毛囊間充質干細胞的研究進展

賴惠君，楊嵐，游馥榕，馬萍萍，郭紅衛(wèi)

1.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院皮膚科，廣東 湛江 524003；2.廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 524023；3.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，廣東 湛江 524000

哺乳動物的皮膚包含三個自我更新的隔室，包括毛囊、皮脂腺和毛囊間表皮，其中含有多種不同類型的多能干細胞[1]。而來源于毛囊隆突和毛乳頭的間充質干細胞，具有成骨、成軟骨和成脂分化的潛力，稱為毛囊間充質干細胞(hair follicle mesenchymal stem cells, HFMSCs)[1]。HFMSCs是一類具有自我再生能力、高度增殖潛能、可多向分化且來源豐富的慢周期標記滯留細胞[2]，包括來自毛囊隆突部的毛囊干細胞(hair follicle stem cells, HFSCs)和表皮神經(jīng)嵴干細胞 (epidermal neural crest stem cells，EPI-NCSCs)，來自真皮乳頭的毛乳頭細胞(dermal papilla cells,DPCs)和皮膚源性前體細胞 (skin-derived precursors，SKPs)[3]，黑素細胞干細胞(melanocyte stem cells,McSCs)和角質形成細胞干細胞(keratinocyte stem cells，KSCs)，可形成表皮、毛囊和皮脂腺，并有助于損傷后表皮的再生[4]。生理性或病理性脫發(fā)是由于以HFSCs和DPCs為代表的兩種類型的毛發(fā)干細胞的改變，HFSCs和DPCs的激活及再生，為適當?shù)念^發(fā)恢復和再生提供了條件[5]。

1 HFMSCs種類及特性

1.1 毛囊間充質干細胞(HFSCs)

HFSCs是位于毛囊隆突部的上皮來源的干細胞，表現(xiàn)為未分化的慢周期細胞，可以誘導形成毛囊和皮脂腺等結構，幫助皮膚損傷后表皮再生[6]。HFSCs也可以分化為神經(jīng)細胞、角質形成細胞、膠質細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和黑素細胞[7]。HFSCs表達特異性標志物，包括細胞角蛋白(CK)15、CK19、LGR5、CD34、CD200、巢蛋白(Nestin)和PHLDA1[8]。準確認識它們的功能與定位有助于對HFSCs的識別和篩選(圖1)。干細胞的通用標志物巢蛋白(一種中間絲蛋白)既可以作為 HFSCs 的標志物，也可以作為神經(jīng)干細胞的標志物[9],提示為了提高HFSCs檢測的準確性，應聯(lián)合多種標志物標志鑒定。

圖1 休止期毛囊中干性基因的表達及毛囊間充質干細胞的定位。毛囊間充質干細胞包括來自毛囊隆突部的毛囊干細胞、來自真皮乳頭的毛乳頭細胞和角質形成細胞干細胞等，可形成表皮、毛囊和皮脂腺，并有助于損傷后表皮的再生。毛囊間充質干細胞位于不同毛囊部位如毛囊間表皮、漏斗部、皮脂腺開口處、毛囊上隆突部、隆突部、毛芽和真皮乳頭，表達特異性分子標志物

1.1.1 CK15 CK15被認為是目前人類毛發(fā)隆突干細胞最具特異性的標志物之一，它是由外毛根鞘中的一部分角質形成細胞表達的一種Ⅰ型角蛋白[10]。HFSCs在毛發(fā)周期的各個階段都選擇性地表達CK15，CK15被廣泛用作成體HFSCs的生物標志物。目前最常用于檢測CK15的抗體有兩個：C8/144B單克隆抗體(最初被提出能針對T細胞蛋白CD8羧基末端肽，后來研究表明能夠識別CK15的堿基)和LHK15單克隆抗體(一種針對CK15多肽中最后17個氨基酸的單克隆抗體)[11]。C8/144B單克隆抗體優(yōu)先染色毛囊隆突的角質形成細胞，而不會染色其他毛囊隆突細胞。而LHK15抗體可以染色毛囊峽部區(qū)域以及整個毛囊的外毛根鞘(outer root sheath,ORS)，但不識別T細胞。

1.1.2 Lgr5 Lgr5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, 也稱為Gpr49)是一種富含亮氨酸重復序列的參與Wnt信號通路的G 蛋白偶聯(lián)受體，已被確定為毛囊干細胞的標志物，它在隆突下部和毛芽中都有表達。Lgr5在毛囊發(fā)育早期和整個毛囊形態(tài)發(fā)生中表達[12]，Lgr5+干細胞在毛囊生長期早期增殖活躍，在整個毛囊周期中均有表達，在外毛根鞘和毛球的生長中發(fā)揮重要作用。有研究表明Lgr5+HFSCs是響應毛囊生長期起始信號的第一個激活的干細胞群，提示Lgr5足以驅動毛囊再生[13]。

1.1.3 CD34 CD34被視為一個常見的祖細胞標記物，是人類造血干細胞的主要標志物，毛囊干細胞、上皮祖細胞和間充質干細胞等多種細胞也表達CD34。值得注意的是，CD34在小鼠和人類之間的表達有差異，CD34在小鼠隆突細胞中特異性表達，而表達于人類毛囊隆突下部的ORS[14]。提示CD34可以作為小鼠隆突干細胞的特異性標記物，而不適合作為人類隆突部HFSCs的標記物。

1.2 毛乳頭細胞(dermal papilla cell,DPCs)

毛囊內(nèi)誘導和調(diào)節(jié)毛發(fā)生長以及新毛囊形成的另一種干細胞是DPCs。DPCs起源于中胚層，是一種特殊的間充質干細胞，存在于毛囊底部的毛乳頭(dermal papilla)中。堿性磷酸酶(ALP)是DPCs獨特的標志物，在人類和小鼠毛囊中都有表達，其表達與DPCs活性相關。此外，在DPCs中已觀察到α-平滑肌肌動蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、多功能蛋白聚糖(versican)、絲氨酸蛋白酶(corin)和CD133的表達[15](圖1)。

當毛囊的下半部分被移除后，毛球不會再生[16]。位于毛囊下部的DPCs和真皮鞘細胞在適宜的環(huán)境條件下可以誘導毛球的發(fā)生。提示DPCs信號系統(tǒng)可以誘導角質形成細胞來源的隆突干細胞(主要為HFSCs)增殖和隨后啟動生長期毛囊生長[16]。HFSCs與DPCs在體外可大量擴增，均顯示出良好的自我增生能力，它們相互作用還能夠促進毛囊再生和新生，這表明HFSCs與DPCs是產(chǎn)生完整毛囊結構的理想的“種子細胞”[16]，是毛發(fā)再生細胞工程和細胞替代治療的潛力候選者。

1.3 表皮神經(jīng)嵴干細胞 (EPI-NCSCs)和皮膚源性前體細胞(SKPs)

成人毛囊的表皮含有多能神經(jīng)嵴干細胞，起源于胚胎神經(jīng)嵴并存在于毛囊隆突中，稱為表皮神經(jīng)嵴干細胞 (epidermal neural crest stem cells，EPI-NCSCs)[17]。EPI-NCSCs代表了一種新型的多能成體干細胞，是一種通過體外不對稱細胞分裂進行自我更新的標記物保留細胞。表達巢蛋白、Sox10和未成熟的神經(jīng)嵴細胞標志物，具有定向分化為神經(jīng)元、施旺細胞、黑素細胞、平滑肌細胞和軟骨細胞的能力[17]。EPI-NCSCs分化的細胞表達神經(jīng)元特異性標志物β-Ⅲ微管蛋白、GABA能神經(jīng)元標記物谷氨酸脫羧酶 67 (GAD67)、少突膠質細胞標記物RIP 或髓鞘堿性蛋白 (MBP) 。不僅如此，EPI-NCSCs及其后代細胞可永久性表達β-半乳糖苷酶，因此β-半乳糖苷酶被認為是神經(jīng)嵴細胞的遺傳性標志[17]。

與此同時，有研究報道了來自面部皮膚和胡須毛囊的真皮乳頭的另一種神經(jīng)嵴起源的細胞群[18]，稱為皮膚源性前體細胞 (skin-derived precursors，SKPs)。與來自毛囊隆突部的EPI-NCSCs不同，SKPs的Sox10和p75表達陰性，而表達其他特征性神經(jīng)嵴標記物如巢蛋白、纖連蛋白、波形蛋白、多功能蛋白聚糖和神經(jīng)嵴干細胞的三種特定轉錄因子(Pax3、Snail和Slug)。與EPI-NCSCs相似，SKPs也可以分化為神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和脂肪細胞，而且還可以誘導毛囊形態(tài)發(fā)生。這提示來源于皮膚的EPI-NCSCs和SKPs可以潛能地為神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如脊髓損傷)提供一種可獲得的、豐富的、多能的來源。然而，從生理環(huán)境中提取的SKPs，它們產(chǎn)生功能性毛囊的能力會隨著時間的推移而降低，同時維持SKPs特性、自我更新和增殖所必需的關鍵信號通路仍不清楚[19]。

1.4 黑素細胞干細胞(McSCs)

McSCs是一類起源于神經(jīng)嵴的不成熟的自我更新的干細胞，McSCs存在于休止期毛囊的 CD34+的隆突部和 CD34-的毛芽區(qū)域。CD34-的McSCs更有效地產(chǎn)生色素沉著，而 CD34+的McSCs 選擇性地表現(xiàn)出髓鞘化神經(jīng)元的能力。McSCs通常處于靜止狀態(tài)，但會隨著毛發(fā)周期循環(huán)激活或分化并遷移，隨后分化為成熟的黑素細胞，為毛囊提供黑色素。最近的研究表明，生理性白發(fā)是McSCs逐漸喪失的結果，急性應激誘導、交感神經(jīng)驅動McSCs過度或者加速增殖[20]，提示體干細胞的維持直接受到生物體整體生理狀態(tài)的影響。

1.5 角質形成細胞干細胞(KSCs)

Barrandon和Green通過克隆分析證明了人KSCs的存在，并發(fā)現(xiàn)具有不同增殖能力的三種克隆類型的角質形成細胞，即KSCs(全克隆，具有很高的增殖能力，且表達高水平的干細胞標志物，如β1整合素和K14)、瞬時擴增細胞(部分克隆，具有中等增殖能力)和分化細胞(副克隆，具有非常有限的有絲分裂潛力，并表達高水平的終末分化標志物，如 Inv)。這表明KSCs在維持表皮更新和表皮穩(wěn)態(tài)上起著關鍵作用[21]。

表皮中有三個KSCs池，分別是毛囊間表皮的基底層、毛囊隆突部ORS以及皮脂腺。在毛囊間表皮的基底層，KSCs被其直接后代瞬時擴增細胞包圍，瞬時擴增細胞由KSCs的不對稱分裂產(chǎn)生。應用KSCs的α6整合素高表達和轉鐵蛋白受體CD71低表達的特性，利用流式細胞儀或者細胞黏附法可以快速分選富集KSCs[22]。與HFSCs的多向分化不同，KSCs僅分化為角質形成細胞。

2 HFMSCs的活化

HFMSCs在其生命的絕大多數(shù)時間內(nèi)都處于靜止期，而毛發(fā)周期可以驅動活化它們。毛發(fā)周期貫穿毛囊的一生，包括生長期、退行期和休止期。在生長期，隆突部的干細胞保持在其生態(tài)位內(nèi)自我再生(多次分裂)，從而擴大干細胞池。而毛基質中的干細胞分裂旺盛，分化為毛囊表皮祖細胞，向上遷移形成毛囊內(nèi)毛根鞘并產(chǎn)生成熟的毛干。進入退行期，毛基質細胞發(fā)生凋亡，隆突部的干細胞向下移動到毛基質區(qū)域，這些細胞增殖分化形成新的毛基質。在退行期結束時，這些新的毛基質于發(fā)干周圍形成另一個新的隆突，在舊的隆突下形成另一個生發(fā)基質——毛芽[23]。毛芽是一組從隆突延伸出來并位于隆突下方的P-鈣粘蛋白陽性角質細胞來源的細胞，它在形態(tài)上與胚胎毛芽相似，因此得名。

毛芽和HFSCs是下一個毛囊產(chǎn)生的必要元素。毛芽接收來自真皮乳頭的DPCs的細胞信號，在休止期被激活，隆突部干細胞HFSCs的活化發(fā)生在毛芽活化之后。HFSCs在休止期保持靜止狀態(tài)，在休止期向生長期過渡時，干細胞活化或者移動，形成生發(fā)骨架細胞池[24]。即隆突部的HFSCs在生長期開始增殖，并再生新的下一級毛囊，而在其他時期均保持靜止狀態(tài)。HFSCs 作為皮膚及其毛囊組織中心，通過信號傳導組織其周圍生態(tài)位，在成人皮膚及毛囊穩(wěn)態(tài)的各個階段為生態(tài)位重塑提供豐富的信號輸出[24]。

3 調(diào)節(jié)毛囊間充質干細胞活化的生物分子途徑

真皮乳頭、毛芽和隆突之間的分子相互作用是偶發(fā)毛囊再生的核心。毛囊形態(tài)的發(fā)生取決于Wnt、Shh、Notch以及骨形成蛋白(BMP)在表皮形成細胞與間充質細胞之間的相互作用。成人表皮中經(jīng)典Wnt途徑的持續(xù)激活會誘導現(xiàn)有毛囊的生長以及新毛囊的形成，BMP信號參與毛囊形態(tài)發(fā)生和HFSCs的循環(huán)再生，Shh信號控制毛囊的再生和晚期分化，而Notch信號則決定干細胞命運。 這表明Wnt與Shh、Notch及BMP等信號通路之間的協(xié)同和拮抗作用在干細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、表皮發(fā)育和毛囊再生過程中發(fā)揮至關重要的作用，這些途徑的失調(diào)可能導致毛發(fā)生長異常(如雄激素性脫發(fā)和斑禿)或者皮膚腫瘤的發(fā)生。

3.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin信號傳導是促進HFSCs活化并維持毛囊生長的重要調(diào)控途徑之一，它可以控制組織形態(tài)的發(fā)育，并充當調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移和極性等過程的生長因子。研究表明，Wnt10b可以通過 Wnt/β-catenin 信號通路促進毛囊生長和DPCs增殖[25]，而Wnt 配體減少或 Wnt 拮抗劑表達增加會誘導鼠毛囊周期的失調(diào)并導致脫發(fā)[26]。HFSCs中的自分泌Wnt信號傳導是維持其干細胞功能所必需的，Wnt/β-catenin通路是毛囊形態(tài)發(fā)生過程中的中樞信號通路。

3.2 BMP信號通路

成熟毛囊中，HFSCs保持靜息狀態(tài)受到BMP信號的嚴格控制。休止期，隆突內(nèi)部的外毛根鞘細胞分泌高水平的BMP6和成纖維細胞生長因子18(FGF18)，真皮成纖維細胞表達BMP4，皮下成熟脂肪細胞表達BMP2，這些均作為抑制信號，使HFSCs保持靜息狀態(tài)[27]。而在接近休止期末期時，真皮宏觀環(huán)境會降低BMP的表達，分泌頭蛋白(Noggin，是BMP信號傳導的有效抑制劑，拮抗BMP介導的β-catenin抑制作用)、FGF-7、FGF-10和TGF-β2，下調(diào)BMP4和BMP2；DPCs關閉HFSCs中的BMP信號傳導，開放Wnt/β-catenin信號傳導，促進生長期的發(fā)生。如果隆突相鄰的毛乳頭細胞消融，則靜止期毛囊不會再次進入毛發(fā)周期[28]，提示毛乳頭細胞在毛囊干細胞激活及毛發(fā)再生中的必要性。

在表皮發(fā)育過程中，Wnt信號傳導獨立或協(xié)同其它信號傳導途徑，激活HFSCs并啟動毛囊的循環(huán)再生。而BMP抑制經(jīng)典Wnt激活途徑， Wnt-BMP信號交互作用是基底層角質形成細胞發(fā)育和毛囊生長周期維持必需的調(diào)節(jié)軸[29]。

3.3 Shh(sonic hedgehog)信號通路

Shh信號傳導是Wnt/β-catenin信號傳導的下游通路，Shh可通過上調(diào)真皮頭蛋白的表達促進毛囊生長期發(fā)生。毛囊DPCs與外毛根鞘細胞在生長期表達Gli2(glioma-associated oncogene) 因子，Gli2作為Shh信號通路的中間轉錄因子[30]，控制細胞周期調(diào)節(jié)因子的轉錄以促進增殖，在上皮穩(wěn)態(tài)及皮膚毛囊發(fā)育中起著關鍵作用，Shh信號通路的激活可誘導靜止干細胞增殖和毛發(fā)形態(tài)發(fā)生[31]。近期研究發(fā)現(xiàn)皮膚立毛肌和交感神經(jīng)形成一個雙組分生態(tài)位，調(diào)節(jié)HFSCs活動，HFSCs子代細胞分泌Shh信號調(diào)節(jié)這種立毛肌-交感神經(jīng)生態(tài)位的形成，控制成人毛囊的再生[28]，提示Shh信號可以調(diào)節(jié)HFSCs的交感神經(jīng)支配，維持這種神經(jīng)-干細胞相互作用。

3.4 Notch信號通路

真皮Wnt途徑上調(diào)Notch表達，Notch 信號在多種發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮作用，包括干細胞自我更新和決定細胞命運[32]。在毛囊間表皮(IFE)中，僅在一些增殖的基底層細胞檢測到核β-catenin，而Notch1主要在分化的基底上層中表達。Notch受體與其配體結合后激活HFSCs，促進毛囊從靜止期向生長期轉化， 參與毛發(fā)周期調(diào)節(jié)[32]。Notch1 對于胚胎發(fā)生過程中及出生后的毛囊發(fā)育后期及毛發(fā)穩(wěn)態(tài)維持至關重要，消融毛囊中的Notch1會導致生長期縮短和過早進入退行期[32]。Notch1耗竭會引起毛囊間表皮中Wnt/β-catenin信號上調(diào)，將Wnt/β-catenin信號激活限制在表皮基底層。因此，Notch1也可以抑制Wnt/β-catenin信號通路，Wnt和Notch信號之間的協(xié)同和拮抗作用似乎決定了皮膚表皮細胞的命運[33]。

4 結語及展望

利用患者自身細胞的可用性和安全性，避免了昂貴的體外細胞控制和細胞擴增，以及符合良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)設施的需求，因此，對于毛囊間充質干細胞治療的研究成為熱點。理解毛囊中各類間充質干細胞如何參與毛發(fā)生長是闡明脫發(fā)疾病機制的先決條件；認識HFSCs生物分子途徑在毛發(fā)再生中的作用機制,有利于為脫發(fā)疾病治療提供新的線索。然而，由于目前HFSCs的制備技術仍不成熟，其標記物仍缺乏特異性，各種細胞信號途徑在不同類型脫發(fā)中的作用機制尚未完全闡明，培養(yǎng)的人毛囊間充質干細胞能否確實在人脫發(fā)頭皮中生成新的毛囊尚不穩(wěn)定，因此HFSCs在促進毛發(fā)再生的臨床應用中一直沒有令人滿意的結果。但基于干細胞的無限自我更新能力和多譜系差異潛力，隨著細胞治療、基因治療和組織工程的深入研究，相信干細胞在脫發(fā)治療中的應用指日可待。