TRPV4和TGF-β1在口腔鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

祖木熱提古麗·阿不來提 陳鐳雨 馬琰迪 何尚峰 熱孜亞古麗·阿克木 徐江

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，2018 年全球新增354 864 例惡性腫瘤病例，就有177 384 例死于口腔癌[1-2]。我國口腔頜面部的惡性腫瘤以鱗狀細胞癌最普遍，達到了80%。瞬時受體電位通路(Transient receptor potiential,TRP)超家族是一類大的非選擇性陽離子通道亞基，廣泛的分布在各種低高等生物中，參與多種細胞的功能調節(jié)，與多種癌癥有關[3]。其中，瞬時感受器電位香草酸受體亞型4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是非選擇性的陽離子通路，Ca、Na等陽離子的發(fā)卡狀通路，參與多種細胞功能[4]。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一個生物多效性的生長分化機制，在許多癌癥中異常高表達，而且也與癌癥的生物學行為密切相關。本實驗將采用免疫組織化學Envision法，測定在OSCC和癌旁正常組織中TRPV4、TGF-β1的表達情況，并探討TRPV4、TGF-β1表達與OSCC臨床特性和術后生存率之間的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本和資料收集

本實驗納入OSCC樣本103 例，同時選取癌旁正常組織66例(距離癌組織2 cm以上)，樣本來自于石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2004 年～2019 年間病理確診的病例石蠟組織。同時收錄了103 例蠟塊相對應的患者臨床病歷資料，包括姓名、性別、年齡、病理診斷、分化程度、T分期、N分期、TNM分期、確診日期、總生存時間等，并建立組織樣本信息庫。通過電話、醫(yī)院病歷或其他方法等103 例OSCC中隨訪例數為74 例。

1.2 主要試劑

兔抗TGF-β1多克隆抗體(Affinity公司，AF1027,美國)；稀釋濃度1∶200；TRPV4兔多克隆抗體(Abcam公司，ab94868，英國)；稀釋濃度1∶150；免疫組化試劑盒(北京市中杉金橋生物科技股份有限公司)。

1.3 實驗方法及結果判定

采用免疫組化EnVision二步法(ELPS)檢測TRPV4和TGF-β1的表達水平。實驗結果由兩名病理醫(yī)生隨機雙盲閱片和評分。采用判定準則：以綜合染色強度與陽性細胞總量比例作為評價。積分數=陽性染色細胞百分比評分×染色強度評分。百分比判定標準：0%～5%(0 分)、6%～25%(1 分)、26%～50%(2 分)、51%～75%(3 分)、76%～100%(4 分)。染色強度評分：無色(0 分)，淡黃色(1 分)，黃色(2 分)，棕黃色(3 分)，棕褐色(4 分)。陽性等級：0～4為陰性(-)，5～8為弱陽性(+)，9～12為陽性(++)。以(+～++)為陽性，(-)為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，OSCC組織中TRPV4和TGF-β1的表達水平和臨床病理特征間的相關性用χ2檢驗進行比較。 ROC曲線和AUC用于評估TRPV4和TGF-β1表達對于預測口腔鱗狀細胞癌的特異性和靈敏度。使用Kaplan-Meier方法對患者隨訪的生存情況進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學含義。做圖時均使用了Graphpad 5.0軟件。

2 結 果

2.1 TRPV4和TGF-β1在OSCC及癌旁正常組織中的表達

TRPV4和TGF-β1在OSCC及癌旁正常組織中的表陽性率分別為69.90%、74.76%和24.24%、19.70%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表 1，圖 1)。TRPV4、TGF-β1在OSCC及癌旁正常組織評分等級間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表 2，圖 2)。

表 1 OSCC及癌旁正常組織中TRPV4和TGF-β1的表達

表 2 OSCC及癌旁正常組織中TRPV4和TGF-β1的表達差異

圖 1 TRPV4和TGF-β1在不同組織中的表達(ELPS)

圖 2 TRPV4和TGF-β1在不同組織中的表達

2.2 TRPV4,TGF-β1在OSCC組織中的表達與臨床病理因素之間的關聯(lián)

TRPV4的表達與TNM分期，分化程度密切相關(P<0.05)，與年齡、性別、浸潤深淺、淋巴結轉移無相關性(P>0.05)；TGF-β1的表達與浸潤深度和淋巴結轉移有關(P<0.05)(表 3)。

表 3 TRPV4,TGF-β1表達與OSCC臨床病理因素之間的關聯(lián)

2.3 TRPV4,TGF-β1在OSCC組織中表達的相關性

經Spearman等級的相關分析，TRPV4與TGF-β1的表達，在103例OSCC組織中均呈正相關(r=0.211、P=0.033)(表 4)。

表 4 TRPV4和TGF-β1在口腔鱗狀細胞癌中表達的相關性

2.4 TRPV4,TGF-β1表達與OSCC的ROC曲線分析

本實驗使用ROC曲線分析TRPV4,TGF-β1在OSCC及對照組中免疫組化評分的診斷價值。結果顯示TRPV4,TGF-β1表達在OSCC的表達曲線下AUC值為(0.842，0.857)(圖 3)，用診斷臨界值確定OSCC的靈敏度和特異性。(診斷臨界點為5)。

圖 3 ROC分析TRPV4,TGF-β1在OSCC及對照組中免疫組化評分 圖 4 TRPV4,TGF-β1表達與OSCC患者預后的生存分析

2.5 TRPV4,TGF-β1表達與患者預后的關系

103 例OSCC中，74 例患者獲得臨床隨訪信息。Kaplan-Meier生存曲線比較OSCC中TRPV4,TGF-β1表達和患者預后的關系，結果如圖 4，高表達TRPV4,TGF-β1的OSCC患者生存時間顯著少于低表達患者(P=0.019 3、P<0.000 1)。

3 討 論

口腔鱗狀細胞是人類頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于各種癌癥的第九位，并且近年來呈逐漸上升趨勢[5]。與其他腫瘤相似，OSCC的發(fā)生發(fā)展是受多因素共同參與的過程，如環(huán)境、飲食、遺傳等。近年來OSCC的預防、早期診斷和治療預后，已成為全球備受重視的公共衛(wèi)生問題。

TRP通道是Pak等[6]在1969 年在突變性果蠅眼底視網膜光感受器上首次被發(fā)現(xiàn)。TRP超家族跟其他種類的研究一樣展現(xiàn)在的面前[7]。其中TRPV是較大、最多樣化的重要亞基[8]。有研究證實TRPV亞家族成員TRPV4參與調節(jié)多種癌癥的發(fā)病、發(fā)展，其功能并不一致。Yamada等[9]研究表明，TRPV4在實驗小鼠的膀胱尿路上皮基地細胞中高表達，4-aPDD激活TRPV4促進腫瘤的形成。與這些研究的結果恰恰相反，Adapala等[10]表明TRPV4在肺腫瘤起源的內皮細胞(TECs)中的表達明顯低于正常內皮細胞(ECs)促進血管形成與成熟，抑制腫瘤的生長。TRPV4在其他腫瘤領域已經廣泛研究，然而有關TRPV4在OSCC的表達情況報道卻鮮少。本研究結果顯示，TRPV4在OSCC中呈高表達，且表達明顯高于癌旁正常組織，結果與Fujii等[11]在OSCC中TRPV4高表達的研究結果一致，表明TRPV4表達很可能與OSCC的發(fā)生和進展相關。本研究還顯示TRPV4的表達水平和腫瘤的分化程度，以及與TNM分期相關(P<0.05)，高中分化OSCC組織中TRPV4的表達程度比低分化OSCC組織低，表明TRPV4可能參與了OSCC的惡變過程。

TGF-β1是TGF-β多功能多肽家族成員之一[12]，在多種腫瘤組織中表達異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。在本研究中發(fā)現(xiàn)OSCC組織中TGF-β1的表達明顯高于癌旁正常組織中(P<0.05)，結果與孫樂剛等[13]研究結果一致。宋陽等的研究表明[14]，TGF-β1誘導活化HSC-T6細胞，結果活化的HSC中TRPV4表達明顯升高。本研究經Spearman等級的相關分析，結果顯示TRPV4和TGF-β1在OSCC中的表達則呈正相關，提示二者可能對OSCC的發(fā)生、發(fā)展具有協(xié)同促進作用。本實驗通過ROC曲線分析，表明TRPV4和TGF-β1有較高診斷效能，并用ROC曲線確定了診斷臨界值，為今后診斷OSCC提供一種新的生物學檢測方法。在本研究中作者對納入患者進行隨訪，應用Kaplan-Meier法對患者生存分析，結果顯示TRPV4和TGF-β1高表達組患者的術后生存時間明顯低于低表達組，證明了TRPV4和TGF-β1與OSCC的患者生存率密切相關。

綜上所述，TRPV4和TGF-β1在OSCC中表達顯著升高，且TRPV4和TGF-β1高表達提示OSCC患者預后差，可能是診斷和預后判斷的潛在生物標志物。但是TRPV4和TGF-β1在OSCC中的作用機制及內在關系還需進一步深入研究。