微針注射納米脂肪治療兔耳增生性瘢痕的初步探討

盧焱純 張凱 牛強(qiáng) 叢丙峰 李云鵬 陸斌 張浚睿

增生性瘢痕是由于真皮組織損傷后膠原蛋白異常沉積和重塑而形成[1]，常伴隨表面皮膚紋理異常及色素沉著，不僅影響美觀，還給患者造成社交障礙及心理影響[2]。目前增生性瘢痕的治療選擇包括皮質(zhì)類固醇治療、激光治療和手術(shù)切除等，但這些治療方法未能有效消除多余的瘢痕組織，并再生健康的真皮組織[3]。

近年來自體脂肪在瘢痕治療中的應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)[4-5]。2013 年，比利時(shí)學(xué)者Tonnard等[6]提出了納米脂肪(Nanofat)移植技術(shù)，將其注射在真皮淺層可以達(dá)到改善瘢痕質(zhì)地和外觀的作用。但其注射方式依舊依靠傳統(tǒng)的單針單點(diǎn)多次注射，存在操作時(shí)間長，注射層次不均勻等不足[7-10]，新的治療手段亟待開發(fā)。

微針作為皮膚科常用的一種給藥途徑[11-13]?？梢源┩副砥て琳?，將藥液均勻注射于真皮淺層，具有操作時(shí)間短，注射層次均勻，患者疼痛不明顯等特點(diǎn)[14-15]。本研究旨在將納米脂肪移植技術(shù)和微針治療的優(yōu)勢相結(jié)合，將納米脂肪通過定深矩陣微針的方式均勻注射于瘢痕內(nèi)，觀察該方法對(duì)于增生性瘢痕質(zhì)地和外觀的改善作用，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

3 月齡體重約4 kg的雄性新西蘭大白兔(空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；新型微針E-Zinjector(廣州鉑朗公司)； qRT-PCR反應(yīng)試劑盒(Takara公司，日本)；Masson三色染色試劑盒(南京森貝伽有限公司)；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Beckman Coulter公司, 美國)；Real-time PCR儀(Bio-rad公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活性分析 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析納米脂肪中脂肪干細(xì)胞(adipose stem cells，ADSCs)的數(shù)量與活性。將微針儀器E-Zinjector和1 mL注射器裝載過的納米脂肪分別裝入自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀所配備的量杯內(nèi)，臺(tái)盼藍(lán)染料染色，利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測ADSCs的即刻活細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞率。

1.2.2 建立兔耳瘢痕模型 將8 只新西蘭大白兔靜脈麻醉后，用手術(shù)刀去除耳部表面皮膚、軟骨膜等，用紗布及電凝筆止血后暴露創(chuàng)面，并及時(shí)清理分泌物，每耳制備直徑約為1.5 cm的圓形缺損區(qū)2 個(gè)，即在同一只兔上建立4 個(gè)瘢痕模型。術(shù)后肌注青霉素10 萬U/kg進(jìn)行抗炎治療，每日觀測術(shù)區(qū)瘢痕愈合情況。

1.2.3 制作兔納米脂肪 將兔麻醉后，在背部做一縱行切口，提取脂肪。將取得的脂肪剪碎后放入注射器內(nèi)，采用將2 個(gè)注射器反復(fù)推注30 次的方式，使脂肪充分機(jī)械乳化，得到兔納米脂肪，以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用(圖 1)。

1.2.4 瘢痕治療實(shí)驗(yàn) 待創(chuàng)面完全上皮化后，每只兔建立的4 個(gè)兔耳瘢痕分別隨機(jī)采用：微針儀器注射生理鹽水(0.9%NaCl+E-Zinjector)、1 mL注射器注射生理鹽水(0.9%NaCl+Injector)、1 mL注射器注射納米脂肪 (Nanofat+Injector)、微針儀器注射納米脂肪(Nanofat+E-Zinjector)這4 種治療方法，均等量注射0.2 mL。在使用注射器注射時(shí)從瘢痕邊緣進(jìn)針至中間手動(dòng)緩慢推注。在使用微針儀器注射時(shí)，將機(jī)器調(diào)整為定量注射模式并設(shè)定為0.2 mL,然后將微針針頭固定在瘢痕正上方，按鍵即可實(shí)現(xiàn)機(jī)器自動(dòng)注射，按照實(shí)驗(yàn)分組，分別注射各組預(yù)定注射液。

圖 1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程

1.2.5 兔耳瘢痕取材及組織學(xué)檢測 瘢痕治療2 周后取材，將其置于4%多聚甲醛中固定后進(jìn)行石蠟包埋。通過HE染色,鏡下觀察拍照來計(jì)算瘢痕抬高指數(shù)(scar elevation index,SEI)，并通過Masson三色染色法來觀察瘢痕組織中膠原的增生及排列情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 兔耳瘢痕組織取材放入液氮冷凍后，提取組織總RNA, 并測量各組樣本RNA的濃度和純度。采用β-actin為內(nèi)參，本實(shí)驗(yàn)檢測的基因序列如表 1。

表 1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行活細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞率的組間比較，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析與LSD事后檢驗(yàn)進(jìn)行SEI的組間比較，采用單因素方差分析與LSD事后檢驗(yàn)進(jìn)行基因表達(dá)的組間比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微針(E-Zinjector)負(fù)載的方式對(duì)納米脂肪中ADSCs的活性沒有影響

使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測ADSCs的即刻活細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞率,結(jié)果顯示(圖 2)， Nanofat+E-Zinjector組與Nanofat+Injector組的即刻活細(xì)胞計(jì)數(shù)與活細(xì)胞率并無顯著性差異(P>0.05)。表明微針的負(fù)載方式對(duì)納米脂肪中的ADSCs活性無明顯影響，因此可以使用E-Zinjector負(fù)載納米脂肪。

圖 2 不同負(fù)載方式的注射劑即刻活細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞率

2.2 納米脂肪可有效抑制瘢痕組織增生

兔耳瘢痕模型構(gòu)建3 周后，肉眼觀察可見所有傷口均完全重新上皮化，形成增生性瘢痕。在采用4 種不同治療方法治療2 周后，可見0.9%NaCl+E-Zinjector組和0.9%NaCl+Injector組的瘢痕較厚、明顯突出于周圍正常組織，表面不平整，存在瘢痕攣縮的現(xiàn)象，觸摸較為僵硬。而Nanofat+Injector組和Nanofat+E-Zinjector組瘢痕較為平整，質(zhì)地柔軟并逐漸與周圍正常組織相似(圖 3)。

圖 3 兔耳瘢痕治療前后瘢痕形態(tài)

對(duì)術(shù)區(qū)組織進(jìn)行取材，HE組織學(xué)染色結(jié)果表明，0.9%NaCl+E-Zinjector組和0.9%NaCl+Injector組瘢痕顯著增厚，而Nanofat+Injector組和Nanofat+E-Zinjector組瘢痕類似正常組織厚度，且表面較平坦。通過計(jì)算比較SEI值發(fā)現(xiàn)，Nanofat+Injector組的SEI值顯著低于0.9%NaCl+Injector組(1.28±0.14vs1.62±0.18,P<0.01,n=8)，Nanofat+E-Zinjector組SEI值顯著低于0.9%NaCl+E-Zinjector組(1.12±0.13vs1.57±0.17,P<0.001,n=8)。此外，Nanofat+E-Zinjector組的SEI值明顯低于Nanofat+Injector組(1.12±0.13vs1.28±0.14，P<0.05,n=8)，說明使用微針注射納米脂肪對(duì)瘢痕的治療效果最佳(圖 4)。

圖 4 兔耳瘢痕治療后的組織學(xué)檢測結(jié)果

采用Masson染色觀察膠原增生及排列，可見Nanofat+Injector組和Nanofat+E-Zinjector組膠原較為稀疏且排列整齊有序，而0.9%NaCl+E-Zinjector組和0.9%NaCl+Injector組膠原致密，排列雜亂(圖 5)。

圖 5 兔耳瘢痕治療后的組織學(xué)(Masson染色)

2.3 納米脂肪可使瘢痕相關(guān)基因表達(dá)水平顯著下調(diào)

qRT-PCR結(jié)果顯示Nanofat+E-Zinjector組較0.9%NaCl+E-Zinjector組的α-SMA的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01), 及I型膠原的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。此外Nanofat+E-Zinjector較Nanofat+Injector組的α-SMA的mRNA與I型膠原的mRNA表達(dá)水平存在顯著性差異(P<0.05)，提示微針注射Nanofat的方法更有利于下調(diào)瘢痕相關(guān)基因的表達(dá)水平(圖 6)。

圖 6 各組α-SMA及I型膠原mRNA表達(dá)

3 討 論

增生性瘢痕常見于深度創(chuàng)傷、嚴(yán)重?zé)齻虼髣?chuàng)傷手術(shù)后, 大多數(shù)患者遭受神經(jīng)性疼痛和瘙癢等癥狀，預(yù)后較差?，F(xiàn)有的治療方案不能滿足患者和醫(yī)生對(duì)預(yù)后的訴求，臨床診治中迫切需要治療增生性瘢痕的有效方法[16]。目前納米脂肪移植在增生性瘢痕中的作用的相關(guān)研究較少，具有很大的研究價(jià)值。本研究通過構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型，旨在探究納米脂肪通過微針注射對(duì)增生性瘢痕的治療效果。研究結(jié)果表明，微針的負(fù)載方式對(duì)納米脂肪中的ADSCs活性無影響，使用微針E-Zinjector負(fù)載納米脂肪安全可靠，并且微針E-Zinjector及1 mL注射器注射納米脂肪均能有效抑制瘢痕增生，使瘢痕組織的厚度減少，膠原纖維排列有序，同時(shí)瘢痕相關(guān)基因α-SMA及I型膠原mRNA表達(dá)水平下調(diào)，能夠促使瘢痕組織向正常組織形態(tài)轉(zhuǎn)化。

已有研究表明，納米脂肪中沒有活性的成熟脂肪細(xì)胞及正常的脂肪組織結(jié)構(gòu),但含有大量的ADSCs[17]，瘢痕組織的特點(diǎn)是微血管密度低，氧氣含量低，慢性缺氧下產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)增強(qiáng)TGF-β1/Smad途徑的激活和膠原蛋白的沉積[18-19]，而ADSCs分泌的蛋白能保護(hù)人類真皮乳頭細(xì)胞免受ROS引起的細(xì)胞毒性損傷[20]。ADSCs還可以通過促進(jìn)血管生成，誘導(dǎo)常駐組織細(xì)胞有絲分裂，并重塑細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)來抑制纖維化[21-22]。因此，本研究推測納米脂肪中的ADSCs能夠顯著改善瘢痕的形成。

基于上述理論基礎(chǔ)，本研究還發(fā)現(xiàn)，Nanofat+E-Zinjector組的SEI值低于Nanofat+Injector組，并且Nanofat+E-Zinjector組的α-SMA和I型膠原的mRNA表達(dá)量較Nanofat+Injector組更低，提示使用微針儀器裝載納米脂肪注射比使用1 mL注射器皮內(nèi)注射對(duì)瘢痕的改善效果更顯著。其主要原因在于微針作為一種有效的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery systems，TDDS) 能夠直接穿透皮膚并以更少的創(chuàng)傷創(chuàng)建微通道[14]，在對(duì)納米脂肪進(jìn)行注射時(shí)，微針儀器可以調(diào)節(jié)注射速度，使納米脂肪中的ADSCs以一定量的液體運(yùn)動(dòng)速度注入皮膚瘢痕，產(chǎn)生的液流是層流為主而不是湍流[23]，在這種情況下細(xì)胞所受的壓力、剪切力較小，不會(huì)發(fā)生裂解，使得納米脂肪能夠得到充分利用。其次因?yàn)槲⑨槂x器有多個(gè)定深且呈矩陣狀排列的細(xì)針頭，可以使納米脂肪注射于增生性瘢痕后，呈均勻分布，增強(qiáng)其治療效果。已有研究證明將曲安奈德(TA)和5-氟尿嘧啶(5-FU)制成雙相溶解微針來治療增生性瘢痕比這兩種藥物的混懸劑皮內(nèi)多次注射的效果好，且患者痛苦少，依從性高[24]。因此本研究將納米脂肪裝載于微針儀器中進(jìn)行瘢痕治療實(shí)驗(yàn)，能夠更有效地減少瘢痕組織形成，促進(jìn)正常組織再生。

另外，微針注射的方式在實(shí)際臨床治療中具有良好的可行性和操作便利性。相較于傳統(tǒng)注射器注射，其優(yōu)勢在于操作時(shí)間短，還可以根據(jù)醫(yī)生的需求進(jìn)行定量及定速輸注，同時(shí)注射時(shí)阻力小，患者疼痛程度減輕。

綜上所述，利用E-Zinjector負(fù)載納米脂肪能夠有效結(jié)合微針遞送和納米脂肪再生的優(yōu)勢，有效抑制增生性瘢痕，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。