短時黑蒜體外抗氧化活性及其多酚提取優(yōu)化

李靜，葛世浩，多佳 ，嚴歡 ，馬夢亞，劉軍*

1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院（烏魯木齊 830046）；2.中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆維吾爾自治區(qū)環(huán)境污染與生態(tài)修復重點實驗室（烏魯木齊 830011）；3.中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所，荒漠綠洲生態(tài)建設國家工程技術(shù)研究中心（烏魯木齊 830011）；4.中國科學院大學（北京 100049）；5.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院（烏魯木齊 830011）；6.新疆特色功能食品營養(yǎng)與安全檢測重點實驗室，新疆分析測試研究院（烏魯木齊 830011）

黑蒜（black garlic）是一種以鮮蒜大蒜為原料，在嚴格控制的高溫高濕下發(fā)酵1個月至數(shù)個月得到的大蒜產(chǎn)品[1]。在發(fā)酵過程中，大蒜內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，從而促進各類物質(zhì)接觸發(fā)生酶促及非酶促反應如美拉德反應等[2-3]。其中的刺激性物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變而使其風味更加溫和，具有更好的感官特性和適口性[4]。同時生物活性物質(zhì)含量急劇升高，使得黑蒜具有較強的抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等功效和更低的致敏性[5-7]，其中突出的是其抗氧化活性。多酚與黑蒜的抗氧化性密不可分[8]，它是一種具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，多具有較強的抗氧化性，研究表明黑蒜中的多酚具有較強的抗氧化活性，且含量是鮮蒜中的5倍以上[9-10]，但因其產(chǎn)量較低難以在工業(yè)中大規(guī)模應用。

黑蒜作為一種新型大蒜深加工產(chǎn)品，具有不同于傳統(tǒng)大蒜產(chǎn)品的獨特營養(yǎng)成分與功能，在歐美與東亞地區(qū)備受研究者與消費者青睞。傳統(tǒng)的黑蒜生產(chǎn)工藝主要為發(fā)酵法，生產(chǎn)周期為1個月乃至數(shù)月，耗時長，成本高，產(chǎn)能小，使得黑蒜的推廣與發(fā)展受到阻礙[11]。前期以新疆吉木薩爾白皮大蒜為原料研發(fā)出一種短時加工的富含多酚的高抗氧化性黑蒜[12]，將生產(chǎn)周期縮短至9 h，極大降低黑蒜的生產(chǎn)成本，同時保證黑蒜的風味與感官品質(zhì)。試驗旨在通過比較短時黑蒜與鮮蒜、市售黑蒜的總酚含量和抗氧化活性，確認短時黑蒜在抗氧化方面的生物活性及研究價值，進一步對其中的多酚提取優(yōu)化，為黑蒜多酚的進一步開發(fā)與應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜（新疆維吾爾自治區(qū)昌吉自治州吉木薩爾縣新地鄉(xiāng)）；短時黑蒜（自主研制加工）；市售黑蒜（北京六必居食品有限公司）。

沒食子酸（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；福林酚試劑（1 mol/L，上海源葉生物科技有限公司）；無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸（均為分析純，天津市盛奧化學試劑有限公司）；三氯化鐵、鐵氰化鉀（均為分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司）；3%過氧化氫（山東安捷高科消毒科技有限公司）；三氯乙酸（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；L-抗壞血酸（分析純，上海藍季科技發(fā)展有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；無水乙醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司）。

1.2 儀器與設備

GL-20G-II冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；Thermo Multiskan Sky全波長酶標儀（上海土森視覺科技有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋、SHA-B水浴恒溫振蕩器、101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；JA2003電子天平（上海衡際科學儀器有限公司）；MT-V-30礫鼎超純水儀（上海礫鼎水處理設備有限公司）；DFT-50A手提式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 體外抗氧化活性評價

1.3.1.1 總酚含量的測定

準確稱取1.25 g蒜樣，加入70%乙醇研磨成漿后定容至25 mL。超聲30 min后過濾取濾液備用。采用Folin-Ciocalteus法測定提取物中總酚含量[13]。

1.3.1.2 體外抗氧化活性的測定

按照鄭嵐等[14]的方法，測定DPPH自由基清除能力及Fe3+還原力；羥自由基清除能力采用鄰二氮菲-Fe2+自氧化法（Fenton法）測定[15]。

1.3.2 短時黑蒜中多酚提取優(yōu)

1.3.2.1 單因素試驗

將蒜樣置于恒溫干燥箱中60 ℃烘干至恒重，高速粉碎機打粉后收集，于4 ℃避光保存。

取1 g短時黑蒜粉加入以一定料液比加入相應體積的乙醇溶劑，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩一定時間后取出，將所得溶液定容至50 mL，然后按4 000 r/min離心10 min，取上清液檢測總酚含量。

分別在固定其他條件的前提下改變?nèi)軇舛龋?0%，40%，50%，60%和70%）、提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、提取時間（5，10，15，20和25 min）和料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）后檢測提取液中總酚含量，評價不同因素對于多酚提取的影響。

1.3.2.2 響應面優(yōu)化設計

以單因素結(jié)果為基礎，利用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken試驗設計。自變量為A（溶劑濃度）、B（提取溫度）、C（提取時間）、D（料液比），響應值為總酚含量。

表1 試驗因素水平表

1.3.3 短時黑蒜多酚的純化及抗氧化活性評價

采用響應面優(yōu)化結(jié)果提取短時黑蒜粗多酚獲得浸出液，使用大孔樹脂D101對短時黑蒜粗多酚進一步純化，動態(tài)吸附上樣濃度1 mL/min，吸附完全后使用去離子水洗至洗脫液無色，使用70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，凍干待測。

1.3.4 統(tǒng)計分析

上述試驗均進行3次重復試驗。使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，GraphPad Prism 8.0.2進行作圖與方差分析，Design-Expert 8.0.6進行響應面試驗設計與結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 短時黑蒜體外抗氧化活性評價

2.1.1 鮮蒜、短時黑蒜與市售黑蒜總酚含量比對

如圖1所示，鮮蒜、市售黑蒜與短時黑蒜中的總酚含量均值分別為0.67，4.56和4.73 mg/g，短時黑蒜中的總酚含量與市售黑蒜無顯著性差異（P＞0.05），且顯著高于鮮蒜中總酚含量（P＜0.05），為鮮蒜中含量的7倍左右。

圖1 鮮蒜、市售黑蒜與短時黑蒜總酚含量比對

2.1.2 DPPH自由基清除能力

如圖2所示，隨著質(zhì)量濃度的升高，鮮蒜、短時黑蒜及市售黑蒜對于DPPH清除率升高，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。其中，鮮蒜的DPPH清除水平遠低于短時黑蒜和市售黑蒜，最大僅為21.64%，在高、中、低3個濃度下清除率均顯著低于陽性對照（P＜0.05）。中低濃度下，短時黑蒜的DPPH清除能力顯著高于市售黑蒜，清除率分別為30.65%和94.95%，分別為市售黑蒜清除率的3.73和2.93倍，且在中濃度下，短時黑蒜的清除能力與陽性對照VC無顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)計算得市售黑蒜與短時黑蒜的EC50分別為8.09和0.834 3 mg/mL。因此，可認為短時黑蒜相比市售黑蒜和鮮蒜具有更強DPPH清除能力。

圖2 鮮蒜、市售黑蒜與短時黑蒜DPPH清除能力

2.1.3 羥自由基清除能力

圖3為鮮蒜、短時黑蒜及市售黑蒜對羥自由基清除率。在低濃度下，短時黑蒜的羥自由基清除能力顯著高于鮮蒜與市售黑蒜（P＜0.05）。在中濃度下，鮮蒜的羥自由基清除能力顯著高于短時黑蒜與市售黑蒜（P＜0.05）。在高濃度下，鮮蒜與市售黑蒜的清除率分別為59.19%和49.39%，短時黑蒜的羥自由基清除率達到87.05%，分別為鮮蒜和市售黑蒜的1.47和1.76倍，羥自由基清除能力顯著高于鮮蒜與市售黑蒜（P＜0.05），且與低濃度下陽性對照VC的清除能力無顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)計算可知鮮蒜、短時黑蒜與市售黑蒜的EC50分別為12.18，4.805和81.45 mg/mL。因此，短時黑蒜在高濃度下相較于鮮蒜與市售黑蒜有更好的清除羥自由基效果。

圖3 鮮蒜、市售黑蒜與短時黑蒜羥自由基清除能力

2.1.4 Fe3+還原力測定

圖4為鮮蒜、短時黑蒜、市售黑蒜以及陽性對照VC在低、中、高3個濃度下的Fe3+還原力。短時黑蒜的還原力在低、中、高濃度下均顯著高于鮮蒜與市售黑蒜還原力（P＜0.05）。隨著濃度升高，高濃度下短時黑蒜的還原力達到2.473，為市售黑蒜的1.7倍，鮮蒜的9倍，是相同濃度下陽性對照VC的還原力的85%。因此，短時黑蒜在還原力方面優(yōu)于鮮蒜與市售黑蒜。

圖4 鮮蒜、市售黑蒜與短時黑蒜Fe3+還原力

2.2 短時黑蒜中總酚提取的單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 溶劑濃度對短時黑蒜總酚得率的影響

如圖5所示，溶劑濃度30%～50%時，短時黑蒜總酚得率隨溶劑濃度升高呈上升趨勢，溶劑濃度達到50%時，總酚得率到達最大值12.02 mg/g，隨著溶劑濃度繼續(xù)升高，總酚得率呈現(xiàn)下降趨勢?？赡艿脑蚴嵌虝r黑蒜中多酚類成分的極性與50%乙醇溶液最為接近，此濃度下多酚更容易溶出。因此選擇溶劑濃度50%作為最優(yōu)水平。

圖5 溶劑濃度對短時黑蒜總酚得率的影響

2.2.2 提取溫度對短時黑蒜總酚得率的影響

如圖6所示，提取溫度30～40 ℃時，短時黑蒜的總酚得率出現(xiàn)短暫升高，在40 ℃達到最大值11.93 mg/g，提取溫度40～70 ℃時，總酚得率隨著溫度升高而逐漸下降?？赡艿脑蚴窃谶_到最佳提取溫度之前隨著溫度的升高，多酚的析出與溶解得到促進，但隨著溫度繼續(xù)升高，多酚的氧化速度被加快，空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時溫度升高會促進雜質(zhì)析出，與多酚結(jié)合形成沉淀，從而影響最終得率[16-17]。因此選擇提取溫度40 ℃作為最優(yōu)水平。

圖6 提取溫度對短時黑蒜總酚得率的影響

2.2.3 提取時間對短時黑蒜總酚得率的影響

如圖7所示，在10 min之前，隨著時間的延長，總酚得率逐漸升高，在10 min時達到最大值12.09 mg/g，隨著時間繼續(xù)延長，總酚得率逐漸降低。由于在短時黑蒜生產(chǎn)過程中高溫高壓破壞大蒜的細胞結(jié)構(gòu)，導致提取時間大幅減少。但隨著提取時間繼續(xù)延長，許多雜質(zhì)成分溶解出來，與多酚結(jié)合沉淀，影響總酚得率[18]。因此選擇提取時間10 min作為最優(yōu)水平。

圖7 提取時間對短時黑蒜總酚得率的影響

2.2.4 料液比對短時黑蒜總酚得率的影響

如圖8所示，料液比從1∶5（g/mL）變化至1∶10（g/mL）過程中，短時黑蒜的總酚得率逐漸升高，料液比1∶10（g/mL）時達到最大得率12.07 mg/g，隨著液體占比繼續(xù)提高，總酚得率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。這可能是由于液體占比較低時，提取溶劑達到飽和，隨著液體占比逐漸升高，多酚得到更完全的溶解，但液體占比進一步提高，多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分析出增加，對多酚的穩(wěn)定造成影響。因此選擇料液比1∶10（g/mL）作為最優(yōu)水平。

圖8 料液比對短時黑蒜總酚得率的影響

2.3 短時黑蒜中總酚提取的響應面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 響應面設計與結(jié)果

以單因素試驗結(jié)果為基礎，使用Design-Expert 8.0.6設計響應面試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 響應面設計與結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立及顯著性分析

對響應面結(jié)果進行多元回歸分析可得模型的回歸方程：Y=11.88+0.12A+0.21B+0.19C-0.015D-0.035AB-0.51AC-0.63AD-0.50BC-0.60BD-0.56CD-0.43A2-0.64B2-0.53C2-0.52D2，R2=0.964 5。

表3為回歸模型方差分析表?？梢钥闯觯耗Ｐ偷腜值＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項為0.297 7＞0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.964 5，表明該模型可以較好反映在短時黑蒜多酚提取過程中的各因素之間的交互影響并對優(yōu)化結(jié)果進行預測。

表3 回歸模型方差分析表

通過比較F值可知，對于短時加工黑蒜總酚得率的影響大小可表示為B（提取溫度）＞C（提取時間）＞A（溶液濃度）＞D（料液比），通過比較P值可知除了A（溶劑濃度）與B（提取溫度）交互影響不顯著外，其余交互作用均為極顯著。

2.3.3 響應面分析

使用Design-Expert 8.0.6做出響應面圖及等高線圖，如圖9所示，等高線圖呈現(xiàn)出圓形或橢圓形，橢圓形的程度越大表明2個因素間的交互作用越明顯，等高線越密集則該因素的影響越大，表現(xiàn)在響應面圖上為模型越為陡峭。綜合圖形，對短時黑蒜總酚得率的影響排序為B（提取溫度）＞C（提取時間）＞A（溶劑濃度）＞D（料液比）。

圖9 四因素交互作用對短時黑蒜總酚得率影響的等高線圖與響應面圖

2.3.4 響應面結(jié)果驗證

根據(jù)響應面模型擬合得到短時黑蒜中總酚提取的最優(yōu)工藝：溶劑濃度45.48%、提取溫度44.133 ℃、提取時間10.264 min、料液比1∶13.815（g/mL），預測的得率為11.97 mg/g。為方便實際操作，實際取值為溶劑濃度45%、提取溫度44 ℃、提取時間10 min、料液比1∶14（g/mL）。在該條件下進行驗證試驗可得，短時黑蒜多酚得率為11.99 mg/g，與預測值極為接近，標準偏差為0.02，因此該模型作為優(yōu)化短時黑蒜總酚提取得率的模型可靠。

2.3.5 純化結(jié)果與體外抗氧化活性評價

經(jīng)檢測，大孔樹脂D101純化得到的短時黑蒜粗多酚中總酚含量為65.28%，與短時黑蒜粗提物和陽性對照VC對比DPPH清除能力結(jié)果如圖10所示。短時黑蒜粗提物和粗多酚的EC50分別為0.94和0.12 mg/mL，相同質(zhì)量濃度下粗多酚的DPPH清除能力均顯著高于短時黑蒜粗提物（P＜0.05），且在0.6～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度下粗多酚的DPPH清除率高于陽性對照VC，可見短時黑蒜粗多酚具有極強的抗氧化能力。

圖10 短時黑蒜粗提物與短時黑蒜粗多酚DPPH清除率

3 結(jié)果與討論

通過對比與評價總酚含量、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力及Fe3+還原能力對鮮蒜、短時黑蒜及市售黑蒜的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，短時黑蒜在總酚含量上顯著高于鮮蒜，但與對比傳統(tǒng)發(fā)酵型黑蒜無顯著性差異，在DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和Fe3+還原能力方面均顯著優(yōu)于鮮蒜和市售黑蒜。其原因可能是短時黑蒜區(qū)別于傳統(tǒng)黑蒜的前處理方式，高溫高壓前處理使得鮮蒜細胞結(jié)構(gòu)破裂，酸性物質(zhì)溢出使得pH降低，在酸和酶的作用下水解單寧水解產(chǎn)生小分子的分羧酸和多元醇，加速黑蒜多酚的產(chǎn)生，在此過程中產(chǎn)生的多酚在結(jié)構(gòu)和種類與發(fā)酵黑蒜中可能存在差異，同時因加工工藝不同，產(chǎn)生如類黑素等活性物質(zhì)也對短時黑蒜的抗氧化活性起到促進作用，需要進一步進行純化和成分鑒定[19]。

作為黑蒜抗氧化活性的主體成分——多酚，近年來在功能性應用中備受關(guān)注，由于短時黑蒜的特殊加工在高溫高壓的預處理過程中使大蒜的細胞結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞，烘干打粉后短時黑蒜的內(nèi)容物大量釋放，更易融入乙醇溶劑液，與樣品接觸面積增大，因而提取效率較高，使得該方法消耗少、得率高[20-22]。 通過響應面法優(yōu)化，得到短時黑蒜中總酚的提取工藝，即溶劑濃度45%、提取溫度44 ℃、提取時間10 min、料液比1∶14（g/mL），最優(yōu)提取工藝下短時黑蒜的總酚得率為11.99 mg/mL，與已有報道得率大致相同，但工藝上更為簡便，耗時更短[23]。對優(yōu)化后所得短時黑蒜粗提物使用大孔樹脂D101進行初步純化，得到總酚含量為65.28%的粗多酚產(chǎn)物，其DPPH清除率顯著高于粗提物，隨著質(zhì)量濃度升高甚至高于陽性對照VC，表明短時黑蒜的抗氧化活性與其中多酚密切相關(guān)。

4 結(jié)論

短時黑蒜在總酚含量上顯著高于鮮蒜，對比傳統(tǒng)發(fā)酵型黑蒜無顯著性差異，但其抗氧化能力優(yōu)于鮮蒜和市售黑蒜。通過響應面法優(yōu)化短時黑蒜中總酚的提取工藝，最優(yōu)提取工藝下短時黑蒜的總酚得率為11.99 mg/mL。對優(yōu)化后所得短時黑蒜粗提物使用大孔樹脂D101進行初步純化，得到總酚含量為65.28%的粗多酚產(chǎn)物，其DPPH清除率顯著高于粗提物，表明短時黑蒜的抗氧化活性與其中多酚含量呈正相關(guān)。短時黑蒜相較于傳統(tǒng)發(fā)酵型黑蒜具有更強的體外抗氧化活性，其多酚的進一步分離純化對今后相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)具有一定價值。