秀珍菇液體菌種標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)

劉 芳 袁宗勝 陳國(guó)平 袁 濱 柯麗娜 謝寶貴*

（1 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2 閩江學(xué)院地理與海洋學(xué)院，福建福州 350108；3漳州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局經(jīng)濟(jì)作物站，福建漳州 363099；4 漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建漳州，363005）

秀珍菇屬真菌門(mén)Eumycota，擔(dān)子菌綱Basidio‐mycete，傘菌目 Agarical，側(cè)耳科 Pleurotaceae，側(cè)耳屬Pleurotus[1]，因其外形悅目、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、口感清脆而得名。近年來(lái)除了傳統(tǒng)季節(jié)性栽培秀珍菇外，工廠(chǎng)化栽培規(guī)模也逐步擴(kuò)大[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，栽培秀珍菇采用固體菌種，但固體菌種存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、菌齡不一致、污染率高等問(wèn)題，大大制約了秀珍菇的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[3]。將液體菌種技術(shù)應(yīng)用于秀珍菇的栽培，則可以在短期內(nèi)獲得大量菌絲體，且發(fā)酵液特性穩(wěn)定，生產(chǎn)能力大，有利于秀珍菇的規(guī)?；a(chǎn)[4]。現(xiàn)就秀珍菇液體菌種標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)簡(jiǎn)要介紹如下。

1 通用要求

1.1 生產(chǎn)廠(chǎng)房設(shè)計(jì)要求

須達(dá)到NY/T 528 標(biāo)準(zhǔn)要求，菌種發(fā)酵車(chē)間需按照GB 50073潔凈廠(chǎng)房設(shè)計(jì)規(guī)范執(zhí)行。

1.2 生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施

（1）應(yīng)設(shè)置配料間、滅菌間、接種室等基本設(shè)施，需有調(diào)溫通風(fēng)設(shè)施。檢測(cè)室和菌種室要有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)儀器、設(shè)備和制種用的滅菌設(shè)施和常規(guī)用具。

（2）應(yīng)配備發(fā)酵罐、滅菌鍋、烘干箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、空氣壓縮機(jī)、空氣過(guò)濾器等基本生產(chǎn)設(shè)備。

1.3 培養(yǎng)原料

化學(xué)試劑類(lèi)符合NY/T 528 食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求。生物制劑和天然材料類(lèi)除符合NY/T 528 食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求外，水不溶性固體物料要過(guò)80目（180μm±7.6μm）篩網(wǎng)。

1.4 品種

選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、商品性好的秀珍菇品種，從具相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種或本單位選育，并能追溯菌種來(lái)源。

2 液體菌種生產(chǎn)工藝要求

2.1 容器

2.1.1 母種容器、搖瓶

母種容器應(yīng)使用玻璃試管和透氣隔菌的硅膠塞（或棉塞），搖瓶應(yīng)使用耐高溫的玻璃錐形瓶和透氣隔菌的硅膠塞（或棉塞），棉塞外可用紗布包裹。

2.1.2 液體菌種發(fā)酵罐

發(fā)酵罐使用前需檢查罐上全部閥門(mén)、壓力表、軟管等，確保完好無(wú)損。罐體內(nèi)、外和全部閥門(mén)、軟管用流水清洗，做到無(wú)死角、內(nèi)壁無(wú)任何培養(yǎng)料殘余物、無(wú)菌絲殘留。菌種罐初次使用、出現(xiàn)染菌、長(zhǎng)期放置、更換品種時(shí)，都要求進(jìn)行空消滅菌。用外源蒸汽滅菌的發(fā)酵罐，蒸汽壓力應(yīng)達(dá)0.105~0.125 MPa，溫度121~124 ℃，70 min。

2.2 液體菌種培養(yǎng)基

白糖16 kg，硫酸鎂800 g，磷酸二氫鉀800 g，豆粉 3 kg，泡敵100 mL，水1 000 L，pH 6.0~6.5[5]。

2.3 定容與滅菌

關(guān)閉進(jìn)氣閥和接種閥，將漏斗插入進(jìn)料口，將料液分批分次倒入或用水泵抽入處理好的培養(yǎng)器內(nèi)?？傃b料量為罐體總?cè)莘e的70%~80%，擰緊上料口蓋。微開(kāi)排氣閥門(mén)，其余所有閥門(mén)均關(guān)閉，加熱滅菌。啟動(dòng)加熱器加熱，當(dāng)溫度升至105 ℃時(shí)，關(guān)閉排氣閥門(mén)使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.12 MPa 維持60 min以上[6]，結(jié)束滅菌自然降壓。

圖1 液體菌種發(fā)酵液

圖2 液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)4~5 d時(shí)視鏡觀察

2.4 冷卻與接種

滅菌完畢后，應(yīng)自然降壓（不能強(qiáng)制降壓），液體菌種罐在通氣狀態(tài)下采用夾套循環(huán)水冷卻至30 ℃以下。取液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)基無(wú)菌操作接于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，觀察培養(yǎng)物生長(zhǎng)情況，并經(jīng)顯微鏡鏡檢確定無(wú)污染為滅菌合格。

菌種罐接種，專(zhuān)用菌種需要提前準(zhǔn)備好，菌種的搖瓶口和發(fā)酵罐進(jìn)料口須用75%酒精消毒，在火焰保護(hù)下接種。火圈放在進(jìn)料口的上方點(diǎn)燃，打開(kāi)進(jìn)料口蓋，將經(jīng)檢測(cè)無(wú)污染的液體母種迅速投入罐后（接種量為相應(yīng)菌種罐所裝培養(yǎng)液體積的0.5%~1.0%），立即蓋好進(jìn)料口。接種完成移走火圈后及時(shí)做好標(biāo)記。

2.5 液體菌種培養(yǎng)

液體菌種罐通氣培養(yǎng)，空氣流量調(diào)至（1.2~1.5）m3/h 以上，罐壓控制為 0.02~0.04 MPa[6]，培養(yǎng)溫度為21~23 ℃。在上述條件下培養(yǎng)4~5 d 可達(dá)放罐指標(biāo)。

2.6 取樣與檢測(cè)

在液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)定期取樣，留樣觀察測(cè)定pH、菌絲濕重，并進(jìn)行顯微鏡鏡檢。pH的測(cè)定采用酸度計(jì)法；菌絲濕重的測(cè)定采用直徑15 cm 的定量濾紙，將100 mL液體菌液，過(guò)濾至無(wú)水滴滴下，稱(chēng)重后減去濾紙濕重；無(wú)雜菌檢查，采用顯微鏡觀察菌種發(fā)酵液中是否有異常菌絲或孢子；并應(yīng)同時(shí)在檢測(cè)霉菌和細(xì)菌的瓊脂平板上劃線(xiàn)或涂布培養(yǎng)，分別于28 ℃和35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每天觀察平板菌落生長(zhǎng)狀況，若無(wú)異常菌落（霉菌和細(xì)菌菌落生長(zhǎng)），則表明該樣品無(wú)污染；或結(jié)合搖瓶培養(yǎng)檢測(cè)，48 h 內(nèi)觀察培養(yǎng)液無(wú)變色，無(wú)渾濁或無(wú)大量起泡則表明該批液體菌種無(wú)細(xì)菌污染。

2.7 放罐

液體菌種達(dá)到放罐指標(biāo)并經(jīng)鏡檢等檢驗(yàn)合格后即可放罐。

2.7.1 感官指標(biāo)

感官指標(biāo)應(yīng)符合表1的要求。

表1 液體菌種感官狀態(tài)

2.7.2 理化指標(biāo)

理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的要求。

表2 液體菌種理化指標(biāo)和鏡檢狀態(tài)

2.8 污染罐的處理

發(fā)現(xiàn)污染的液體菌種罐應(yīng)立即關(guān)閉排氣閥，避免污染菌在發(fā)酵室內(nèi)繁殖擴(kuò)散，罐內(nèi)的液體菌種通過(guò)排廢管道直接排入下水道或污水處理系統(tǒng)，并及時(shí)清洗、消毒發(fā)酵罐。同時(shí)加強(qiáng)對(duì)發(fā)酵室的消毒[7]。

圖3 液體菌種的顯微觀察

圖4 液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)4~5 d顯微觀察菌絲狀態(tài)

3 液體菌種接種要求

接種環(huán)境應(yīng)達(dá)到GB 50073潔凈廠(chǎng)房設(shè)計(jì)規(guī)范相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。將待接種的栽培料袋（瓶）放置在接種輸送帶，無(wú)菌的膠管和接種槍接上菌種罐后要先放掉一些液體菌種，沖洗膠管及接種槍?zhuān)档臀廴韭蔥7]。然后用接種槍將液體菌種注入栽培料袋（瓶），接種量為35 mL/袋（瓶），接種動(dòng)作應(yīng)迅速、準(zhǔn)確。

4 生產(chǎn)記錄及人員要求

液體菌種發(fā)酵生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)有翔實(shí)的生產(chǎn)記錄，由具體操作人員現(xiàn)場(chǎng)記錄填寫(xiě)并歸檔保存。

應(yīng)配備液體菌種生產(chǎn)所需的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。從事液體菌種生產(chǎn)的各工序操作人員，必須按照相關(guān)規(guī)定要求進(jìn)行專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)合格后，方可從事液體菌種的生產(chǎn)。