀器堵塞，導(dǎo)致靈敏度下降，因此需要對提取液進(jìn)行凈化。常用的QuEChERS凈化材料包括C18、PSA、GCB。C18對脂肪等非極性物質(zhì)有較高的容量；PSA可以去除食品基質(zhì)中的糖類、有機(jī)酸、脂肪酸等多種組分；GCB可用于去除樣品中的色素、甾醇等雜質(zhì)[1，11～12]。

本研究以豬肉為對象，考察了QuEChERS方法中PSA、C18、GCB不同用量對目標(biāo)物回收率的影響，考察條件分別為450 mg無水MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18、450 mg無水MgSO4+100 mg PSA+100 mg C18、450 mg無水MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+25 mg GCB，結(jié)果見表3。根據(jù)結(jié)果最終選擇加入450 mg無水MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18進(jìn)行凈化。

表3 不同凈化條件下43種目標(biāo)物的回收率分布

（四）溶劑效應(yīng)取凈化液直接上機(jī)測定，結(jié)果顯示，5-羥基噻菌靈、殺線威肟、霜霉威等極性較大、出峰較早的目標(biāo)物的峰型因溶劑效應(yīng)而存在展寬、分叉的現(xiàn)象，因此，需對上機(jī)溶液進(jìn)行調(diào)整?？疾焐蠙C(jī)溶劑為乙腈、50%乙腈水（V乙腈∶V水＝1∶1）、33%乙腈水（V乙腈∶V水＝1∶2）對峰型的影響，結(jié)果表明，當(dāng)上機(jī)溶劑為50%乙腈水時(shí)，溶劑效應(yīng)即可得到改善。

（五）方法學(xué)驗(yàn)證

1.基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)（ME，%）采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評價(jià)，計(jì)算公式為ME＝（b基質(zhì)/b溶劑）×100。當(dāng)ME＞100%時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜100%時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；且當(dāng)ME介于80%～120%之間時(shí)，通常認(rèn)為不存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)超出此范圍時(shí)表明存在較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，須進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償[13～14]。

4類動物源性食品中43種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見圖2。如圖2所示，部分目標(biāo)物存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。減少基質(zhì)效應(yīng)影響的方法包括使用同位素標(biāo)記法、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、分析物保護(hù)劑等[1]，本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以削弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖2 43種目標(biāo)物在4類動物源性食品中的基質(zhì)效應(yīng)

2.線性關(guān)系與檢出限。按前處理方法得到基質(zhì)溶液。用基質(zhì)溶液配 制濃 度為1、2、5、10、50、100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的峰面積和質(zhì)量濃度分別為縱坐標(biāo)（Y）和橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，除敵敵畏在2～100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，其余目標(biāo)物均在1～100 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）介于0.996 8～0.999 9之間（見表4～表7）。

根據(jù)化合物響應(yīng)情況，以定量離子信噪比（S/N）＝3估算檢出限（LOD），得到43種目標(biāo)物的LOD為0.02～3.34 μg/kg（見表4～表7）。

3.回收率、精密度與定量限。稱樣后，分別加入5、20、100 μg/kg的43種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上文確定的試驗(yàn)方法進(jìn)行處理、測定，每個添加回收水平重復(fù)5次。定量限（LOQ）為滿足要求的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）對應(yīng)的最低濃度。結(jié)果顯示，43種目標(biāo)物在肉類、內(nèi)臟、蛋類、生乳中的回收率范圍為60.7%～120.0%，RSD為0.2%～19.6%（見表4～表7），方法的LOQ為5 μg/kg，均滿足限量要求和NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求。

表4 肉類中43種目標(biāo)物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率及精密度

表7 生乳中43種目標(biāo)物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率及精密度

表5 內(nèi)臟中43種目標(biāo)物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率及精密度

表6 蛋類中43種目標(biāo)物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率及精密度

（六）實(shí)際樣品檢測分析利用上述建立的方法對豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、生乳等238份動物源性食品中43種目標(biāo)物進(jìn)行檢測，檢出結(jié)果見表8。由表8可知，雞蛋樣品中農(nóng)藥的檢出率最高，為20.00%，其中2份檢出毒死蜱，1份檢出氟甲腈，3份檢出氟蟲腈砜，還有2份樣品同時(shí)存在氟蟲腈砜和殺線威殘留。此外，在生乳、牛肉和羊肉中也檢出農(nóng)藥殘留，其中各有2份生乳樣品分別檢出氟啶蟲胺腈和啶蟲脒；1份牛肉樣品和2份羊肉樣品檢出吡唑醚菌酯。雞蛋中殺線威、生乳中氟啶蟲胺腈和啶蟲脒以及牛羊肉中吡唑醚菌酯雖有檢出，但存在低于LOQ的情況。依據(jù)GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，238份動物源性食品中農(nóng)藥殘留水平均低于最大殘留限量（MRL）。

表8 實(shí)際樣品檢出結(jié)果

結(jié)合其他文獻(xiàn)的檢出結(jié)果進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)氟蟲腈在雞蛋中的殘留概率相對其他種類農(nóng)藥和動物源性食品來說較高，在本次樣品中以氟蟲腈砜殘留為主（1/6為氟甲腈、5/6氟蟲腈砜），該結(jié)果也與現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果相同[15～19]。還有檢測結(jié)果表明，我國雞蛋中的氟蟲腈殘留水平存在超標(biāo)的情況。XU等[17]在來源于成都當(dāng)?shù)爻屑稗r(nóng)場的48份雞蛋樣品中，檢出1份氟蟲腈殘留水平達(dá)313.2 μg/kg的樣品，該數(shù)值明顯超標(biāo)。因此，氟蟲腈作為衛(wèi)生殺蟲劑使用時(shí)應(yīng)注意使用方式，以降低殘留的發(fā)生概率和殘留水平。另外，黃小波和劉維平[20]在雞蛋中有檢出毒死蜱殘留。目前雖沒有相同檢測結(jié)果表明生乳中存在啶蟲脒殘留，但有在雞蛋和動物糞便中檢出啶蟲脒殘留的文獻(xiàn)報(bào)道[20～22]。本研究中，氟啶蟲胺腈、啶蟲脒、毒死蜱等農(nóng)藥在動物源性食品中的殘留可能是由于畜禽食用了有農(nóng)藥殘留的飼料或采食了受農(nóng)藥污染的食物，也可能是由于農(nóng)藥在施用后污染了畜禽的生活環(huán)境。

三、結(jié)論

本研究通過對流動相及前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立了動物源性食品中33種農(nóng)藥及10種代謝物的QuEChERS-LC-MS/MS方法，方法檢出限為0.02～3.34 μg/kg，定量限為5 μg/kg，43種目標(biāo)物的回收率在60.7%～120.0%之間。該方法適用基質(zhì)范圍廣，能滿足監(jiān)管過程中的相應(yīng)農(nóng)藥殘留的定性定量檢測要求，可為動物源性食品日常檢測和限量再評估提供方法支撐。

本文引用格式：李蔚然，鄭鋅，湯曉艷.基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的動物源性食品中33種農(nóng)藥及其代謝物的測定 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2022（6）：5-14.

LI Weiran，ZHENG Xin，TANG Xiaoyan.Determination of 33 pesticides and their metabolites residue in animal-derived foods by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Quality and Safety of Agro-products，2022（6）：5-14.

atographyA，2019，1593：81-90.