lncRNA GAS5調(diào)控Notch通路對炎癥環(huán)境下牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響

何龍 云蔓 吳薇薇 翁海勇 王瓊超

牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)相似的免疫表型和多能分化特征[1]。據(jù)報道，炎性DPSCs的成骨能力低于正常DPSCs[2]，但對其機(jī)制的了解仍然有限。明確炎癥環(huán)境下DPSCs的成骨分化受到抑制的分子機(jī)制，對尋找有效的牙齒再生的藥物至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(long non-coding RNA growth arrest-specific transcript 5,lncRNA GAS5)在多種癌癥中受到抑制[3]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)microRNA-498上調(diào)RUNX2的表達(dá)來促進(jìn)hMSCs的成骨分化[4]；可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的成骨分化。在成人牙齒齲壞或受傷的牙髓區(qū)域的間充質(zhì)細(xì)胞中，Notch信號被上調(diào)[5]。Notch通路的激活可以抑制DPSCs的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并抑制間充質(zhì)祖細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化[6]。而lncRNA GAS5是與Notch信號相互作用的lncRNA之一[7]，GAS5的敲低與Notch通路的激活和細(xì)胞炎性損傷有關(guān)[8]。推測lncRNA GAS5可能調(diào)控Notch通路影響人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)成骨分化。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液和過表達(dá)lncRNA GAS5的慢病毒載體同時處理hDPSCs，探討其對成骨分化的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

hDPSCs(BFN60810649，上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gbico公司，美國)；LPS(L5293)(Sigma-Aldrich,美國)；RIPA裂解液(P0013B)(上海碧云天生物科技公司)；Trizol試劑(9108-1)；過表達(dá)lncRNA GAS5的慢病毒載體及其對照空載體(上海Gene Pharma公司)；Jagged-1(Notch通路的激動劑，HY-P1846A)(MedChemExpress公司，美國)；骨鈣素(osteocalcin，OCN)(ab93876)、Hey1(hairy and enhancer of split-related with YRPW motif 1)(ab154077)、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)(ab108937)、GAPDH(ab9485)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(Abcam公司,英國)。細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司,美國)；ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國)；IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) hDPSCs在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。每3 d補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時進(jìn)行傳代。取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理 將hDPSCs(第3代)以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種在6 孔板中，分為(1):正常對照組：細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)；(2)成骨誘導(dǎo)組：用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸、50 mg/mL抗壞血酸)培養(yǎng)hDPSCs；(3)LPS組：用含10 μg/mL LPS的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPSCs；(4)NC+LPS組：慢病毒對照空載體感染hDPSCs 72 h，然后用含10 μg/mL LPS的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPSCs；(5)GAS5過表達(dá)組：含有過表達(dá)lncRNA GAS5的慢病毒載體感染hDPSCs 72 h，然后用含10 μg/mL LPS的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPSCs；(6)Jagged-1組：用含10 μg/mL LPS和10 μmol/L Jagged-1的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPSCs；(7)GAS5過表達(dá)+Jagged-1組：在過表達(dá)lncRNA GAS5的慢病毒載體感染hDPSCs 72 h后，用含10 μg/mL LPS和10 μmol/L Jagged-1的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPSCs。每隔3 d更換新鮮培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察hDPSCs形態(tài)變化。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 將hDPSCs以每孔2×103個細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板中，在誘導(dǎo)分化的第1、3和7天用CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性。加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育細(xì)胞2 h。使用多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量各孔的光密度(A)值，以表示細(xì)胞增殖活性。

1.2.4 RT-qPCR檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5的表達(dá)量變化 取誘導(dǎo)分化14 d的hDPSCs，使用Trizol試劑分離總RNA。NanaDrop分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度；RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系(25 μL)：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA(200 ng/μL) 1 μL，ddH2O 11 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，進(jìn)行40 個循環(huán)。用GAPDH作為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。lncRNA GAS5正向引物：5′-GTGTGGCTCTGGATAGCAC-3′和反向引物：5′-ACCCAAGCAAGTCATCCATG-3′；GAPDH正向引物：5′-ACAGGGGAGGTGATAGCATT-3′和反向引物：5′-GACCAAAAGCCTTCATACATCTC-3′。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β水平 收集誘導(dǎo)分化14 d的hDPSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的說明書操作檢測上清液中TNF-α、IL-1β的水平。

1.2.6 比色法檢測hDPSCs中ALP活性 在誘導(dǎo)分化第7天，棄去培養(yǎng)液，使用0.1% TritonX-100裂解細(xì)胞，12 000 g離心10 min，取上清液，使用ALP活性檢測試劑盒測定上清液中ALP活性。

1.2.7 茜素紅染色檢測hDPSCs中鈣離子沉積情況

hDPSCs培養(yǎng)14 d，用4%多聚甲醛固定后，加入200 μL茜素紅S染液。顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)情況，拍照后使用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)鈣化結(jié)節(jié)染色陽性區(qū)域的面積及鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量。

1.2.8 Western blot檢測hDPSCs中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá) BCA蛋白測定法測定蛋白質(zhì)濃度。在室溫下用5%脫脂奶粉(溶于TBST，TBS加0.1%Tween-20)封閉1 h后，在4 ℃下用一抗(NICD、Hes1、Hey1、RUNX2、OCN，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000)孵育過夜。隨后，將膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L，1∶10 000)在室溫下孵育1 h。然后使用ECL顯色，使用Image-Pro Plus 6.0軟件量化條帶灰度值并以GAPDH為內(nèi)參對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs細(xì)胞形態(tài)

體外培養(yǎng)hDPSCs結(jié)果顯示，原代細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d，hDPSCs表現(xiàn)出典型的間充質(zhì)細(xì)胞特點(diǎn)，可見細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈長梭形，成纖維細(xì)胞樣生長(圖 1A)；原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)(正常對照組)，細(xì)胞貼壁生長呈旋渦狀(圖 1B)；用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)成骨分化后，hDPSCs仍具有成纖維細(xì)胞樣的梭形形態(tài)，但是較正常對照組培養(yǎng)基中的細(xì)胞更大，在鈣化沉淀區(qū)域有細(xì)胞簇形成(圖 1C)；經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞密度降低，稀疏，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞未見明顯伸展(圖 1D)；NC+LPS組細(xì)胞形態(tài)和LPS組相似(圖 1E)；GAS5過表達(dá)組細(xì)胞排列緊密，多為長梭形，呈漩渦樣生長，有細(xì)胞簇形成(圖 1F)；Jagged-1組細(xì)胞體積較小，細(xì)胞密集度不高，細(xì)胞多呈圓形，長梭形細(xì)胞較少(圖 1G)；GAS5過表達(dá)+Jagged-1組細(xì)胞體積有所增大，排列較為密集，長梭形細(xì)胞較Jagged-1組增多(圖 1H)。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較

圖 1 hDPSCs細(xì)胞形態(tài)(相差顯微鏡， ×400)

在誘導(dǎo)分化的第3和7天，與正常對照組相比，成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞的增殖活性升高(P<0.05)，而LPS組細(xì)胞的增殖活性降低(P<0.05)；與LPS組相比，GAS5過表達(dá)組細(xì)胞的增殖活性升高(P<0.05)，Jagged-1組細(xì)胞的增殖活性降低(P<0.05)；與GAS5過表達(dá)組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)；與Jagged-1組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05)(表 1)。

表 1 各組細(xì)胞增殖能力比較

Tab 1 Comparison of cell proliferation among the groups

表 1 各組細(xì)胞增殖能力比較

組 別1 d3 d7 d正常對照組0.24±0.030.50±0.060.71±0.08成骨誘導(dǎo)組0.25±0.050.63±0.07①0.82±0.11①LPS組0.22±0.040.38±0.05①0.41±0.06①NC+LPS組0.21±0.030.36±0.040.43±0.07GAS5過表達(dá)組0.27±0.050.72±0.08②0.95±0.10②Jagged-1組0.20±0.040.25±0.04②0.30±0.05②GAS5過表達(dá)+Jagged-1組0.23±0.040.49±0.06③④0.64±0.08③④

注： 與正常對照組相比， ①P<0.05； 與LPS組相比， ②P<0.05； 與GAS5過表達(dá)組相比， ③P<0.05； 與Jagged-1組相比， ④P<0.05

2.3 各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5的表達(dá)量變化

與正常對照組相比，成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5水平升高(P<0.05)，而LPS組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5水平降低(P<0.05)；與LPS組相比，GAS5過表達(dá)組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5水平升高(P<0.05)；與Jagged-1組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5水平升高(P<0.05)(表 2)。

表 2 各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5的表達(dá)量變化

2.4 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β水平變化

與正常對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；與LPS組相比，GAS5過表達(dá)組TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)，Jagged-1組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；與GAS5過表達(dá)組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；與Jagged-1組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)(表 3)。

2.5 各組細(xì)胞中ALP活性比較

與正常對照組相比，成骨誘導(dǎo)組ALP活性升高(P<0.05)，而LPS組ALP活性降低(P<0.05)；與LPS組相比，GAS5過表達(dá)組ALP活性升高(P<0.05)，Jagged-1組ALP活性降低(P<0.05)；與GAS5過表達(dá)組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組ALP活性降低(P<0.05)；與Jagged-1組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組ALP活性升高(P<0.05)(表 4)。

表 3 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β水平

表 4 各組細(xì)胞中ALP活性

2.6 各組細(xì)胞的礦化能力比較

與正常對照組相比，成骨誘導(dǎo)組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積增加(P<0.05)，而LPS組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積降低(P<0.05)；與LPS組相比，GAS5過表達(dá)組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積升高(P<0.05)，Jagged-1組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積降低(P<0.05)；與GAS5過表達(dá)組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積降低(P<0.05)；與Jagged-1組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積升高(P<0.05)(圖 2、表 5)。

圖 2 各組hDPSCs茜素紅染色(×200)

表 5 各組細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積

2.7 各組細(xì)胞中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)

與正常對照組相比，成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)降低，RUNX2、OCN蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，LPS組細(xì)胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)升高，RUNX2、OCN蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與LPS組相比，GAS5過表達(dá)組細(xì)胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)降低，RUNX2、OCN蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Jagged-1組NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)升高，RUNX2、OCN蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與GAS5過表達(dá)組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)升高，RUNX2、OCN蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與Jagged-1組相比，GAS5過表達(dá)+Jagged-1組NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)降低，RUNX2、OCN蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(表 6,圖 3)。

表 6 各組細(xì)胞中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖 3 各組細(xì)胞中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

炎癥環(huán)境不僅影響牙髓細(xì)胞的活力，還影響DPSCs的分化功能[9]。細(xì)菌主要成分LPS會誘導(dǎo)牙髓組織炎癥導(dǎo)致牙髓損傷，同時抑制hPDLSCs的成骨分化[10]。lncRNA GAS5在hDPSCs中的特異性激活促進(jìn)了成骨分化。這一發(fā)現(xiàn)提供了一種促進(jìn)hDPSCs成骨能力的有效方法。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA GAS5在hDPSCs的成骨分化誘導(dǎo)過程中的表達(dá)增加；而在LPS處理的炎癥條件下，hDPSCs的成骨分化被抑制時，其表達(dá)降低；同時研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA GAS5后，hDPSCs的增殖活性和成骨分化能力均較LPS組增加，提示：過表達(dá)lncRNA GAS5在炎癥環(huán)境中可促進(jìn)hDPSCs成骨分化。在本研究中，LPS可抑制hDPSCs的增殖和成骨分化，而另有文獻(xiàn)顯示LPS能夠促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并可通過增強(qiáng)hDPSCs進(jìn)入牙髓時的粘附和遷移來影響牙髓愈合[11]。這與本文研究結(jié)果不一致，經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，LPS對hDPSCs的影響具有時間依賴性和濃度依賴性[12]，結(jié)果不一致的原因可能與LPS的濃度有關(guān)。Notch信號通路調(diào)節(jié)牙髓組織中的多種生物過程，并可調(diào)節(jié)成骨分化[13]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NICD可抑制RUNX2、OCN的表達(dá)從而抑制成骨分化[14]，表明Notch信號通路的激活與成骨分化的抑制有關(guān)。此外，Notch信號被視為針對感染和炎癥驅(qū)動疾病的潛在治療靶點(diǎn)[15]，據(jù)報道，在LPS刺激或機(jī)械損傷后的牙髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Notch信號的體外和體內(nèi)激活[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理的hDPSCs中，TNF-α、IL-1β水平和NICD、Hes1、Hey1表達(dá)均升高，且使用Jagged-1后上述指標(biāo)進(jìn)一步升高，說明在炎癥環(huán)境下hDPSCs成骨分化受到抑制的過程中Notch信號通路被激活。Manokawinchoke等[17]的研究顯示Jagged-1可激活人牙周膜基質(zhì)細(xì)胞中的Notch信號通路，以劑量依賴性方式增強(qiáng)Hes1和Hey1 mRNA的表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。然而，另有研究顯示，Notch信號通路的激活對人牙髓和牙周膜細(xì)胞成骨分化和骨礦化具有促進(jìn)作用[18]，可能為Notch信號參與成骨分化的作用因細(xì)胞類型和分化階段而異。

同時本研究發(fā)現(xiàn)，在lncRNA GAS5過表達(dá)組中NICD、Hes1和Hey1的表達(dá)較LPS組降低，而RUNX2和OCN的表達(dá)較LPS組升高，說明過表達(dá)lncRNA GAS5可抑制Notch信號通路的激活，促進(jìn)hDPSCs成骨分化；此外，Jagged-1可明顯減弱lncRNA GAS5過表達(dá)對Notch信號通路的抑制作用和hDPSCs成骨分化的促進(jìn)作用，進(jìn)一步提示過表達(dá)lncRNA GAS5可能通過抑制Notch信號通路激活，增強(qiáng)炎癥環(huán)境下hDPSCs成骨分化。這與Li等[8]的研究一致，lncRNA GAS5可能通過抑制Notch信號通路改善LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥損傷。

綜上所述，lncRNA GAS5在hDPSCs成骨分化中上調(diào)，過表達(dá)lncRNA GAS5可增強(qiáng)炎癥環(huán)境下hDPSCs成骨分化能力，其作用機(jī)制可能與抑制Notch信號通路的激活有關(guān)。但由于體內(nèi)外環(huán)境存在較大差異，本研究結(jié)果尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。