福建武夷山地區(qū)土壤可培養(yǎng)放線菌多樣性分析

吳寶川，陳小塵，黃兆斌，周艷，黃衛(wèi)紅，鄭曉婷，薛喜枚，張秋芳*

(1.泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000；2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350007；3.武夷山國(guó)家公園科研監(jiān)測(cè)中心，福建 武夷山 354300；4.中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所，福建 廈門 361021)

放線菌是微生物的重要組成部分，在土壤有機(jī)物礦化、物質(zhì)循環(huán)、環(huán)境治理和生態(tài)修復(fù)等過(guò)程中起著主導(dǎo)作用，對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和可持續(xù)性具有重要意義[1-3].自然界中與人類密切相關(guān)的微生物次生代謝產(chǎn)物70%以上來(lái)源于放線菌，其中大約三分之二的抗生素具有臨床意義[4].土壤放線菌現(xiàn)今仍然是新醫(yī)藥和新農(nóng)藥研制的重要源頭，是一類具有廣闊應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益的寶貴微生物資源[4-7]，因此，對(duì)土壤中可培養(yǎng)放線菌多樣性的研究具有重要意義.

武夷山國(guó)家公園位于福建省西北部與江西省交界處(117°27′～117°51′E，27°35’～27°54′N)，氣候溫暖濕潤(rùn)，是世界上同緯度帶現(xiàn)存面積最大、保存最完整和生物資源最為豐富的生態(tài)系統(tǒng)[8]，是中國(guó)東南部生物多樣性保護(hù)中唯一的和最具有關(guān)鍵意義的區(qū)域[9]，是我國(guó)首批正式設(shè)立的五大國(guó)家公園之一.多元化的土壤和植被類型使得該地區(qū)的土壤微生物群落組成豐富多樣.近年來(lái)，關(guān)于武夷山地區(qū)微生物多樣性研究已相繼被報(bào)道，如李巍等[10]應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)(HTS)研究了武夷山土壤微生物群落的季節(jié)動(dòng)態(tài)；吳則焰等[11]應(yīng)用運(yùn)用磷脂脂肪酸標(biāo)記法(PLFA)研究武夷山不同海拔植被帶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征.但前人主要研究了武夷山地區(qū)整體微生物的群落組成多樣性，關(guān)于該地區(qū)土壤可培養(yǎng)放線菌種類及其組成多樣性的相關(guān)研究尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道.

本研究對(duì)位于福建的武夷山國(guó)家公園內(nèi)24個(gè)長(zhǎng)期定位觀測(cè)點(diǎn)的土壤放線菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離和純化，并結(jié)合分子生物學(xué)方法，將獲得的菌株進(jìn)行16S rRNA基因鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析.通過(guò)對(duì)該地區(qū)重要點(diǎn)位土壤可培養(yǎng)放線菌種類和群落多樣性分布特征分析，為合理開(kāi)發(fā)和利用該地區(qū)的放線菌資源提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

武夷山地區(qū)沿海拔交錯(cuò)分布了竹林、古樹(shù)群、茶園、馬尾松林、針闊混交林、巖生植物、烏岡櫟林和野生茶園等不同植被類型.對(duì)地質(zhì)、地貌和植被類型進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)后，最終確定以沿海拔的植被分布為采樣依據(jù).為了盡可能使采樣點(diǎn)能夠覆蓋前期的觀測(cè)區(qū)域，選取了不同海拔和植被類型的24個(gè)觀測(cè)樣地作為采樣點(diǎn)(117°74′～117° 96′E，27°60′～27° 77′N)，采樣地詳細(xì)信息見(jiàn)表1.

表1 武夷山國(guó)家公園土壤樣品采集點(diǎn)信息

1.2 研究方法

1.2.1 土壤樣品采集 于2018年和2019年連續(xù)采集了福建武夷山地區(qū)24個(gè)采樣點(diǎn)的土壤樣品，每個(gè)采樣點(diǎn)選取3個(gè)區(qū)域，設(shè)為重復(fù)3次，根據(jù)“S”形分布多點(diǎn)采樣.采樣時(shí)，先將地表以上2 cm的枯枝落葉去除，在不破壞土壤各層結(jié)構(gòu)情況下，用消毒后的不銹鋼鏟采集0～30 cm深度的土壤樣品[12].取300 g土壤樣品混合均勻后裝于無(wú)菌自封袋，在低溫下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用于放線菌的分離、培養(yǎng)和純化.

1.2.2 放線菌的分離培養(yǎng) 將每個(gè)采樣點(diǎn)采集的3份新鮮土壤樣品分別去除根系和石礫等雜質(zhì)，充分混勻后稱取1 g新鮮土壤，采用10倍梯度稀釋法[13]，取稀釋倍數(shù)為104、105和106的3個(gè)梯度濃度的稀釋液，均勻涂布在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基(GA)上，于28 ℃培養(yǎng)3～5 d[14].待菌落長(zhǎng)出后，挑選形態(tài)、大小和顏色不同的單菌落，用三區(qū)劃線法進(jìn)行轉(zhuǎn)接和純化3次后，將單菌落于4 ℃低溫保存用于鑒定.

1.2.3 放線菌的鑒定 將1.2.2中分離獲得的菌株用高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)離心和清洗后的菌體用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，提取過(guò)程參照說(shuō)明書進(jìn)行.以提取的DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物Eub27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15].PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min(30個(gè)循環(huán))；最后72 ℃下延伸10 min.取部分PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳在自動(dòng)凝膠成像儀上進(jìn)行觀察檢測(cè)后，將具明亮條帶的PCR產(chǎn)物樣品送至廈門鉑瑞生物科技有限公司，于ABI3730I測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

2.1 武夷山地區(qū)可培養(yǎng)放線菌類群分布

采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基對(duì)武夷山24個(gè)樣地中的土壤放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得109株純培養(yǎng)放線菌，根據(jù)16S rRNA基因序列分析和比對(duì)后，鑒定表明這109株菌分別屬于5個(gè)目、6個(gè)科、10個(gè)屬，結(jié)果如圖1和表2所示.

圖1 武夷山土壤可培養(yǎng)放線菌的16S rRNA基因N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

10個(gè)屬分別為鏈霉菌屬(Streptomyces)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)、類節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)、北里孢菌屬(Kitsatospora)、小單孢菌屬(Micromonospora)、中國(guó)單胞菌屬(Sinomonas)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、類諾卡氏菌屬(Nocardiodies)和野野村菌屬(Nonomuraea).其中，鏈霉菌屬和北里孢菌屬的數(shù)量分別有79株和17株，占總放線菌總數(shù)的72.48%和15.60%，其次是中國(guó)單胞菌屬和節(jié)桿菌屬，分別占放線菌總數(shù)的3.67%和2.75%，而其他屬都只分離到1株.所分離到的109株放線菌菌株中包含57種不同的放線菌，結(jié)果如表2所示.其中，42種為鏈霉菌，5種為北里孢菌，2種為節(jié)桿菌，其余7個(gè)屬的放線菌只含有1個(gè)種.嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)是鏈霉菌屬的優(yōu)勢(shì)種，占鏈霉菌屬菌種總數(shù)的8.86%；其次是維吉尼亞鏈霉菌(Streptomycesvirginiae)，占鏈霉菌屬菌種總數(shù)的6.33%，而其他鏈霉菌屬種類數(shù)量較少.北里孢菌屬中，Kitasatosporaxanthocidica和光氣北里孢菌(Kitasatosporaphosalacinea)是優(yōu)勢(shì)種，占全部放線菌總數(shù)的7.40%和5.50%.

表2 武夷山土壤可培養(yǎng)放線菌菌株鑒定結(jié)果

放線菌物種數(shù)量的分布結(jié)果見(jiàn)表3.表中顯示，低海拔樣地土壤分離到的放線菌數(shù)量總體高于高海拔樣地，表明武夷山低海拔地區(qū)溫和的氣候條件更適合土壤放線菌生存.茶園土壤中的放線菌數(shù)量明顯高于其他樣地土壤，在茶園土壤中共分離到55株放線菌，占所有放線菌的50.46%，包含8個(gè)屬的36種不同放線菌.針闊混交林、毛環(huán)竹林、烏岡櫟林土壤中分離得到了包括鏈霉菌屬、北里孢菌屬、擬諾卡氏菌屬和假節(jié)桿菌屬4個(gè)不同屬.馬尾松林、名木古樹(shù)群和巖生植被土壤中只分離到鏈霉菌屬.由此可見(jiàn)，不同植被類型土壤中的可培養(yǎng)放線菌類群具有明顯差異，其中茶園土壤更有利于多種可培養(yǎng)放線菌類群共存，而僅有鏈霉菌屬能夠適應(yīng)馬尾松林、名木古樹(shù)群和巖生植被的獨(dú)特土壤環(huán)境.

表3 武夷山土壤可培養(yǎng)放線菌的多樣性指數(shù)

2.2 武夷山土壤放線菌群落多樣性分析

由表3可知，不同樣地土壤中可培養(yǎng)放線菌屬水平下的多樣性指數(shù)存在差異.Simpson指數(shù)最高和Shannon指數(shù)最高的均為鬼洞(GD)和黃溪洲1 200 m(HXZ1200)樣地，分別為0.667和1.099.所有樣地Pielou指數(shù)在0.223～1.000.除了燕子窠(YZK)外，低海拔茶園樣地放線菌的多樣性指數(shù)相對(duì)較高，而隨著海拔升高，除了一地好茶(YDHC)外，其他茶園樣地的放線菌多樣性指數(shù)降低，三仰峰茶園(SYF-C)、麻粟樣地1 280 m(MSYD1280)和洋莊三渡(YZSD)的放線菌多樣性指數(shù)均為0.茶園作為經(jīng)濟(jì)作物，武夷山地區(qū)的茶農(nóng)會(huì)經(jīng)常對(duì)其進(jìn)行追肥，外來(lái)有機(jī)肥增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而提高了低海拔茶園土壤放線菌的多樣性.高海拔的低溫環(huán)境限制了土壤放線菌對(duì)外來(lái)有機(jī)肥和茶樹(shù)凋落物形成的單一類型有機(jī)質(zhì)的利用，這可能是導(dǎo)致高海拔茶園土壤放線菌的多樣性降低的原因.然而，高海拔的一地好茶(YDHC)樣地的放線菌多樣性指數(shù)并不為0，這可能和一地好茶(YDHC)茶園四周分布著大量的針闊混交林有關(guān)，針闊混交林形成的凋落物落入茶園后與茶樹(shù)凋落物形成了豐富多樣的有機(jī)質(zhì)，能夠被更多不同的土壤放線菌利用，因此促進(jìn)了一地好茶(YDHC)樣地的放線菌多樣性.其他植被類型的低海拔樣地如永樂(lè)禪寺(YLCS)、九曲溪馬尾松林(JQX-MW)、四新林場(chǎng)針闊混交林(SXLC-ZK)和巖生植被(YSZB)等，多樣性指數(shù)均為0.這些樣地的海拔均低于400 m，是武夷山景區(qū)游客頻繁旅游的區(qū)域，大量的人為活動(dòng)可能是導(dǎo)致這些區(qū)域放線菌多樣性低于其他區(qū)域的重要原因.高海拔的四新林場(chǎng)馬尾松林(SXLC-MW)和五曲河(WQH)的多樣性指數(shù)同樣為0，這2個(gè)樣地單一植被類型形成的單一類型土壤有機(jī)質(zhì)在高海拔的高寒氣候條件下并不利于被土壤放線菌降解.除了茶園樣地外，其他土壤放線菌多樣性指數(shù)較高的多為海拔較低或是具有混合植被類型的土壤樣地，低海拔的溫和氣候有利于土壤放線菌分解有機(jī)質(zhì)，而混合植被類型凋落物形成的豐富有機(jī)質(zhì)能夠?yàn)榉啪€菌提供更多的養(yǎng)分.通過(guò)對(duì)比可培養(yǎng)放線菌物種數(shù)量分布和多樣性差異，表明海拔梯度、植被類型，以及人為活動(dòng)共同影響了武夷山地區(qū)土壤可培養(yǎng)放線菌的多樣性和分布.

3 討論

本研究對(duì)福建省內(nèi)武夷山國(guó)家公園內(nèi)定位觀測(cè)的重要點(diǎn)位土壤中可培養(yǎng)放線菌資源進(jìn)行了分離、培養(yǎng)和鑒定，共獲得了含蓋5個(gè)目、6個(gè)科、10個(gè)屬的109株可培養(yǎng)放線菌菌株，其中有5個(gè)屬共17種放線菌菌株的16S rRNA基因序列與其模式菌株相似性低于99%，可能是屬于潛在的新種[19-20].在獲得的可培養(yǎng)放線菌菌株中，鏈霉菌屬(Streptomyces)的物種數(shù)量最多，種類最豐富，占可培養(yǎng)的放線菌總數(shù)量的72.48%，說(shuō)明鏈霉菌屬是福建武夷山地區(qū)土壤中可培養(yǎng)放線菌的優(yōu)勢(shì)菌群.劉闖等[21]從河南省不同地區(qū)的潮土、黃棕壤、水稻土、褐土、鹽堿土5種土壤中共分離了17個(gè)屬的955株放線菌，其中鏈霉菌屬株751株，占比達(dá)到78.64%，這與本研究的72.48%相近；17個(gè)屬中，放線菌屬(Actinomycete)、馬杜拉放線菌(Actinomadura)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、擬無(wú)枝菌酸菌(Amycolatopsis)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、原小單孢菌屬Promicromonaspora)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)、鏈孢子囊菌屬(Streptosporangiaceae)、紅球菌屬(Rhodococcus)、絲菌屬(Saccharothrix)、嗜酸鏈霉菌屬(Streptacidiphilus)11個(gè)屬本研究未分離獲得，但不包括本研究分離的節(jié)桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、類節(jié)桿菌屬、中華單胞菌屬、擬諾卡氏菌屬.在貴州省多地的不同土壤中分離獲得的4屬共48種可培養(yǎng)放線菌中，鏈霉菌屬占比高達(dá)85.42%,小單孢菌屬占比 6.25%,諾卡氏菌屬和類諾卡氏菌屬皆占比4.17%[22].而在廣西北侖河口紅樹(shù)林根際土壤中獲得的鏈霉菌屬則是該地區(qū)的第二優(yōu)勢(shì)放線菌屬，占比為24.50%，低于占總放線菌數(shù)量50.00%的小單孢菌屬[23].表明可培養(yǎng)鏈霉菌屬?gòu)V泛分布于不同地區(qū)的獨(dú)特土壤類型中，對(duì)土壤環(huán)境具有高度適應(yīng)性，但其在土壤中的含量可能還受到例如植被根際凋落物等外部環(huán)境的影響.而土壤中的可培養(yǎng)稀有放線菌屬的分布則因地域和土壤環(huán)境而異，在跨度不同的地域土壤中可培養(yǎng)稀有放線菌屬具有明顯差異.多樣性分析結(jié)果表明武夷山不同樣地的放線菌含量和多樣性差異明顯.通常，海拔梯度、植被類型和有機(jī)質(zhì)等土壤性質(zhì)的組成被認(rèn)為是影響放線菌分布的重要因素，不同海拔的植被類型能夠通過(guò)調(diào)節(jié)土壤結(jié)構(gòu)和有機(jī)質(zhì)組成來(lái)間接影響土壤微生物群落多樣性[24-28].追加有機(jī)肥的茶園土壤和具有混交植被類型的土壤中充足和多樣的土壤有機(jī)質(zhì)組成促進(jìn)了這些樣地的可培養(yǎng)放線菌多樣性，而單一植被類型形成的單一類型土壤有機(jī)質(zhì)的樣地中可培養(yǎng)放線菌多樣性較低[28].除了一些受人為活動(dòng)影響較大的土壤樣地外，大部分低海拔樣地土壤中可培養(yǎng)放線菌的多樣性均高于高海拔樣地.因?yàn)榈秃０蔚臏睾蜌夂驐l件更有利于土壤放線菌降解和利用土壤有機(jī)質(zhì)，而高海拔地區(qū)高濕低溫的環(huán)境會(huì)抑制土壤放線菌的有機(jī)質(zhì)降解活性，不利于土壤放線菌生存[27].然而，人為活動(dòng)較為頻繁的低海拔樣地中的可培養(yǎng)放線菌多樣性降低的原因可能和生態(tài)環(huán)境被破壞有關(guān).

不同放線菌物種具有功能多樣性.與已有報(bào)道的菌株進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)本研究中獲得的放線菌菌株可能也具有多種不同的潛在功能.如永樂(lè)禪寺(YLCS)名木古樹(shù)根際土壤中分離到的與產(chǎn)水鏈霉菌(Streptomyceshydrogenans)相似的T1菌株，可能具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)光合色素和生物防治等潛在功能[29]；而在該樣地土壤中獲得的另外一株菌株E7則與維吉尼亞鏈霉菌(Streptomycesvirginiae)NRRL ISP-5094相近，可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用的維吉尼亞霉素[30]；于洋莊三渡(YZSD)土壤中分離到的S52菌株與StreptomyceskanasensisZX01[31]和無(wú)環(huán)鏈霉菌(Streptomycesanulatus)NRRL B-2000[32]等菌株相近，可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)病毒等具有較強(qiáng)抗性的次生代謝物；五曲河(WQH)附近分離到的L12菌株與白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)NBRC13014相近，可能會(huì)產(chǎn)生類似于阿維諾內(nèi)酯的具活性的丁烯內(nèi)酯化合物[33]；三仰峰針闊混交林(SYF-ZK)土壤中獲得的與產(chǎn)二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)ATCC 23877相近的W38菌株，可能具有治療和預(yù)防各種人體病原菌感染的功能[34]；在燕子窠(YZK)茶園土壤獲得的與突尼斯鏈霉菌(Streptomycestunisiensis)CN-207[35]相近的S53菌株可能是一種新代謝物的來(lái)源.除鏈霉菌外，在福建武夷山地區(qū)分離得到的其他土壤放線菌可能同樣具有重要的價(jià)值，如獲得的部分類諾卡氏菌屬菌株可能具有降解異戊二烯等的功能的完整異戊二烯單加氧酶基因簇[36].此外，激活鏈霉菌沉默生物合成基因簇，可望對(duì)獲得的未知功能菌株中所含有潛在抗性等功能基因進(jìn)行研究和應(yīng)用，也是當(dāng)下放線菌研究的熱點(diǎn)[37].因此，本次分離到的菌株可能具有成為重要微生物資源的潛在價(jià)值，但其功能和用途還有待進(jìn)一步研究和探討.

傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法在微生物研究中仍然是一種非常重要的技術(shù)手段，它可直接獲得菌種資源及微生物的形態(tài)、生理特性和代謝功能等信息，但純培養(yǎng)方法具有一定的局限性，可能無(wú)法完全地反映出地域或生境之間微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異[38-40].此外，不同環(huán)境來(lái)源的放線菌可能會(huì)對(duì)不同的培養(yǎng)基具有選擇性.因此，為最大化獲取不同環(huán)境的可培養(yǎng)放線菌物種，對(duì)分離所用的培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件還有待于進(jìn)一步地優(yōu)化.同時(shí)，本次研究點(diǎn)位有限，菌株的培養(yǎng)分離、篩選和鑒定工作量大，土壤中可能還有菌株未能通過(guò)純培養(yǎng)分離獲得.因此，為更全面了解土壤中放線菌物種，還有待于對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如高通量測(cè)序分析等作進(jìn)一步較全面的分析.