基于羊肚菌交配型檢測(cè)的半地下式暖棚減產(chǎn)原因分析

夏偉偉 高春燕 李 慧 賈保太 王朝江*

（1河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北石家莊 050051；河北省寧晉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北邢臺(tái) 055550）

羊肚菌栽培簡(jiǎn)單粗放、效益高，是近幾年栽培面積急劇增加的食用菌之一。羊肚菌鮮菇上市越早價(jià)格越高，因此，北方掀起了暖棚栽培羊肚菌潮。半地下式暖棚相比平地式暖棚，具有更好保溫保濕的特點(diǎn)，成為栽培羊肚菌的理想場(chǎng)所。因此，有蔬菜大棚直接轉(zhuǎn)產(chǎn)或被租賃轉(zhuǎn)產(chǎn)羊肚菌。但有眾多大棚的栽培效果不理想，產(chǎn)量低，甚至絕收，且原因并非重茬引起的。

栽培羊肚菌需要購買大量栽培種、營養(yǎng)袋，每667 m2投入7 000~8 000 元，且初次栽培還需高薪聘請(qǐng)技術(shù)指導(dǎo)專家，所以一旦栽培失敗，就會(huì)損失慘重。許多栽培戶和研究人員將減產(chǎn)絕收的原因歸咎于菌種老化、污染，營養(yǎng)袋滅菌不徹底，原基形成期的環(huán)境不穩(wěn)定等[1?2]。是否僅是上述原因造成減產(chǎn)絕收還有待商榷，如出菇環(huán)境調(diào)控因素，半地下暖棚的溫度逆境是可以調(diào)控的，在澆催菇水時(shí)基本不出菇，也不是大水逆境造成；雜菌因素，在筆者團(tuán)隊(duì)指導(dǎo)的栽培戶，已具有識(shí)別菌種是否被污染的能力；滅菌因素，制備營養(yǎng)袋時(shí)，一般能控制好麥粒含水量，經(jīng)高壓滅菌，雜菌已被徹底殺滅。因此，半地下式暖棚出現(xiàn)的低產(chǎn)、絕產(chǎn)的原因需要從其他方面深入細(xì)致地分析，以進(jìn)一步為羊肚菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。筆者針對(duì)當(dāng)?shù)睾献魃绯霈F(xiàn)半地下式暖棚減產(chǎn)問題進(jìn)行調(diào)研，并從菌絲存活狀態(tài)角度查找原因，現(xiàn)總結(jié)如下，供廣大栽培戶和同行參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用打孔器取4 個(gè)減產(chǎn)代表棚的菇體處、菇體外圍5 cm處、覆膜處有菌絲和無菌絲的2~5 cm深處土樣。取樣前刮去表層土2 cm，以排除菌霜DNA 干擾。每處取3個(gè)樣，3個(gè)取樣位點(diǎn)大體呈三角形。

羊肚菌交配型引物[3]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。儀器為T100?PCR 儀，美國Bio?Rad 公司。

表1 羊肚菌交配型引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 減產(chǎn)的半地下式暖棚栽培管理情況調(diào)查

調(diào)查減產(chǎn)半地下式暖棚的栽培地點(diǎn)，所用棚結(jié)構(gòu)、規(guī)格，土壤質(zhì)地與播前處理以及栽培時(shí)間、品種、播種量、播種方式、發(fā)菌與催蕾等過程管理細(xì)節(jié)。

1.2.2 減產(chǎn)的半地下式暖棚出菇情況調(diào)查

調(diào)查包括出菇多寡、出菇位置、地表菌絲狀態(tài)和營養(yǎng)袋基質(zhì)顏色變化等情況，而后歸納分析，并確定各型代表性棚為后續(xù)研究對(duì)象。

1.2.3 減產(chǎn)的代表棚羊肚菌菌絲存活狀態(tài)檢測(cè)

羊肚菌菌絲存活狀態(tài)指土層中菌絲有無、兩個(gè)交配型是否齊全，可通過羊肚菌交配型引物以土層中DNA 為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶測(cè)得，借以判斷土層中羊肚菌菌絲是否具備出菇能力。

土樣取回后壓爛，拌勻過篩（孔徑為0.85 mm），其中部分用于烘干法（55 ℃，24 h）測(cè)含水量（土樣中水/土樣濕重×100），部分用于CTAB法提取DNA。

提取DNA 以10 mL 離心管為容器，提取前預(yù)測(cè)得其最大濕土容量為3 g，2%CTAB 裂解液最大加量為2 000μL，1%CTAB 沉淀液最大加量為7 200μL，利用最大的樣品量獲取DNA，以排除因土樣量少造成的提取失敗干擾。

交配型擴(kuò)增反應(yīng)體系25μL，其中土樣DNA 2μL，上下游引物各1μL，2×ES Mix12.5μL，ddH2O 8.5 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 1 min，50 ℃30 s，72 ℃ 1 min）×32，72 ℃ 5 min[3]。

1.2.4 平地式暖棚的出菇情況調(diào)查

為準(zhǔn)確找出半地下式暖棚減產(chǎn)原因，在寧晉縣堯臺(tái)村，選擇與其具有相同菌種來源、播種時(shí)間、播種量以及管理措施的同背景平地暖棚栽培區(qū)，進(jìn)行對(duì)比調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 減產(chǎn)的半地下式暖棚栽培管理調(diào)查結(jié)果

合作社栽培羊肚菌園區(qū)位于石家莊市鹿泉區(qū)李村，有80座半地下式暖棚，棚墻體三面土壘，棚底下沉0.6 m，棚長90 m，寬8 m，棚頂及棚陽面有膜搭茬通風(fēng)孔隙，土壤為壤土。播種前15 d，每667 m2撒石灰100 kg，用小型旋耕機(jī)翻耕。播種前2 d栽培地澆透水，水下滲后播種。栽培品種為六妹系列G8，用種量為225 kg/667 m2，播種前將菌種揉碎至直徑0.5~1.0 cm顆粒。

2021 年 11 月 26 日播種，當(dāng)時(shí)土壤溫度為 9 ℃，棚內(nèi)溫度為7 ℃。播種方式采用平地按畦溝播，畦面寬1 m，畦間留0.3 m 走道。播種時(shí)將菌種均勻撒在開好的條狀溝內(nèi)，然后整平，覆土3~5 cm。播種后畦面覆蓋扎有透氣孔的黑色塑料薄膜，膜寬同畦面。播種后3 d，土壤表面可見稀疏的菌絲，7 d菌絲量增多，10 d 后擺放外源營養(yǎng)袋，掀開塑料薄膜，放入營養(yǎng)袋后再蓋好薄膜。營養(yǎng)袋用量為2 200袋/667 m2，單袋濕重1 kg。

發(fā)菌期間溫度一直穩(wěn)定在3~10 ℃，不噴水，覆膜避光培養(yǎng)菌絲。2 月25 日菌霜開始消退，菌絲變黃，畦面上已有少量原基形成，此時(shí)開始催蕾管理。方法是揭開塑料膜，晾3 d，然后大水漫灌整個(gè)畦面。同時(shí)溫度管理為中午棚外溫度高時(shí)，卷起覆蓋物提高棚溫；溫度低時(shí)，撐開通風(fēng)口薄膜降溫，以拉大棚內(nèi)溫差，如此刺激3~5 d，同時(shí)給以散射光照射。7~10 d 后，有些棚有原基出現(xiàn)，但在膜間走道原基多，畦面上少；有些棚20 d 后仍未現(xiàn)蕾。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在澆催菇水前各棚土層表面均有大量菌霜，澆水后則全部消退，其間一直保持棚內(nèi)溫度為6~14 ℃，土壤溫度8~12 ℃，空氣相對(duì)濕度85%~90%，均適合原基發(fā)生及子實(shí)體生長。

2.2 減產(chǎn)的半地下式暖棚出菇情況

現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查多個(gè)菇棚后，發(fā)現(xiàn)所謂出菇多的棚內(nèi)也出菇不多；地表菌霜消退，說明催菇水有清退菌霜的作用；營養(yǎng)袋基質(zhì)變黑塌癟，說明基質(zhì)持續(xù)處于高水分環(huán)境中，在細(xì)菌作用下腐敗變質(zhì)。根據(jù)出菇量和地表有無菌絲可將減產(chǎn)菇棚分為4 種類型（圖1）。

多菇棚（圖1a）。此棚特點(diǎn)是出菇多的位置在薄膜搭茬的間隙走道區(qū)，順走道遠(yuǎn)觀似一條菇帶，而覆膜處散生菇稀疏。覆膜下和膜間隙地面都有菌絲冒出土層，后者也比前者多，且成片或有菌霜，發(fā)白呈帶狀。但因澆催菇水前的菌霜已消失，此應(yīng)為二次菌霜。

少菇棚（圖1c）。該棚出菇情況同多菇棚，差別是膜間隙區(qū)域的菇更少。

無菇有菌絲棚（圖1b）。此棚薄膜覆蓋面和膜間隙處都無菇，但覆膜處有散片狀分布的菌絲，膜間隙處能看到條帶狀發(fā)白的菌絲或菌霜。

無菇無菌絲棚（圖1d）。該棚情形和無菇有菌絲棚相近，不同之處是在覆膜處連散片狀的菌絲也沒有，膜間隙處有菌絲或顯菌霜。

圖1 4種減產(chǎn)的半地下式暖棚

另外，無菇有菌絲棚在催菇前是有原基或幼菇的，澆水后不再出菇，表明催菇時(shí)，澆水對(duì)菇體有損害。多菇棚、少菇棚出菇部位本應(yīng)在覆膜處畦面，但出菇量比膜間隙區(qū)還稀疏，表明覆蓋薄膜明顯抑制出菇。覆膜的畦面與膜間隙處的差別，主要是后者透氣性好，故推測(cè)覆膜傷害絲，使菌絲活力下降，不但影響出菇，且對(duì)催菇水造成的逆境抵抗力變?nèi)酰ū?）。

2.3 減產(chǎn)的半地下式暖棚羊肚菌菌絲存活狀態(tài)

烘干法測(cè)得菌絲含水量為16.5%~16.8%，雖偏低，但取樣時(shí)卻極易捏成團(tuán)塊。

羊肚菌兩個(gè)交配型引物擴(kuò)增的7 個(gè)位點(diǎn)，共21個(gè)重復(fù)的土樣（土樣來源編號(hào)如表2）中菌絲DNA產(chǎn)物電泳條帶見圖2，圖2 中上半部為Ⅰ型產(chǎn)物，下半部為Ⅱ型產(chǎn)物，同一土樣的Ⅰ、Ⅱ交配型產(chǎn)物電泳圖上下對(duì)應(yīng)。

圖2 土樣DNA兩個(gè)交配型擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表2 減產(chǎn)的半地下式暖棚出菇表現(xiàn)

由圖2可以看出，2個(gè)交配型在同一土樣中被檢出，或1個(gè)交配型被檢出的機(jī)會(huì)隨著出菇變少、菌絲消失而明顯降低；任一交配型未檢出的機(jī)會(huì)，在各種出菇狀態(tài)下都存在，催菇水前后無菇也無菌絲的檢出機(jī)會(huì)最高，與各棚出菇多少和不出菇的表現(xiàn)基本吻合。說明出菇的土層中羊肚菌菌絲并不密，且出菇邊土層菌絲又比出菇處土層少；菌絲分布在淺層土；栽培期間羊肚菌菌絲存在減少消亡現(xiàn)象。

2.4 平地式暖棚出菇情況

該類棚出菇整體良好，菇密集區(qū)位于覆膜下，未出現(xiàn)成片無菇區(qū)，覆膜間隙的菇大部分在覆膜的邊緣，呈明顯的菇壟狀，間隙區(qū)菇少呈空心狀態(tài)（圖3）。結(jié)合減產(chǎn)半地下式暖棚多菇處2 個(gè)交配型菌絲檢出機(jī)會(huì)多的結(jié)果，表明正常高產(chǎn)菇棚，覆膜下才是出菇多和菌絲密集的地方；營養(yǎng)袋基質(zhì)多呈白色，表明覆膜期間細(xì)菌腐敗程度低。

圖3 平地式暖棚羊肚菌出菇

兩種暖棚的出菇現(xiàn)狀表明，同等情況下，僅棚底是否下沉結(jié)構(gòu)差別就可帶來不同的栽培羊肚菌效果。

3 小結(jié)與討論

3.1 羊肚菌菌絲存活狀態(tài)制約其產(chǎn)量

出菇不穩(wěn)定是羊肚菌生產(chǎn)的最大問題和難點(diǎn)，兩個(gè)交配型基因同時(shí)存在，才能實(shí)現(xiàn)子實(shí)體正常發(fā)育和產(chǎn)生子囊孢子[3]，并引導(dǎo)研究者將解決不出菇問題的側(cè)重點(diǎn)放在菌種的交配型檢測(cè)上[4]。研究則進(jìn)一步證明，即使在相同菌種的遺傳背景下，土層中羊肚菌菌絲仍存在著數(shù)量減少、交配型丟失等存活狀態(tài)變化，從而導(dǎo)致減產(chǎn)、絕產(chǎn)等后果。

3.2 覆膜等常規(guī)管理影響羊肚菌菌絲存活狀態(tài)

首先從菌絲由多變少和轉(zhuǎn)向間隙區(qū)出菇的成因分析，相對(duì)于膜間隙區(qū)覆膜下部是羊肚菌菌種和營養(yǎng)袋密集處。半地下式暖棚的覆膜下出菇卻少于間隙區(qū)，而兩區(qū)在覆膜前的菌絲表觀狀態(tài)基本相同，據(jù)此推測(cè)覆膜改變了菌絲存活狀態(tài)。對(duì)于土壤水分高且易保持的半地下暖棚來說，長時(shí)間覆膜（即使膜上有透氣孔）因水的反復(fù)蒸發(fā)和凝結(jié)滴落終究會(huì)造成表層土濕度高、缺氧。羊肚菌是好氧菌，且菌絲主要分布在淺層土，長時(shí)間缺氧必然導(dǎo)致其生長乏力或死亡。

分析澆催菇水前有菇而后不出菇的成因可知，覆膜下菌絲數(shù)量、存活狀態(tài)與覆膜造成的缺氧狀態(tài)相關(guān)，存在高濕度下菌絲變少、活力變?nèi)醯那樾?，此時(shí)再遇大水（催菇水），缺氧加重，菌絲進(jìn)一步弱化，最后導(dǎo)致水后無菇。

由此可見，覆膜雖可促進(jìn)羊肚菌菌絲萌發(fā)，保持土壤墑情，提高菌絲活力，但因半地下式暖棚棚底含水量高，濕度過高阻斷氧氣供給，從而抑制菌絲活力，最后導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。因此，覆膜有利弊，切忌機(jī)械照搬。把握好覆膜時(shí)間，在覆膜后根據(jù)墑情適當(dāng)透氣。