抗氧化水凝膠材料在骨組織工程中的應(yīng)用

王旭 吳楠 綜述 裴錫波 審校

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是人體代謝過程中的中間產(chǎn)物，對于骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義[1]。遺傳、衰老、環(huán)境等因素導(dǎo)致的ROS的過度積累會導(dǎo)致炎癥狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致牙周炎、骨關(guān)節(jié)炎等多種骨相關(guān)疾病[2]。利用抗氧化骨組織工程材料清除ROS已成為治療上述疾病的重要策略之一[3]。其中，水凝膠是一種具有3D交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的新型功能高分子材料，具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的多孔結(jié)構(gòu)以及良好的生物相容性，可作為細(xì)胞或骨骼生長的載體材料。此外，其柔軟的質(zhì)地可以減少周圍細(xì)胞和組織的炎癥反應(yīng)，與許多生物軟組織相匹配。同時，可調(diào)的機(jī)械強(qiáng)度、形態(tài)可塑性和通用設(shè)計(jì)性也使其作為一種骨組織工程支架材料而備受矚目。通過向水凝膠引入天然多酚、生物活性分子、無機(jī)化合物等抗氧化劑，使其獲得抗氧化活性，已成為清除體內(nèi)ROS的有效途徑之一。本文總結(jié)了不同抗氧化水凝膠在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，并對抗氧化水凝膠的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 活性氧

ROS包括一系列活性分子，例如過氧化氫(H2O2)、氫自由基(·OH)、氫氧根離子(OH-)、超氧陰離子(O2-)等。ROS主要來源于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和吞噬體，其中線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生了90%以上的ROS[4]。生理狀態(tài)下，ROS被以超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)為代表的體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)維持在正常水平，參與調(diào)控骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟及礦化[5]。病理狀態(tài)下，ROS因遺傳、衰老、環(huán)境等因素異常增加，通過DNA和蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過氧化和酶促氧化來破壞組織，進(jìn)而引發(fā)多種骨相關(guān)疾病，如牙周炎、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病性骨愈合延遲等，對患者機(jī)體功能和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[6-8]。

2 抗氧化水凝膠在骨組織工程中的應(yīng)用

2.1 天然多酚類

多酚是一大類植物來源的生物相容和可生物降解的化合物，是一種天然的抗氧化劑，廣泛存在于蔬菜、水果、谷物、豆類中。多酚可分為5 個主要類別：類黃酮、單寧、酚酸、芪和香豆素[9]。研究表明多酚具有多種生物效應(yīng)，包括抗氧化活性，其機(jī)理可能是通過羥基提供質(zhì)子或電子來穩(wěn)定自由基[10-11]。

2.1.1 類黃酮類 類黃酮類在天然多酚中占有很大比例，約有10 000 種天然類似物，其中姜黃素、兒茶酚、槲皮素等已被用于抗氧化水凝膠的構(gòu)建中[12]。姜黃素是一種植物來源的類黃酮化合物，因其水溶性差、生物利用度低等原因，限制了進(jìn)一步應(yīng)用[13]。為解決上述問題，Li等[14]將姜黃素包埋在絲素蛋白水凝膠中，通過與絲素蛋白的疏水域結(jié)合，提高了姜黃素的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明包裹在水凝膠中的姜黃素的抗氧化活性無論在干燥還是在水合狀態(tài)下，均可保持至少1 個月，但該復(fù)合水凝膠被發(fā)現(xiàn)抑制了人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的增殖。Chen等[15]則通過將姜黃素與Mg2+引入季銨化殼聚糖和苯甲醛封端的Pluronic?F127聚合物形成的水凝膠中，不僅提高了姜黃素的溶解度，同時這種復(fù)合水凝膠表現(xiàn)出良好的生物相容性、可注射性、自愈性和粘附性。研究結(jié)果還表明負(fù)載姜黃素的水凝膠不僅明顯降低了炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，同時上調(diào)了SOD1的表達(dá)，并顯著減少BMSCs的凋亡，為肌腱-骨愈合提供保護(hù)性微環(huán)境。

兒茶酚是一種綠茶中提取的多酚化合物，已作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于各個領(lǐng)域[16]。Chen等[17]為了賦予臨床常用鈦基材抗氧化活性，利用逐層自組裝技術(shù)(LBL)在鈦基材表面構(gòu)建了由殼聚糖-兒茶酚、明膠和羥基磷灰石納米纖維組成的多層結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，在鈦表面形成的多層結(jié)構(gòu)不僅具有良好的軟組織粘附性，而且可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附相關(guān)基因、抗凋亡和促凋亡相關(guān)蛋白的產(chǎn)生來有效保護(hù)成骨細(xì)胞免受ROS損傷。體內(nèi)研究證明多層結(jié)構(gòu)大大提高了鈦種植體在骨/種植體界面處的骨與種植體結(jié)合強(qiáng)度和骨體積。Liu等[18]則將類沸石咪唑酯骨架-8納米顆粒(ZIF-8 NP)引入兒茶酚-殼聚糖多功能水凝膠，以達(dá)到促進(jìn)成骨分化，并加速骨重建的目的。該水凝膠在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出優(yōu)良的流變性能、可靠的機(jī)械強(qiáng)度和出色的附著力。多功能水凝膠增強(qiáng)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)中血管內(nèi)皮生長因子的旁分泌，保證骨缺損區(qū)的血供重建。此外，水凝膠釋放的ZIF-8 NPs還可以上調(diào)堿性磷酸酶、膠原蛋白1和骨鈣素的產(chǎn)生和分泌，促進(jìn)rBMSCs的成骨分化。在顱骨缺損模型中，顯微CT和組織學(xué)分析表明，水凝膠導(dǎo)致更多的礦化和新生血管形成，并提高了骨再生的質(zhì)量和速度。

槲皮素也是一類天然黃酮類化合物，存在于各種水果和茶葉中。在一項(xiàng)研究中，槲皮素被摻入一種基于殼聚糖的熱敏水凝膠中以增強(qiáng)生物活性環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨分化，并減少自由基分子引起的細(xì)胞損傷[19]。該熱敏水凝膠可以在體溫條件下從溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，使其能很好地填充不規(guī)則形狀的骨缺損，并減少手術(shù)暴露。

2.1.2 單寧類 單寧，是一種水溶性天然多酚化合物，常見于堅(jiān)果等植物中，已被FDA批準(zhǔn)用作直接食品添加劑[20]。單寧分為可水解單寧和縮合單寧。水解單寧來源于沒食子酸與葡萄糖的酯化反應(yīng)及其氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其中沒食子酸是最基本的成分[21]。一項(xiàng)研究將沒食子酸加入由殼聚糖、β-甘油磷酸鈉和堿性磷酸酶組成的用于骨再生的可注射水凝膠，以增加抗氧化活性[22]。添加的沒食子酸在體外實(shí)驗(yàn)中表明對MG63細(xì)胞的粘附和生長沒有負(fù)面影響，但細(xì)胞的礦化降低了水凝膠的抗氧化活性。此外，該水凝膠還表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抗菌活性。另一項(xiàng)研究則報(bào)告了一種基于單寧酸(TA)的納米凝膠作為有效的ROS清除劑[23]。研究者通過將聚合苯硼酸酯和TA簡單混合以在其之間形成苯硼酸酯鍵來制備該納米凝膠。ROS清除試驗(yàn)揭示了凝膠的顯著抗氧化作用。此外，凝膠還顯示出高生物相容性和強(qiáng)抗炎作用。

縮合單寧由多羥基-黃烷-3-醇低聚物通過黃烷醇單元之間的C-C鍵組成，比植物中的可水解單寧更常見，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。原花青素是一類比較常見的縮合單寧。據(jù)報(bào)道，原花青素可以刺激骨形成并調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收，因此非常適合治療包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的溶骨性疾病[24]。憑借這種有益的生物學(xué)效應(yīng)，原花青素成為了鈦植入物功能化的理想候選者，可清除ROS和增強(qiáng)骨整合。Tang等[25]利用LBL將原花青素封裝在由帶正電荷的殼聚糖和帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸組成的多層網(wǎng)絡(luò)的微間隙中，從而實(shí)現(xiàn)其持續(xù)和受控的釋放。藥物釋放測定顯示原花青素可在14 d內(nèi)受控和持續(xù)釋放。在體外H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下，原花青素增強(qiáng)了MC3T3-E1細(xì)胞成骨潛力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，種植體周圍骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和相關(guān)小梁骨參數(shù)的定量形態(tài)分析也證實(shí)了原花青素修飾的鈦植入物的新骨形成增加。

2.1.3 其他 白藜蘆醇是一類天然芪類多酚，但受到其水不溶性和體內(nèi)快速代謝的阻礙，無法作為一種有效的抗氧化劑。為解決上述問題，Wang等[26]將白藜蘆醇被接枝到聚丙烯酸上，以獲得一種大分子藥物，然后將其摻入去端膠原水凝膠中以制備骨組織工程支架。支架展示了BMSCs免受ROS侵害的能力，同時發(fā)現(xiàn)骨缺損區(qū)域的炎癥相關(guān)基因下調(diào)，而骨和軟骨相關(guān)基因上調(diào)。

木質(zhì)素是一種含有酚羥基的多酚復(fù)合物，具有抗氧化、抗菌特性，在自然界中儲量豐富。Abudula等[27]將木質(zhì)素與明膠相結(jié)合，開發(fā)了一種多功能，即抗菌、抗氧化和可注射的冷凍凝膠。木質(zhì)素的引入不僅賦予了凝膠抗氧化、抗菌功能，同時顯著改善了凝膠的機(jī)械性能。此外，研究還發(fā)現(xiàn)含有0.2%木質(zhì)素的冷凍凝膠可最小程度地激活小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞。另一項(xiàng)研究則開發(fā)了一種含有木質(zhì)素的3D打印水凝膠支架[28]。Micro-CT評估表明，與未處理的缺損相比，植入支架的缺損部位形成了更多的骨組織，提示有利于骨組織再生。

2.2 生物活性分子

除了天然多酚這一類抗氧化外，生物活性分子如氨基酸、肽、細(xì)胞因子、多糖等也被用于抗氧化水凝膠的構(gòu)建。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽的前體物質(zhì)，具有直接的抗氧化作用。在一項(xiàng)研究中，由半胱氨酸修飾的γ-聚谷氨酸(PGA-Cys)組成的有機(jī)水凝膠被用作支架材料，并在其中添加HA和MgO納米顆粒，以用于糖尿病骨缺損重建。復(fù)合水凝膠可以有效促進(jìn)BMSCs的遷移和增殖，還可以誘導(dǎo)成骨分化以及減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞浸潤。此外，在將HA/MgO-H支架植入糖尿病大鼠股骨缺損區(qū)后的第8周，顯微CT成像顯示了更有效的骨修復(fù)[29]。另一方面，同時將NAC和谷胱甘肽封裝到甲基丙烯酰明膠中也被證實(shí)是保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的有效策略之一[30]。

用于抗氧化水凝膠的細(xì)胞因子一般不直接發(fā)揮抗氧化作用，而是通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，從而間接減少ROS的產(chǎn)生。在糖尿病條件下，高血糖一方面會導(dǎo)致促炎性M1巨噬細(xì)胞能量代謝旁路的異常激活，從而增加ROS的產(chǎn)生。另一方面，葡萄糖波動等信號可以延長M1巨噬細(xì)胞的局部滯留時間，同時顯著延遲M2巨噬細(xì)胞表達(dá)。基于上述原理，Li等[31]設(shè)計(jì)了一種由苯基硼酸交聯(lián)聚乙烯醇和明膠膠體組成的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，它可以根據(jù)動態(tài)糖尿病微環(huán)境確定何時開始釋放所載藥物。負(fù)載IL-10和BMP-2的上述水凝膠可以在急性炎癥的早期釋放IL-10用于免疫調(diào)節(jié)，而BMP-2可以稍后釋放以匹配成骨細(xì)胞的激活。此外，IL-10被發(fā)現(xiàn)可以重塑線粒體相關(guān)的抗氧化系統(tǒng)來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，從而增強(qiáng)糖尿病骨缺損的成骨作用。

多糖也被報(bào)道可發(fā)揮抗氧化作用。一種通過氧化支鏈淀粉和八臂乙二醇(PEG)肼共價交聯(lián)開發(fā)出的可注射聚合物水凝膠，在1 h內(nèi)抑制了68%的自由基；同時水凝膠釋放的地塞米松抑制了MC3T3-E1中的促炎標(biāo)志物IL-6和IL-1β，并提高了抗炎標(biāo)志物TGF-β[32]。另一種添加了黃蓍膠多糖的水凝膠也表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化活性，可減少產(chǎn)生50%的ROS，并使成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)高出1.5～2.5倍[33]?？傮w而言，盡管多糖抗氧化劑的應(yīng)用較少，但其表現(xiàn)出較好的抗氧化活性和成骨活性，可用于氧化應(yīng)激條件下的骨修復(fù)應(yīng)用。

2.3 無機(jī)化合物

用于ROS清除水凝膠的無機(jī)化合物可分兩類：一類是無機(jī)納米粒子，另一類則是無機(jī)官能團(tuán)。前者包括二氧化鈰(CeO2)、富勒醇等，后者則包括硼酸、硫等。二氧化鈰納米粒子已知可清除超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基，其催化抗氧化特性歸因于每個氧化態(tài)之間的循環(huán)氧化還原反應(yīng)。Varini等[34]研究了基于藻酸鹽水凝膠和中孔玻璃的珠子中鈰含量對珠的生物活性和生物相容性的影響。隨著Ce含量的增加，珠子顯著改善了前成骨細(xì)胞MC3T3-C1細(xì)胞的增殖，然而細(xì)胞分化隨之減少。結(jié)果表明具有1.2%和3.6%的CeO2的珠子是兼具抗氧化活性和生物活性的最佳支架候選者。富勒醇是富勒烯的衍生物之一，具有抗氧化作用，但其具體機(jī)制未明。Yang等[35]使用微流體技術(shù)將富勒醇納米晶體摻入水凝膠微球中，以原位構(gòu)建富勒醇-水凝膠微流體球(FMS)調(diào)節(jié)干細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)難治性骨愈合。研究表明，F(xiàn)MS表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化活性，可抑制細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ROS，使干細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。此外，還可以通過激活FoxO1信號有效地促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。

由于對ROS的高靈敏性，硼酸、硫縮酮等常被用于ROS響應(yīng)材料的響應(yīng)元件，不僅可用來清除ROS，同時可以實(shí)現(xiàn)負(fù)載藥物在ROS富集部位的精準(zhǔn)釋放，提高治療效果。最近，硼酸被用于構(gòu)建一種可注射水凝膠，強(qiáng)力霉素和二甲雙胍則通過B-N配位結(jié)合到水凝膠中，該系統(tǒng)可以提高載藥效率，并實(shí)現(xiàn)ROS觸發(fā)的局部藥物釋放[36]。該水凝膠對牙齦組織具有適當(dāng)?shù)恼掣叫?，生物相容性好，并對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和牙齦卟啉單胞菌具有顯著的抗菌作用。此外，雙載藥水凝膠在糖尿病大鼠牙周炎模型中使得牙槽骨丟失明顯減少，組織學(xué)評估也進(jìn)一步表明其通過減少炎癥細(xì)胞浸潤和發(fā)揮抗破骨細(xì)胞作用，從而在治療糖尿病牙周炎中發(fā)揮積極作用。硫縮酮具有許多用于合成大型組織工程材料的理想屬性，其可通過低成本、低毒性前體的簡單縮聚來合成，形成對水解惰性但可被ROS特異性降解的聚合物鏈。Martin等[37]報(bào)告了一種硫縮酮聚合物交聯(lián)的基于PEG的水凝膠，并將其用作細(xì)胞可降解、抗氧化的干細(xì)胞遞送平臺。實(shí)驗(yàn)中觀察到該水凝膠包裹的MSC在11 d內(nèi)明顯保持更高的活力，并比與酶促降解肽交聯(lián)的金標(biāo)準(zhǔn)水凝膠多維持了40%以上的活細(xì)胞，提示可作為細(xì)胞遞送的支架材料。

3 小 結(jié)

ROS的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致包括牙周炎、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病骨缺損在內(nèi)的骨相關(guān)的慢性炎癥性疾病的顯著病理因素，而以水凝膠為代表的抗氧化生物材料已被提出做為治療上述疾病的有效策略之一。許多來源可作為抗氧化劑引入水凝膠中，包括天然多酚、生物活性分子、無機(jī)化合物，制得的抗氧化水凝膠表現(xiàn)出了令人滿意的抗氧化活性，同時顯著改善了抗氧化劑原有的限制如水溶性差，生物利用度差等，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)了其生物活性和成骨能力。此外，一些抗氧化水凝膠設(shè)計(jì)時綜合考慮了ROS清除機(jī)制、持續(xù)時間以及疾病的具體情況，對特定疾病起到了較好的治療效果。

盡管近年來抗氧化水凝膠在骨組織工程中的應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，許多研究在水凝膠的制備、改性、應(yīng)用等方面進(jìn)行了富有成效的探索，但目前制備的抗氧化水凝膠仍存在一些問題亟待解決，如降解速率與骨再生速率不能精確匹配，機(jī)械性能未能滿足臨床需求，促進(jìn)骨再生能力不足等，因此制備可控降解速率、優(yōu)良機(jī)械性能、顯著促進(jìn)成骨的抗氧化水凝膠是該領(lǐng)域重要的研發(fā)方向之一。為了獲得良好的骨修復(fù)效果，抗氧化水凝膠應(yīng)隨著時間的推移而降解，逐漸被宿主骨組織取代，因此降解速率應(yīng)與骨生長速率相似。另外大多數(shù)水凝膠植入物的一個缺點(diǎn)是它們是軟材料，為了改善其機(jī)械性能，已進(jìn)行了引入納米材料、引入官能團(tuán)、改變聚合條件等多種有益的嘗試[38]。此外，抗氧化水凝膠應(yīng)具有良好的成骨能力，可通過負(fù)載生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞以促進(jìn)損傷部位的修復(fù)，但應(yīng)思考抗氧化組分與所負(fù)載細(xì)胞及細(xì)胞因子之間的相互作用。目前研究雖然面臨著上述問題和挑戰(zhàn)，但相信在不久的將來，隨著研究的深入，抗氧化水凝膠將在未來具有廣闊的應(yīng)用前景。