梅毒螺旋體誘導(dǎo)巨噬細胞分泌的外泌體對巨噬細胞極化的影響

鄭春嬋，謝嘉豪，鄒銳濤，蔡桂月，羅素君，魏娜，李思銳，陳嶸祎

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

梅毒螺旋體(Treponemapallidum,Tp)侵入人體后機體啟動固有免疫反應(yīng)，巨噬細胞作為人體免疫系統(tǒng)的第一道防線，可通過抗體介導(dǎo)的吞噬作用清除病原體[1]。外泌體是一種直徑約40～160 nm的胞外多囊泡體，廣泛存在于任何體液中[2]，在細胞信息傳遞中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)Tp通過巨噬細胞衍生外泌體可以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細胞活化，上調(diào)細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達，促進單核細胞和白細胞的黏附[4]，提示Tp刺激巨噬細胞后分泌的外泌體(EXOTp)可能參與梅毒血管炎的致病過程。為了探究EXOTp對巨噬細胞極化的影響在梅毒發(fā)病中的作用，本研究觀察Tp誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生的EXOTp刺激后巨噬細胞的極化方向，為闡明梅毒的致病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 致病菌和細胞系 梅毒螺旋體Nichols株、人單核細胞白血病細胞株(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)均由南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 可調(diào)式微量移液器(德國Eppendorf)，超高速離心機(美國Beckman)，OLYMPUS DP71顯微照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS)，激光掃描共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS)，MasterCycler Gradient PCR儀(德國Eppendorf)，LightCycler 480ⅡDNA擴增儀(瑞士Roche)，電泳儀、水平電泳槽(美國Bio-Rad)，定量光度計(德國Eppendorf)，高速低溫臺式離心機(美國Thermo)，電子天平AUY120(日本SHIMADZU)，-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo)，電子恒溫搖床-MAXQ4000(美國Thermo)。苯甲酸雌二醇油劑(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，大豆油(深圳南順油脂有限公司)，澳洲胎牛血清(貨號：10099141，美國Gibco)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，葡萄糖(英國OXOID)，兔抗人CD9抗體、兔抗人AILX抗體、兔抗人HSP70抗體、兔抗人Annexin-5抗體、兔抗人TSG101抗體(美國abcam)，枸椽酸鹽緩沖液、PBS緩沖液(武漢BOSTER)，40%甲醛(西隴化工有限公司)，BSA(廣州化學(xué)試劑廠)，抗熒光淬滅封片液 (碧云天生物技術(shù)研究所)，RT試劑盒(編號：DRR037A，大連寶生物公司)，PCR試劑盒(編號：DRR820A，大連寶生物公司)，Trizol(美國Invitrogen)，DEPC(北京金鑫天佑生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 梅毒螺旋體準備 梅毒螺旋體Nichols株經(jīng)qRT-PCR計數(shù)后，于凍存液-80 ℃凍存，使用時直接室溫復(fù)蘇，選用PBS稀釋至目的濃度。

1.2.2 巨噬細胞培養(yǎng) THP-1細胞在RIPM 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)增長期時，收集所有THP-1細胞懸液，取10 μL滴于細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，離心棄上清液，將THP-1細胞沉淀在RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，THP-1細胞懸液5 mL加入60 mm細胞培養(yǎng)皿中，加入PMA(佛波酯)100 ng/mL，5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后，細胞貼壁，呈多角形，即分化為巨噬細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 外泌體提取 被PMA刺激分化的巨噬細胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2繼續(xù)孵育24 h。將梅毒螺旋體用PBS稀釋，按照30 ∶1的比例(Tp比巨噬細胞)加入接種有巨噬細胞的60 mm培養(yǎng)皿中感染24 h。梅毒螺旋體感染巨噬細胞24 h后，更換不含雙抗的RIPM 1640完全培養(yǎng)基。收集其后48 h的細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)4次高速離心，保留沉淀去除上清液，用100 μL PBS反復(fù)吹打沉淀制成外泌體懸液EXOTp，同時提取未經(jīng)梅毒螺旋體感染的巨噬細胞自身產(chǎn)生的外泌體EXO。

1.2.4 外泌體鑒定 ①透射電鏡觀察：吸取外泌體懸液15 μL于銅網(wǎng)上靜置1 min，用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體懸液吸干，吸取2%的醋酸雙氧鈾染色液15 μL室溫染色1 min，將染色完成的樣本放于燈下烤10 min，觀察拍照。②Western blot檢測,Bradford蛋白測定法檢測外泌體蛋白含量。外泌體中加入PRO-PREP?蛋白質(zhì)提取溶液裂解，SONICS超聲波細胞破碎儀超聲后，低溫高速離心5 min，保留上清去沉淀制成蛋白樣本。將制備的蛋白樣本混勻，取20 μg樣品在60 V恒壓電泳30 min，80 V恒壓電泳1 h,轉(zhuǎn)膜3 h。麗春紅染色驗證轉(zhuǎn)膜成功。洗凈膜，WB封閉液封閉1 h，TBS-T洗膜，重復(fù)3次。加入一抗(工作濃度1 ∶1 000)，室溫搖床孵育2 h，4 ℃過夜，TBS-T洗膜，重復(fù)3次。加二抗(工作濃度1 ∶5 000)，室溫搖床孵育2 h，TBS-T洗膜，重復(fù)3次。配制顯影液，在Azure C500多功能分子成像分析設(shè)備的曝光室內(nèi)進行檢測及拍照。以上操作均收集3次樣本進行重復(fù)實驗。③納米顆粒跟蹤分析技術(shù)定量測定外泌體：用去離子水清洗樣本池，聚苯乙烯微球(110 nm)校準儀器，以1×PBS buffer清洗樣本池，樣本以1×PBS buffer稀釋100倍，進行檢測。

1.2.5 巨噬細胞對外泌體內(nèi)化作用觀察 用熒光染料PKH67對外泌體避光染色10 min。將巨噬細胞接種至共聚焦小皿，加入染色后的外泌體，孵育4 h。對巨噬細胞進行預(yù)處理、固定、血清封閉后加一抗，4 ℃孵育過夜。加熒光二抗光孵育1 h，PBS浸洗后加 DAPI避光孵育5 min對細胞進行染核。封片液封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.6 qRT-PCR檢測 將不加入外泌體的M0型巨噬細胞設(shè)置為空白對照組；加入EXO的M0型巨噬細胞設(shè)置為陰性對照組；加入EXOTp的M0型巨噬細胞設(shè)置為實驗組。采用qRT-PCR檢測3組M1型巨噬細胞表型INOS和可溶性介質(zhì)IL-10、M2型巨噬細胞表型Arg-1和可溶性介質(zhì)IL-12和內(nèi)參GAPDH等mRNA表達水平，用ViiATM7 PCR儀進行擴增，重復(fù)檢測3次。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測 每支流式檢測管中加入100 μL細胞懸液(5～10)×105細胞/管、適量預(yù)稀釋好的一抗，空白管中加入與抗體相同量的對照試劑，避光冰浴15 min后洗滌2次，用0.5 mL Cell Staining Buffer 重懸細胞，加入10 μL(0.25 μg)/million 細胞的核染料7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以區(qū)分活、死細胞，冰上孵育5 min。上機分析,分別檢測空白對照組、陰性對照組、實驗組在6、12、24 h中M1型巨噬細胞表面抗原(MHC-Ⅱ、CD86)和M2型巨噬細胞表面抗原(CD206、CD209)的表達情況。

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS 22.0軟件，各組間INOS、IL-12 mRNA等水平的比較選用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定

透射電鏡下實驗組、陰性對照組外泌體均為直徑約40～160 nm的微小囊泡，呈盤狀囊泡樣結(jié)構(gòu)(圖1)。Western blot顯示兩組外泌體標志蛋白(CD9、ALIX、HSP70、TSG101、Annexin-5)條帶清晰，5種標志蛋白中CD9表達量最高(圖2)。

圖1 透射電鏡下觀察陰性對照組、實驗組的外泌體為直徑約40～160 nm的微小囊泡，呈盤狀囊泡樣結(jié)構(gòu)

圖2 Western blot測定實驗組和陰性對照組標志蛋白ALIX、HSP 70、TSG 101、Annexin-5、CD9的表達

2.2 NTA定量測定外泌體

NTA檢測實驗、陰性對照組外泌體直徑40～160 nm，其中陰性對照組外泌體顆粒濃度為5.6×109個/mL，粒徑峰值119.6 nm，峰面積占比 91.7%，實測平均粒徑大小142.0 nm；實驗組外泌體顆粒濃度為7.1×109個/mL，粒徑峰值 117.3 nm，峰面積占比 95.0%，實測平均粒徑大小 141.3 nm，兩組外泌體基本處于 40～160 nm的分布范圍(圖3A、3B)。

圖3 NTA定量測定陰性對照組(3A)、實驗組(3B)外泌體，兩組外泌體的直徑均處于40～160 nm的分布范圍

2.3 巨噬細胞對外泌體的內(nèi)化作用

PKH67染色后的兩組外泌體與M0巨噬細胞共培養(yǎng)4 h后激光共聚焦顯微鏡下觀察(圖4)，PKH67標記的外泌體(綠色熒光)位于CD68抗體標記的細胞膜內(nèi)(紅色熒光)，均分布于細胞質(zhì)內(nèi)，沒有分布在DAPI標記的細胞核區(qū)域(藍色熒光)。

圖4 PKH67染色后的兩組外泌體與M0巨噬細胞共培養(yǎng)4 h后激光共聚焦顯微鏡下的內(nèi)化現(xiàn)象，綠色熒光顆粒為染色后的外泌體，紅色熒光顆粒為細胞膜，藍色熒光顆粒為細胞核區(qū)域(1 000×)

2.4 M1/M2型巨噬細胞相關(guān)表型鑒定

M0巨噬細胞與實驗組、陰性對照組外泌體共培養(yǎng)6、12、24 h，qRT-PCR測定各組M1型相關(guān)表型(INOS、IL-12)及M2型相關(guān)表型(Arg-1、IL-10 mRNA)的表達情況，結(jié)果顯示，實驗組12、24 h INOS mRNA水平高于同期的空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；實驗組6、12、24 h IL-12 mRNA水平高于同期的空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，且隨著共培養(yǎng)時間的延長,INOS、IL-12 mRNA表達量上調(diào)更明顯;實驗組6、12、24 h Arg-1、IL-10表達與同期陰性對照組、空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。6、12、24 h陰性對照組INOS、IL-12、Arg-1、IL-10 mRNA表達均無明顯變化(圖5)。

圖5 qRT-PCR檢測M0巨噬細胞被兩組外泌體刺激6、12、24 h后INOS、IL-12、Arg-1、IL-10 mRNA的表達情況

2.5 M1/M2型巨噬細胞表面標志物檢測

M0巨噬細胞與外泌體共培養(yǎng)6、12、24 h，流式細胞術(shù)測定實驗、陰性對照及空白對照組M1型巨噬細胞表面標志物(MHC-Ⅱ、CD86)和M2型巨噬細胞表面標志物(CD206、CD209)，實驗組MHC-Ⅱ陽性，與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，3組CD86、CD206、CD209變化無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)；實驗組6、12、24 h時點時，CD206-CD209-CD86-MHC-Ⅱ+細胞比率(%)明顯上調(diào)，與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01，圖7)。

圖6 M0巨噬細胞與EXOTp共培養(yǎng)6、12、24 h，流式細胞術(shù)測定實驗組CD86、MHC-Ⅱ的表達情況

圖7 實驗組6、12、24 h，CD206-CD209-CD86-MHC-Ⅱ+巨噬細胞百分比比率(%)明顯上調(diào)

3 討論

梅毒(syphilis)系由TP感染引起的一種慢性全身性炎癥性疾病[5]。Tp侵犯機體后，透過內(nèi)皮細胞進入血液和組織細胞[6]，早期以淋巴細胞浸潤為主，致敏的淋巴細胞大量分泌巨噬細胞激活因子激活并募集巨噬細胞，誘導(dǎo)巨噬細胞在M1方向上極化，分泌大量的炎癥介質(zhì)如IL-1β、TNF-α、活性氧等殺傷TP[7-8]，防止Tp在體內(nèi)擴散。巨噬細胞的極化在疾病進展中發(fā)揮重要作用。不同組織中的巨噬細胞會根據(jù)環(huán)境的變化極化成不同的細胞亞型，如經(jīng)典活化的M1型和選擇性活化的M2型巨噬細胞[9]。M1型巨噬細胞高表達CD86、MHC-Ⅱ、iNOS、CD68等，釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子，在感染早期參與清除病原體，防止病原體擴散和持續(xù)感染[10-11]。M2型巨噬細胞高表達CD206、CD204、CD163、Arg-1等，分泌IL-10、TGF-β1等多種抗炎因子，在感染控制后參與抗炎反應(yīng)和修復(fù)受損組織[11-12]。M1/M2型巨噬細胞在感染的不同時期可發(fā)生再轉(zhuǎn)換[13-14]。

巨噬細胞負責清除感染組織內(nèi)中的Tp，它的激活模型決定了宿主對Tp攻擊的成功或失敗[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Tp及其成分脂蛋白皆可引起巨噬細胞極化[8, 14-15],且Tp可誘導(dǎo)巨噬細胞持續(xù)分化為M1型巨噬細胞[16]。探討Tp感染過程中巨噬細胞極化方向及其極化具體分子機制有利于闡明梅毒的致病機制。外泌體在感染性疾病中既可傳遞病原體分子誘導(dǎo)宿主防御和免疫，也可以充當宿主防御的調(diào)節(jié)劑和免疫逃避的介質(zhì)[17-18]。關(guān)于Tp感染過程中外泌體對巨噬細胞極化的影響研究較少，本研究在構(gòu)建Tp體外細胞感染模型的基礎(chǔ)上，探討EXOTp對巨噬細胞極化的影響在梅毒發(fā)病中的作用。目前外泌體的鑒定方法包括Western blot、透射電鏡、NTA等。既往研究表明，在Tp刺激下，THP-1來源的巨噬細胞分泌的外泌體在形態(tài)、大小、濃度上與無Tp刺激巨噬細胞分泌的外泌體相似[19]。本研究中，透射電鏡下觀察到EXOTp、EXO均為直徑約40～160 nm的盤狀囊泡樣結(jié)構(gòu)。Western blot分析外泌體的蛋白標志物，兩組外泌體均高表達CD9、Anexin-5、Hsp70、TSG101及Alix，其中CD9表達量最高。NTA結(jié)果提示兩組外泌體的粒徑和粒徑相關(guān)的濃度分布無明顯差異，基本處于40～160 nm的分布范圍。以上結(jié)果證明Tp感染THP-1來源的巨噬細胞可產(chǎn)生形態(tài)典型的外泌體。外泌體以質(zhì)膜融合和胞吐作用被靶細胞攝取，是參與細胞間信號交流的基礎(chǔ)。本研究將經(jīng)脂質(zhì)親和染料PKH67染色后的兩組外泌體與巨噬細胞共培養(yǎng)，分別用CD68、DAPI對巨噬細胞膜、細胞核進行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察巨噬細胞對兩組外泌體的內(nèi)化現(xiàn)象，結(jié)果帶綠色熒光的兩組外泌體均分布在巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)，證實巨噬細胞可以通過質(zhì)膜融合和胞吞作用攝取外泌體。

利用M1/M2型巨噬細胞相關(guān)表型及表面標志物的差異，本研究分別從基因及蛋白層面對外泌體刺激后的巨噬細胞分型進行鑒定。在基因?qū)用嫔喜捎胵RT-PCR檢測INOS、IL-12、Arg-1、IL-10，發(fā)現(xiàn)實驗組(Tp感染)與陰性對照組(不加Tp感染)和空白對照組相比較，M1型巨噬細胞相關(guān)表型INOS和IL-12 mRNA明顯上調(diào)(P<0.05)，且在24 h達到高峰，而M2型相關(guān)表型Arg-1、IL-10 mRNA無明顯變化。陰性對照組相較于空白對照組，INOS、IL-12、Arg-1、IL-10 mRNA均無明顯上調(diào)。在蛋白層面上用M1型巨噬細胞表面標志物(MHC-Ⅱ和CD86)和M2型表面標志物(CD206和CD209)進行流式細胞術(shù)分析，結(jié)果顯示各時間點中，CD206-CD209-CD86-MHC-Ⅱ+細胞比率(%)明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明,THP-1來源的巨噬細胞分泌的外泌體不能誘導(dǎo)M0巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，而在Tp刺激后，能誘導(dǎo)M0巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化。

Tp感染人體后誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，激活細胞內(nèi)多種信號通路，釋放大量炎癥因子協(xié)助吞噬Tp[15]，然而仍有部分Tp逃避巨噬細胞的吞噬作用，造成機體持續(xù)感染。研究表明，在感染性疾病中，巨噬細胞持續(xù)極化為M1型可能會引起局部組織持續(xù)的損傷從而造成病原體逃逸[20]，若病原體未完全清除，M1型過早轉(zhuǎn)換為M2型巨噬細胞，也會造成病原體逃逸導(dǎo)致機體持續(xù)感染。如結(jié)核桿菌感染M1型巨噬細胞后，可誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)換為M2型，引起機體持續(xù)感染[21]。因此，探討EXOTp誘導(dǎo)巨噬細胞極化與Tp免疫逃逸的關(guān)系有利于闡明梅毒的致病機制。

綜上所述，本研究從功能學(xué)上證實了外泌體參與梅毒發(fā)病過程，為后續(xù)研究EXOTp誘導(dǎo)巨噬細胞極化的具體機制提供了方向，同時也為未來設(shè)計研究病原體導(dǎo)致感染性疾病的機制提供了新思路。但受制于Tp在體外的存活時限，本研究僅在體外實驗中探索了Tp感染巨噬細胞的早期改變，下一步有必要采用動物模型以延長Tp感染時間探索巨噬細胞在梅毒中晚期的調(diào)節(jié)作用；此外，本研究對巨噬細胞的極化影響僅局限于現(xiàn)象，未進一步探索分子機制和分子靶點，EXOTp誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化的具體機制仍需要進一步探索。