李超,鐘維,朱磊,黃鈺淇2,,李錦意,陳永鋒
1.深圳市慢性病防治中心,廣東 深圳 518020;2.廣東醫(yī)科大學(xué),廣東 湛江 524000;3.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東 廣州 510091
皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是全球人群中第二常見的皮膚惡性腫瘤,起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞。紫外線照射是公認(rèn)的重要危險(xiǎn)因素,其他還包括皮膚慢性潰瘍、光化性角化病等癌前病變、基因突變和免疫因素等[1]。CSCC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前研究涉及的相關(guān)基因通路較多,其中RTK通路作為增殖、分化的主要通路,已被明確作為CSCC的發(fā)病機(jī)制之一。Sprouty 2是RAS/絲裂原活化蛋白激酶(RAS/MAPK)信號(hào)通路中的特異性蛋白,在細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[2]。Ki-67是一種特殊增殖細(xì)胞核抗原,可間接反映腫瘤細(xì)胞的增殖,被廣泛用于乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤研究[3]。上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin, E-cad)是腔上皮細(xì)胞中經(jīng)典跨膜蛋白,通過內(nèi)吞和胞吐的空間調(diào)控作用參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性及細(xì)胞重排[4]。Sprouty 2在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用不盡相同,其在皮膚腫瘤中的研究極少[5],與CSCC是否有關(guān)至今未有報(bào)道。本研究通過分析CSCC中Sprouty 2的表達(dá)及其與E-cad和Ki-67的相關(guān)性,為探索Sprouty 2在CSCC發(fā)病中的臨床意義提供參考。
納入2018年3—7月在南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚科就診且病理診斷為高分化,即Broders分級(jí)Ⅰ級(jí)(未分化細(xì)胞占全部癌細(xì)胞比例<25%)~Ⅱ級(jí)(未分化細(xì)胞占25%~50%)的頭面部CSCC患者[6]。所有患者術(shù)前均未行放療、化療,未應(yīng)用免疫抑制劑、冷凍、激光等治療。排除標(biāo)準(zhǔn):炎癥性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病或其他嚴(yán)重的慢性系統(tǒng)性疾病患者。共納入15例患者作為病例組,其中男9例,女6例;年齡50~86(63.13±15.79)歲;病程3個(gè)月~10年。健康對(duì)照組10例,全部為南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院行頭面部整形手術(shù)的健康人,男女各5例,年齡33~77(57.30±10.07)歲。病例組與對(duì)照組的性別(P=0.70)和年齡(t=1.03,P=0.31)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究方案根據(jù)赫爾辛基宣言的原則設(shè)計(jì)和實(shí)施,并經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):2017028),受試者均簽署知情同意書。
兔抗人Sprouty 2多克隆抗體(一抗,ab85670,美國(guó)Abcam)、抗E-cad抗體(一抗,24E10,美國(guó)Cell Signaling)、抗Ki-67抗體(一抗,ARG53222,臺(tái)灣Arigo)、羊抗兔多克隆IgG抗體(二抗,ARG65351,臺(tái)灣Arigo)、抗GAPDH抗體(ab181602,美國(guó)Abcam)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time )(日本Takara)、SYBR Prime Ex TaqTM Ⅱ(日本Takara)。Nano Drop儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)、 Light Cycler 480 PCR儀(瑞士Roche)、iQ5多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。
1.3.1 標(biāo)本取材 所有受試者均在頭面部取材,手術(shù)切除所需標(biāo)本,大小約為10 mm×5 mm×3 mm,以癌灶標(biāo)本作為鱗癌組,以臨近癌灶的標(biāo)本作為癌旁組,以遠(yuǎn)離癌灶的標(biāo)本作為病例對(duì)照組,以健康人標(biāo)本作為健康對(duì)照組。每組標(biāo)本分成3份,1份制成蠟塊,另外2份裝無菌凍存管在液氮內(nèi)凍存。
1.3.2 免疫組化檢測(cè)組織標(biāo)本中Sprouty 2、E-cad和Ki-67的表達(dá) 取標(biāo)本蠟塊做4 μm厚度切片待用,脫蠟后置于3% H2O2溶液孵育10 min,隨后浸入1×抗原修復(fù)液中加熱20 min;分組滴加50 μL抗 Sprouty 2(1 ∶400)、E-cad(1 ∶400)和 Ki-67(1 ∶200)抗體,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次。滴加羊抗兔多克隆抗體(1 ∶500),37 ℃水浴20 min,PBS沖洗3次;顯色、復(fù)染后,于光學(xué)顯微鏡下觀察目的蛋白細(xì)胞定位及分布情況。用Image Pro軟件對(duì)陽(yáng)性染色部位進(jìn)行測(cè)量分析,計(jì)算平均光密度(AOD),AOD=累積光密度/面積。
1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)鱗癌組、癌旁組、病例對(duì)照組和健康對(duì)照組 Sprouty 2表達(dá) 提取組織總RNA:凍存組織稱重、研磨,加Trizol試劑裂解、氯仿萃取,離心后取上清并加入異丙醇混勻;再次離心,取白色沉淀物即組織總RNA;超純水溶解后用NanoDrop儀檢測(cè)RNA濃度,達(dá)標(biāo)后將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
qRT-PCR:以GAPDH為內(nèi)參照。Sprouty 2正向引物:5′-CCCCTCTGTCCAGATCCATA-3′,反向引物:5′-CCCAAATCTTCCTTGCTCAG-3′;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正向引物:5′-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3′,反向引物:5′-TCCACGATACCAAAGTTGTC-3′。采用20 μL反應(yīng)體系,在無RNA酶八聯(lián)管中分別加入10 μL SYBR Prime Ex TaqTM、1 μL cDNA、7 μL超純水、正反向引物各1 μL。擴(kuò)增條件95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。熒光融解得到融解曲線。以2-ΔΔCt表示基因mRNA表達(dá)水平。
1.3.4 Western blot檢測(cè)組織標(biāo)本中Sprouty 2和E-cad表達(dá) 提取凍存組織總蛋白后選擇10%二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠,加樣后恒壓電泳;轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜后再次恒流電泳;取出聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)至封閉液恒溫37 ℃搖床勻速搖60 min;取膜置于一抗稀釋液(Sprouty 2、E-cad抗體工作濃度均為1 ∶1 000,GAPDH抗體為1 ∶10 000)中過夜;次日加入羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)孵育60 min,暗房顯影。
采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間Sprouty 2 mRNA水平等比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn),兩兩比較采用Bonferroni法。Sprouty 2與E-cad、Ki-67相關(guān)性采用Pearson或Spearman相關(guān)分析法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果顯示,4組間Sprouty 2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=55.00,P<0.01);兩兩比較,鱗癌組Sprouty 2 mRNA表達(dá)低于癌旁組(Z=-4.12)、病例對(duì)照組(Z=-4.74)和健康對(duì)照組(Z=-4.22),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1)。
表1 各組皮膚組織中Sprouty 2 mRNA和蛋白以及E-cad、Ki-67蛋白的表達(dá)水平Table 1 Expression levels of Sprouty 2, E-cad and Ki-67 mRNA and protein in skin tissues of each group
圖1 Western blot檢測(cè)Sprouty 2和E-cad蛋白在各組皮膚組織中的表達(dá)
圖2 免疫組化檢測(cè)Sprouty 2、E-cad、Ki-67在鱗癌組、癌旁組、病例對(duì)照組及健康對(duì)照組皮膚中的表達(dá)(200×)
Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,Sprouty 2與E-cad呈正相關(guān)(r=0.59,P=0.021);Pearson相關(guān)分析顯示,Sprouty 2與Ki-67呈負(fù)相關(guān)(r=-0.59,P=0.022)。
CSCC是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一類惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,病因尚不明確,目前研究涉及的相關(guān)基因通路包括TP53通路、NOTCH通路、RAS通路、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)通路、SRC家族激酶通路、CDKN2A通路、核因子KB通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β通路和KNSTRN通路等[7]。在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)通路主要在器官形態(tài)形成和發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等方面發(fā)揮作用,過度或不受調(diào)控的RTK信號(hào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成、病理性新生血管形成和異常發(fā)育[8]。該通路由RAS-RAF-MEK-MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和PI3K-AKT通路調(diào)節(jié),這兩個(gè)通路由負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié),其中RAS-MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)增殖、分化中至關(guān)重要的信號(hào)通路[9]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,RAS原癌基因調(diào)控異常參與了小鼠化學(xué)致癌模型CSCC的發(fā)生[10-11]。此外,日光損傷皮膚(如日光性角化病)中也存在RAS突變,表明RAS突變可能是紫外線損傷引起癌前病變的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。通過分子分析、獨(dú)立驗(yàn)證集和功能研究分析發(fā)現(xiàn),接受BRAF抑制劑治療的黑素瘤患者發(fā)生的CSCC致癌突變中,以HRAS Q61L最常見,而HRAS Q61L突變株增殖與RAS-MAPK通路信號(hào)通路和ERK介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn),高遷移率盒1蛋白可通過增加p85 PI3K、AKT、p38和P42/44 MAPK的磷酸化水平,顯著激活PI3K/AKT和RAS-MAPK信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控CSCC轉(zhuǎn)移[14]。由上可知,RTK信號(hào)通路活化異常在CSCC的病理生理機(jī)制中扮演著重要角色。
Sprouty 2是RAS信號(hào)通路特異性抑制蛋白,可抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的ERK活化,也可抑制表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的AKT活化,從而抑制RTK通路,起到抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和血管生成的作用[2]。Sprouty 2在腎癌、骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤中的表達(dá)下調(diào),對(duì)腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用,已被作為判斷一些疾病如乳腺癌、肝癌的預(yù)后獨(dú)立因素[15-17]。相反,Dry等[18]發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞系的突變體可上調(diào)Sprouty 2進(jìn)而促進(jìn)惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展。Liao等[19]發(fā)現(xiàn)Sprouty 2在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)。Park等[20]發(fā)現(xiàn)Sprouty 2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表達(dá)上調(diào),并增加了腫瘤細(xì)胞的致瘤潛能??梢奡prouty 2在不同疾病中參與的角色并不完全相同,可與其他因子相互作用從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化,也可因自身基因突變促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。本研究通過免疫組化、Western blot和qRT-PCR發(fā)現(xiàn),相對(duì)于癌旁組、病例對(duì)照組和健康對(duì)照組,Sprouty 2在CSCC皮損中表達(dá)下調(diào),表明Sprouty 2與CSCC存在相關(guān)性,提示Sprouty 2可能抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,但其下調(diào)的具體機(jī)制目前尚不明確,有待進(jìn)一步研究。
E-cad被認(rèn)為是上皮癌侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制因子。在鱗狀細(xì)胞癌中,E-cad表達(dá)缺失是癌前病變進(jìn)展到轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的原因之一,并與轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[21-22]。So等[23]發(fā)現(xiàn)在人高分化漿液性卵巢癌中Sprouty 2與E-cad水平呈正相關(guān),并檢測(cè)到Sprouty 2位點(diǎn)缺失,過表達(dá)Sprouty 2可通過抑制EGF誘導(dǎo)的E-cad下調(diào)而抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲,揭示Sprouty 2在介導(dǎo)EGF對(duì)人卵巢癌進(jìn)展的刺激作用中發(fā)揮了重要的腫瘤抑制作用。本研究中E-cad在CSCC皮損中表達(dá)下調(diào),與Sprouty 2表達(dá)呈正相關(guān),與以上研究結(jié)果相符。Brouxhon等[24]研究發(fā)現(xiàn)紫外線引起的E-cad丟失與CSCC關(guān)系密切,E-cad細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域片段可與RTK相互作用,通過RTK磷酸化和MAPK/PI3K/AKT/mTOR途徑活化促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲,而Sprouty 2也可通過RTK通路參與腫瘤增殖、分化、遷移等活動(dòng),提示在CSCC中Sprouty 2與E-cad可能通過協(xié)同作用抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
Ki-67作為特殊的增殖細(xì)胞核抗原可間接反映腫瘤細(xì)胞的增殖。CSCC中Ki-67蛋白及mRNA水平均高于正常組織[25]。本研究亦發(fā)現(xiàn),Ki-67在CSCC皮損中表達(dá)量上調(diào),與Sprouty 2表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示Sprouty 2與Ki-67可能通過拮抗作用抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展。
綜上,本研究明確了Sprouty 2與CSCC的相關(guān)性,為今后以Sprouty 2作為CSCC生物學(xué)行為和治療有效性的生物學(xué)指標(biāo)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究方向。但是,Sprouty 2在CSCC發(fā)病機(jī)制中的作用仍需要深入探索,Sprouty 2是否通過對(duì)RTK通路發(fā)揮抑制作用參與CSCC發(fā)病,有待通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步求證。