初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病患者皮損表面的微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化

張嘉, 張凱云, 陳濤, 趙娟, 王紅梅, 薛迎芳, 張國(guó)惠

1.包頭市中心醫(yī)院，2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，包頭 內(nèi)蒙古 014040

銀屑病是環(huán)境和遺傳共同作用的非傳染性、慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為紅斑基礎(chǔ)上的鱗屑、斑片、斑塊皮損，病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加速，角化過(guò)度或角化不全[1]。銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖并且伴隨炎癥浸潤(rùn)，可導(dǎo)致皮膚菌群失調(diào)及機(jī)體免疫耐受性下降，誘發(fā)銀屑病加重或發(fā)作[2]。部分銀屑病患者在皮損出現(xiàn)前有前驅(qū)的上呼吸道感染癥狀，同時(shí)在鼻咽處發(fā)現(xiàn)細(xì)菌與病毒的異常分布[3-4]，提示銀屑病發(fā)病可能與微生物菌群失調(diào)有關(guān)。隨著基因組學(xué)理論與技術(shù)的高速發(fā)展，16S rDNA測(cè)序技術(shù)已成熟運(yùn)用于銀屑病患者微生物菌群結(jié)構(gòu)分析中[5]，銀屑病患者腸道菌群已被證實(shí)出現(xiàn)明顯的微生物菌群失調(diào)[6]。

為進(jìn)一步探究銀屑病發(fā)病與皮膚表面微生物菌落失調(diào)之間是否具有直接或間接的關(guān)系，本研究采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病患者皮損表面菌群結(jié)構(gòu)，探究銀屑病患者皮損表面菌群組成與銀屑病發(fā)病的相關(guān)性，明確上呼吸道感染是否能夠影響點(diǎn)滴型銀屑病患者皮損表面微生物的結(jié)構(gòu),希望通過(guò)探究銀屑病發(fā)病與皮膚表面微生物菌落失調(diào)之間的關(guān)系，形成以微生物穩(wěn)態(tài)糾正為靶點(diǎn)的治療方向。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

納入2020年12月至2021年6月于包頭市中心醫(yī)院皮膚科就診的初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病的患者18例，點(diǎn)滴型銀屑病確診標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床表現(xiàn)：浸潤(rùn)性粟米至蠶豆大、表面附有白色鱗屑的丘疹、斑丘疹，散在或密集分布， Auspitz征陽(yáng)性。② 皮膚鏡下出現(xiàn)銀屑病特征性表現(xiàn)(亮紅色背景，點(diǎn)狀血管或小球狀血管，血管一致性分布，可見(jiàn)白色鱗屑，出現(xiàn)環(huán)狀血管或者發(fā)夾樣血管為特異診斷)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病且診斷為點(diǎn)滴型銀屑病的患者；②年齡5～65歲;③近2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用任何抗生素、免疫抑制藥物和糖皮質(zhì)激素者，1 周內(nèi)未外用抗生素;④24 h 內(nèi)未沖澡或搓澡；⑤否認(rèn)其他器質(zhì)性疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患有其它皮膚性疾病、近期有皮膚創(chuàng)傷或感染未愈者;② 患有糖尿病、肝病、腎病等其他可能導(dǎo)致皮膚表面微生物菌群改變者。將18例銀屑病患者按照是否伴隨上呼吸道感染分為上呼吸道感染實(shí)驗(yàn)組(銀屑病上感組，9例)、非上呼吸道感染實(shí)驗(yàn)組(銀屑病非上感組，9例)。對(duì)照組選取同年齡段9例健康人。三組年齡(F=0.13,P=0.876)、性別(F=0.14,P=0.872),銀屑病上感組與非上感組病程(t=0.88,P=0.391)比較，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，具有可比性?；颊呔炇鹬橥鈺?，研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

表1 三組一般資料Table 1 Characteristics of the three groups

1.2 主要試劑

DNA抽提試劑盒(Thermo Scientific)，Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs)，Gene JET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 用無(wú)菌水潤(rùn)濕無(wú)菌棉簽，加壓順時(shí)針?lè)较虿潦密|干、四肢紅色皮疹處，每次擦拭時(shí)間不小于30 s，擦拭后將無(wú)菌棉簽放入無(wú)菌離心管中，將離心管置于-20 ℃冰箱中保存。對(duì)照組取材部位及方法與患者組一致。

1.3.2 樣本DNA的提取 采用CTAB法提取皮膚表面微生物DNA，在360 nm 紫外燈下觀察電泳條帶情況，檢測(cè)所提取DNA的純度和濃度。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增和純化 取適量的上述基因組DNA樣品于離心管中，加入無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。選擇16S V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序，引物為515F-806R，515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR 反應(yīng)體系30 μL：Phusion Master Mix(2×) 15 μL，Primer(2 μM) 3 μL(6 μM)，gDNA(1 ng/μL) 10 μL(5-10 ng)，H2O 2 μL；反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃，10 s,50 ℃，30 s,72 ℃，30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。使用2%瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，使用Thermo Scientific公司Gene JET膠回收試劑盒，處理目標(biāo)條帶，收集PCR 產(chǎn)物。

1.3.4 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行構(gòu)建，采用Qubit進(jìn)行定量和文庫(kù)檢測(cè)，文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將有效序列按照97%相似性進(jìn)行Operational Taxonomic Unit聚類[7]，組內(nèi)物種差異采用α多樣性分析[8]，組間物種差異采用β多樣性分析[9]，組間具體物種分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTU 聚類分析

將有效序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)OTU聚類結(jié)果共有6 596條，其中門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)分別發(fā)現(xiàn)80、145、314、502、 1 192、672種。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果制作韋恩圖,可見(jiàn)三組樣本中含有相同物種，也含有該組的特有物種(圖1)。

圖1 維恩圖

繪制初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病上感組、非上感組、正常人群對(duì)照組三組在門水平物種相對(duì)豐度柱形圖(圖2)，可見(jiàn)優(yōu)勢(shì)物種為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，上述三組的前三優(yōu)勢(shì)物種豐度分別為厚壁菌門 19.65%、32.68%、20.29%;變形菌門分別為46.13%、32.39%、39.14%;放線菌門分別為26.31%、26.10%、32.67%，三組間優(yōu)勢(shì)門物種豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(厚壁菌門、變形菌門、放線菌門P值分別為0.056、0.065、0.320)。由三組間在屬水平物種相對(duì)豐度柱形圖(圖3)可見(jiàn)，細(xì)菌豐度由高到低的前9名分別為棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、葡萄球菌(Staphylococcus)、Allorhizobium-neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微球菌屬(Micrococcus)、棲水菌屬(Enhydrobacter)、丙酸桿菌屬(Cutibacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus),而鏈球菌屬(Streptococcus)排第12位。

圖2 門水平上物種相對(duì)豐度柱形圖

圖3 屬水平上物種相對(duì)豐度柱形圖

2.2 屬水平豐度聚類

根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取了豐度排名前35的屬，繪制成熱圖(圖4)。橫向觀察該圖，初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病上感組優(yōu)勢(shì)物種為假單胞菌屬、棲水菌屬、考克氏菌屬(Kocuria)、異常球菌屬(Deinococcus)、芬戈?duì)柕戮鷮?Finegoldia)；初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病非上感組優(yōu)勢(shì)物種為嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、Turicibacter、芽孢桿菌屬(Bacillus)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、微球菌屬、副球菌屬(Paracoccus)、Sandaracinobacterium、Jeotgalicoccus?？v向觀察該圖可見(jiàn)，每個(gè)樣本在屬水平優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度大小均不同。

圖4 物種豐度聚類熱圖

2.3 α多樣性分析

采用Alpha Diversity進(jìn)行組內(nèi)樣本物種多樣性進(jìn)行分析。稀釋曲線檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)是否合理(圖5)，根據(jù)已抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)的指數(shù)值構(gòu)建曲線(cutoff=59852)，隨著隨機(jī)提取測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，后端曲線趨于平坦，本次實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)合理。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包含Observed-species、Chao1、

圖5 樣本稀釋性曲線

Shannon、Simpson、ACE和Goods-coverage指數(shù)。單因素方差分析3組間 α 多樣性，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (表2)。

2.4 Beta多樣性分析

采用Beta多樣性比較三組間微生物群落構(gòu)成，評(píng)估微生物群落間的差異。通過(guò)wilcox 秩和檢驗(yàn)分析三組組間物種Beta多樣性差異，箱形圖(圖6)展示如下，對(duì)照組與銀屑病上感組(P=0.003)、非上感組(P<0.05)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而銀屑病上感組與非上感組間無(wú)明顯差異(P=0.062)。

表2 α 多樣性指數(shù)的比較Table 2 Comparison of alpha diversity index

圖6 基于Unweighted Unifrac的 Beta多樣性箱形圖

考慮到皮膚表面微生物菌落結(jié)構(gòu)為生態(tài)結(jié)構(gòu)，采用無(wú)度量多維標(biāo)定法(non-metric multi-

圖7 基于Unweighted Unifrac的 NMDS分析

dimensional scaling,NMDS)對(duì)三組間物種組成進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(圖7)。結(jié)果顯示，正常組實(shí)驗(yàn)樣本較為聚類集中，銀屑病非上感組和上感組實(shí)驗(yàn)樣本較為分散，且聚集區(qū)域不同，說(shuō)明正常組微生物菌落結(jié)構(gòu)不同于初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病組。

2.5 組間差異性物種分析

正常組與銀屑病非上感組對(duì)比，在門水平，正常組Campylobacterota門豐度較高；在綱水平，正常組γ-變形菌綱豐度較高，在屬水平，正常組的丙酸桿菌屬、勞森菌屬(Lawsonella)、放線菌屬(Actinomyces)、Auricoccus-Abyssicoccus豐度較高。正常組與銀屑病上感組對(duì)比，在屬水平，正常組勞森菌屬豐度較高，銀屑病上感組未明確定義周蝶菌屬(unidentifiedWeeksellaceae)豐度較高；銀屑病上感組與非上感組對(duì)比，在綱水平，銀屑病上感組γ-變形菌綱豐度較高；在目水平，銀屑病上感組假單胞菌目(Pseudomonadales)豐度較高；在屬水平，銀屑病上感組棲水菌屬、假單胞菌屬豐度較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.05，表3)。

2.6 組間LEfSe分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證組間物種差異性，采用LEfSe(LDA Effect Size)分析銀屑病上感組、非上感組和正常組三組間物種豐度數(shù)據(jù)，尋找組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。將LDA閾值設(shè)置為4，發(fā)現(xiàn)LDA數(shù)值大于4的Biomarker有11個(gè)，初發(fā)急性點(diǎn)滴型銀屑病上感組與其他組對(duì)比具有極其顯著差異的物種為Gammaproteobacteria、Pseudomonadales、Enhydrobacter、Rhizobiales、Pseudomonadaceae、Pseudomonas；正常組與其他組對(duì)比具有極其顯著差異的物種為Dermabacteraceae、Brachybacterium、Propionibacteriaceae、Cutibacterium、Propionibacteriales；銀屑病上感組中未發(fā)現(xiàn)極其顯著差異的物種。LDA值分布柱狀圖見(jiàn)圖8，進(jìn)化分支圖見(jiàn)圖9。

表3 三組間皮膚表面微生物的豐度 (mean±SD)Table 3 The abundance of microorganisms on skin surface among three groups (mean±SD)

圖8 LDA值分布柱狀圖

圖9 進(jìn)化分支圖

3 討論

在銀屑病患者皮損表面微生物菌群分析中，Gao等[10]發(fā)現(xiàn)在門水平銀屑病患者皮膚放線菌門和變形菌門豐度下降，厚壁菌門豐度增加，在屬水平，鏈球菌屬和葡萄球菌屬豐度增加；而另有研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病患者皮損中放線菌門、變形菌門豐度增加[11]，研究結(jié)果的不同可能與取材方法不同相關(guān)。

本研究采用16S rDNA 測(cè)序初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病患者與健康人群皮膚表面微生物，發(fā)現(xiàn)正常組人群皮膚痤瘡桿菌屬豐度明顯高于銀屑病非上感組，與Fyhrquist[12]、Langan等[13]研究結(jié)果相似。丙酸痤瘡桿菌在銀屑病患者皮損表面的減少可能與抓撓皮膚相關(guān)，搔抓皮膚可破壞皮膚屏障，使病原菌進(jìn)入皮膚。在真皮深層甚至外周血液中都會(huì)發(fā)現(xiàn)一些表皮定植的細(xì)菌，它們與免疫細(xì)胞接觸，引起先天性和獲得性炎癥[14]。丙酸痤瘡桿菌是一種保護(hù)性共生菌，是皮膚微生物的重要組成部分，在皮膚動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用，是人類皮膚微生物群的哨兵[15]。在皮膚免疫中，丙酸痤瘡桿菌可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[16]，促進(jìn)體內(nèi)輔助性T細(xì)胞1型(Th1)細(xì)胞的激活[17]，清除細(xì)胞內(nèi)病原體，發(fā)揮丙酸痤瘡桿菌競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，抑制致病微生物的定植，從而起到保護(hù)皮膚作用。有研究在IB型和Ⅲ型丙酸痤瘡桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠產(chǎn)生抗菌肽的基因簇[18]，抗菌肽的出現(xiàn)可從一定程度上抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，起到皮膚屏障作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病非上感組放線菌屬和勞森氏菌屬豐度比正常人群低，而Weeksellaceae屬豐度較高，具體機(jī)制不明，上述菌屬與銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究目前停留在菌群差異方面[19-20]。 本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬在各組之間的差異性，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌可通過(guò)超抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化參與銀屑病發(fā)病，真皮層中的鏈球菌超抗原直接與人類白細(xì)胞抗原、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上的DR同種型分子(HLA-DR)結(jié)合，導(dǎo)致白介素-1和腫瘤壞死因子-α釋放，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，這可能引發(fā)或加劇銀屑病炎癥[21]。化膿性鏈球菌還可通過(guò)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原陽(yáng)性T細(xì)胞與表皮細(xì)胞的相互作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-9、IL-17A和IFN-γ，參與銀屑病發(fā)病過(guò)程[22]，推測(cè)這一差異性結(jié)論的出現(xiàn)可能與取材部位不同相關(guān)。

除上述細(xì)菌外，皮膚表面真菌的異常分布也可能參與銀屑病的發(fā)病過(guò)程，馬拉色菌是人體皮膚表面常見(jiàn)的一種真菌，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的釋放參與銀屑病的發(fā)病過(guò)程，馬拉色菌通過(guò)Toll樣受體2途徑觸發(fā)細(xì)胞因子IL-8的釋放[23]，IL-8可上調(diào)角質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、熱休克蛋白70和整聯(lián)蛋白的表達(dá)[24]，同時(shí)激活補(bǔ)體并募集中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向真皮遷移[25]，從而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，加速銀屑病發(fā)病進(jìn)程。馬拉色菌可下調(diào)Th2細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-4、IL-10及IL-13等細(xì)胞因子，參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制[26]。

本研究將初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病分為上呼吸道感染組和非上呼吸道感染組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，上呼吸道感染組棲水菌屬、假單胞菌屬豐度都較高，這兩個(gè)菌屬都屬于γ-變形菌綱，與Wang等[27]研究結(jié)果相似。提示在后續(xù)的銀屑病皮損微生物研究中應(yīng)該將銀屑病患者是否具有上呼吸道感染癥狀納入實(shí)驗(yàn)因素，將具有上呼吸道感染癥狀和不具有上呼吸道感染癥狀的患者分開(kāi)比較，可能更具科學(xué)性。

綜上所述，銀屑病患者皮損表面微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化，但具體原因不明，需進(jìn)一步研究銀屑病患者皮損表面微生物菌群穩(wěn)態(tài)變化，了解皮膚菌群失調(diào)是否為誘發(fā)或加重銀屑病發(fā)病的因素。在探討銀屑病發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整銀屑病患者皮損表面微生物菌群穩(wěn)態(tài)，可為銀屑病的治療帶來(lái)新的診療思路。