ame-miR-79負(fù)調(diào)控意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道中靶基因CYP450和FG的表達(dá)

張凱遙,劉佳美,張文德,胡 穎,康育欣,王紫馨,王思懿,錢加珺,趙 蕭,張佳欣,陳大福,2,郭 睿,2,*,付中民,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所,福州 350002)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica是西方蜜蜂Apismellifera的一個優(yōu)良亞種，在我國和許多國家的養(yǎng)蜂生產(chǎn)中廣泛使用，具有產(chǎn)卵多、采集力強(qiáng)和分泌蜂王漿能力強(qiáng)等特點(梁勤和陳大福,2009)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度介于18～24 nt的小非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)，主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用。隨著技術(shù)手段的持續(xù)進(jìn)步及相關(guān)研究的不斷深入，大量miRNA在真核生物、原核生物乃至病毒中被鑒定發(fā)現(xiàn)，并被證實在生長、發(fā)育和免疫等諸多生物學(xué)過程中起到重要作用(Ambros,2004;Luetal.,2005)。例如，miRNA可參與調(diào)控秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的發(fā)育時間(Leeetal.,1993)，果蠅Drosophila的細(xì)胞死亡和脂肪代謝(Xuetal.,2003)，哺乳動物的造血功能(Helwaketal.,2013)及植物的葉片發(fā)育和花的形態(tài)(Reinhartetal.,2002)。前人對蜜蜂miRNA進(jìn)行了較多研究，結(jié)果表明miRNA可參與調(diào)節(jié)蜜蜂的記憶形成、勞動分工、級型分化、免疫防御及蜂王繁殖等過程(Shietal.,2015;Freitasetal.,2017;Liuetal.,2017;Chenetal.,2020)。

蜜蜂腸道是食物消化、營養(yǎng)吸收和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部位(梁勤和陳大福,2009)。然而，西方蜜蜂腸道的miRNA(或發(fā)育)相關(guān)研究較少且主要集中在腸道微生物方面(Kwongetal.,2017;Doschetal.,2021)，而關(guān)于miRNA調(diào)控蜜蜂腸道發(fā)育的研究匱乏。此前，熊翠玲等(2018)對意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道m(xù)iRNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析，共鑒定到560個新miRNA和45個保守miRNA；并通過解析miRNA差異表達(dá)譜揭示了差異表達(dá)miRNA在意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道發(fā)育中的潛在調(diào)控作用(郭睿等,2018)。miR-79能夠抑制家蠶Bombyxmori不同發(fā)育時期BmEm4的表達(dá)(Xuetal.,2019)。miR-79還可參與對刺參Apostichopusjaponicus代謝速率的抑制(Chen and Storey,2014)。Pedersen等(2013)研究發(fā)現(xiàn)miR-79缺失可導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲表皮中SQV-5和SQV-7的失調(diào)進(jìn)而引起神經(jīng)發(fā)育缺陷。在蜜蜂中，miR-79的相關(guān)研究至今仍然缺失，miR-79是否參與調(diào)控蜜蜂幼蟲的腸道發(fā)育尚不清楚。

前期研究中，筆者所在團(tuán)隊對意大利蜜蜂工蜂4-6日齡幼蟲腸道組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測到包括ame-miR-79在內(nèi)的560個miRNA(熊翠玲等,2018)。在此基礎(chǔ)上，本研究利用分子生物學(xué)手段對預(yù)測到的ame-miR-79進(jìn)行序列驗證，然后進(jìn)行靶向預(yù)測和相關(guān)分析，進(jìn)一步通過飼喂相應(yīng)的模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)分別對意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)的ame-miR-79進(jìn)行過表達(dá)和敲減，并檢測過表達(dá)和敲減后ame-miR-79及靶基因的表達(dá)水平，以期揭示ame-miR-79調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)幼蟲腸道發(fā)育的潛在作用，為闡明背后的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料

本研究中所使用的意大利蜜蜂工蜂幼蟲取自福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)教學(xué)蜂群。

1.2 ame-miR-79的Stem-loop RT-PCR和Sanger測序驗證

根據(jù)前期預(yù)測到的ame-miR-79序列(UAAAGC UAGAUUACCAAAGCA)(熊翠玲等,2018)設(shè)計特異性的Stem-loop引物和正向引物及通用的反向引物(表1)，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行合成。利用RNA抽提試劑盒(Promega，美國)提取意大利蜜蜂工蜂6日齡幼蟲腸道樣品的總RNA，利用Stem-loop引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，連接pMD-19T載體(TaKaRa，日本)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根，中國)，克隆產(chǎn)物涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐抗生素)，置于37℃生化箱培養(yǎng)過夜。挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基(含氨芐抗生素)中振蕩培養(yǎng)12 h，取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果為陽性的菌液送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行Sanger測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼喂與腸道樣品制備

將意大利蜜蜂蜂群的子脾提至實驗室，使用移蟲針將巢房內(nèi)的意大利蜜蜂工蜂2日齡幼蟲快速移至48孔培養(yǎng)板。按照筆者所在團(tuán)隊已建立的方法(郭睿等,2018,2019b)進(jìn)行意大利蜜蜂工蜂幼蟲的人工飼養(yǎng)。根據(jù)ame-miRNA-79的核苷酸序列，委托北京擎科生物科技有限公司合成mimic-ame-miR-79(UAAAGCUAGAUUACCAAAGCA,CUUUGG UAAUCUAGCUUUAUU),inhibitor-ame-miR-79(UG CUUUGGUAAUCUAGCUUUA),及對應(yīng)的陰性對照無義模擬物(nonsense mimic,mimic-NC)(UUCUCC GAACGUGUCACGUTT,ACGUGACACGUUCGGAGA ATT)和無義抑制物(nonsense inhibitor,inhibitor-NC)(CAGUACUUUUGUGUAGUACAA)，分別配制含上述模擬物或抑制物的50 μL飼料(終濃度均為20 pmol/g)，加入培養(yǎng)板孔內(nèi)以飼喂3日齡幼蟲，每24 h更換一次飼料(體積為50 μL，含有模擬物或抑制物，終濃度為20 pmol/g)，連續(xù)飼喂3次，飼養(yǎng)幼蟲至6日齡。在超凈臺中分別剖取4,5和6日齡幼蟲腸道，小心去除粘附的脂肪體，每3只腸道放入1個無菌的RNA-Free EP管，液氮速凍迅速轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。本實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 RT-qPCR檢測ame-miR-79的過表達(dá)和敲減效果

利用RNA抽提試劑盒(Promega，美國)分別提取1.3節(jié)4,5和6日齡幼蟲腸道樣品的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞，中國)和Stem-loop引物對ame-miR-79進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA作為ame-miR-79的qPCR檢測模板。利用Oligo dT引物和Random 6 mers Primer引物反轉(zhuǎn)錄得到ame-miR-79的內(nèi)參基因U6(GenBank登錄號:LOC725641)的cDNA模板。

參照SYBR Green試劑的說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)在ABI QuantStudio 3熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國)上進(jìn)行。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照筆者所在團(tuán)隊前期報道(郭睿等，2018,2019a)設(shè)置。

1.5 ame-miR-79的靶向預(yù)測與分析

分別采用RNAhybrid+svm_light,miRanda和TargetScan 3種軟件對ame-miR-79的靶mRNA進(jìn)行預(yù)測，取預(yù)測結(jié)果的交集作為可靠的靶mRNA集合，進(jìn)一步得到相應(yīng)的靶基因集合。利用Blast工具將上述靶基因比對到GO(https:∥www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)和KEGG(https:∥www.omicshare.com/tools/Home/Soft/pathwaygsea)數(shù)據(jù)庫以獲得相應(yīng)注釋。

1.6 靶基因表達(dá)量的RT-qPCR檢測

根據(jù)1.5節(jié)靶向預(yù)測結(jié)果選擇細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)基因和fringe糖基化轉(zhuǎn)移酶 (fringe glycosyltransferase,FG)基因進(jìn)行表達(dá)量檢測。以1.4節(jié)得到的cDNA為模板，利用CYP450和FG的特異性引物進(jìn)行qPCR檢測；以actin(GenBank登錄號:AB023025.1)作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系和程序參照筆者所在團(tuán)隊的前期報道(耿四海等,2020;祝智威等,2022)設(shè)置。每個反應(yīng)均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次平行重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計算ame-miR-79及靶基因CYP450和FG的相對表達(dá)量。通過GraphPad prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。采用Student氏t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 ame-miR-79的表達(dá)和序列驗證

Stem-loop RT-PCR產(chǎn)物的Sanger測序結(jié)果(圖1)顯示，擴(kuò)增片段的序列與前期生物信息學(xué)預(yù)測到的ame-miR-79序列(UAAAGCUAGAUUACCAAAG CA)完全一致，表明ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)真實存在。

圖1 意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79擴(kuò)增片段的Sanger測序Fig.1 Sanger sequencing of the amplified ame-miR-79 fragment in the larval gut of Apis mellifera ligustica workers

2.2 ame-miR-79的過表達(dá)和敲減效果

RT-qPCR結(jié)果顯示，相比于mimic-NC組，mimic-ame-miR-79組的4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的表達(dá)水平皆極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2:A-C)；相比于inhibitor-NC組，inhibitor-ame-miR-79組的4和5日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，而6日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P<0.001)(圖2:D-F)。

圖2 過表達(dá)和敲減ame-miR-79后其在意大利蜜蜂工蜂4日齡(A,D)，5日齡(B,E)和6日齡(C,F)幼蟲腸道內(nèi)的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of ame-miR-79 in the 4-day-old (A,D),5-day-old (B,E) and 6-day-old (C,F) larval guts of Apis mellifera ligustica workers after its overexpression and knockdown無義模擬物(mimic-NC)和無義抑制物(mimic-inhibitor)分別作為mimic-miR-79和inhibitor-miR-79的陰性對照。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)(Student氏t檢驗)。圖4和5同。Nonsense mimic (mimic-NC) and nonsense inhibitor (inhibitor-NC) were used as the negative controls of mimic-miR-79 and inhibitor-miR-79,respectively.Data in the figure are mean±SE.Asterisks above bars indicate significant difference between two groups (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)(Student’s t-test).The same for Figs.4 and 5.

2.3 ame-miR-79的靶基因預(yù)測與數(shù)據(jù)庫注釋

靶向預(yù)測結(jié)果顯示，ame-miR-79共靶向791條mRNA，對應(yīng)303個基因。GO注釋結(jié)果顯示上述靶基因涉及分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)進(jìn)程3個大類，可注釋到催化活性、大分子復(fù)合物和細(xì)胞進(jìn)程等27個GO條目(圖3:A)；KEGG注釋結(jié)果顯示上述靶基因還可注釋到氧化磷酸化、胰島素信號通路及昆蟲激素的生物合成等179條KEGG通路(圖3:B)。

圖3 意大利蜜蜂ame-miR-79的靶基因的GO(A)和KEGG(B)注釋Fig.3 GO (A) and KEGG (B) annotation of target genes of ame-miR-79 of Apis mellifera ligustica

2.4 過表達(dá)和敲減ame-miR-79后其靶基因P450和FG的相對表達(dá)量

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于mimic-NC組，CYP450在mimic-ame-miR-79組的4(P<0.0001)和5(P<0.01)日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)水平均極顯著下調(diào)，而在6日齡幼蟲腸道內(nèi)上調(diào)表達(dá)(P>0.05)(圖4:A-C)；相較于inhibitor-NC組，CYP450在inhibitor-ame-miR-79組的4日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，在6日齡幼蟲腸道內(nèi)上調(diào)表達(dá)(P>0.05)，而在5日齡幼蟲腸道內(nèi)下調(diào)表達(dá)(P>0.05)(圖4:D-F)。

圖4 過表達(dá)和敲減ame-miR-79后CYP450在意大利蜜蜂工蜂4日齡(A,D)，5日齡(B,E)和6日齡(C,F)幼蟲腸道內(nèi)的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of CYP450 in the 4-day-old (A,D),5-day-old (B,E) and 6-day-old (C,F) larval guts of Apis mellifera ligustica workers after overexpression and knockdown of ame-miR-79

相較于mimic-NC組，mimic-ame-miR-79組中5日齡幼蟲腸道內(nèi)FG的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，4日齡幼蟲腸道內(nèi)FG下調(diào)表達(dá)(P>0.05)，而在6日齡幼蟲腸道內(nèi)FG上調(diào)表達(dá)(P>0.05)(圖5:A-C)；相較于inhibitor-NC組，inhibitor-ame-miR-79組中4日齡幼蟲腸道內(nèi)FG的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，5(P<0.01)和6(P<0.001)日齡幼蟲腸道內(nèi)FG的表達(dá)水平均極顯著上調(diào)(圖5:D-F)。

圖5 過表達(dá)和敲減ame-miR-79后FG在意大利蜜蜂工蜂4日齡(A,D),5日齡(B,E)和6日齡(C,F)幼蟲腸道內(nèi)的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of FG in the 4-day-old (A,D),5-day-old (B,E) and 6-day-old (C,F) larval guts of Apis mellifera ligustica workers after overexpression and knockdown of ame-miR-79

3 討論

本研究中，我們從自然蜂群中移取意大利蜜蜂工蜂2日齡幼蟲，從3日齡到6日齡連續(xù)飼喂模擬物(或抑制物)，并檢測4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的過表達(dá)和敲減效果、2個靶基因的相對表達(dá)量，主要是出于3方面的考慮，一是意大利蜜蜂工蜂的幼蟲期為1-6日齡，1日齡幼蟲很小，人工移取易導(dǎo)致幼蟲受傷死亡且剖取腸道的難度很大，前期預(yù)實驗結(jié)果顯示人工移取2日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲放入恒溫恒濕箱飼養(yǎng)，至6日齡仍可保持較高的成活率；二是我們前期利用sRNA-seq對意大利意蜂工蜂4-6日齡幼蟲腸道進(jìn)行了測序和分析(郭睿等,2019b)，本研究中的ame-miR-79是前期研究基礎(chǔ)上篩選出來的；三是模擬物和抑制物在幼蟲腸道內(nèi)發(fā)揮作用需要一定時間，而3日齡幼蟲剛剛飼喂模擬物(或抑制物)，可能僅發(fā)揮微弱的過表達(dá)(或敲減)效果。

前期研究中，筆者所在團(tuán)隊研究證實通過飼喂模擬物和抑制物能有效實現(xiàn)對意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-13b的過表達(dá)和敲減(祝智威等,2022)。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂mimic-ame-miR-79后，意大利蜜蜂工蜂4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的表達(dá)水平皆顯著上調(diào)，而飼喂inhibitor-ame-miR-79后4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的表達(dá)水平均顯著下調(diào) (圖2)，說明幼蟲腸道內(nèi)的ame-miR-79被有效地過表達(dá)和敲減。以上結(jié)果共同表明通過飼喂模擬物和抑制物對意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)的miRNA進(jìn)行過表達(dá)和敲減是一種可行且高效的方法。

靶向預(yù)測結(jié)果顯示,ame-miR-79共靶向303個基因，涉及催化活性、大分子復(fù)合物和細(xì)胞進(jìn)程等27條GO功能條目，以及氧化磷酸化、胰島素信號通路及昆蟲激素生物合成等179條KEGG通路(圖3)，說明ame-miR-79潛在參與調(diào)節(jié)意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道生長和發(fā)育的諸多方面。細(xì)胞色素P450是一類重要的氧化代謝酶，參與昆蟲的內(nèi)源物質(zhì)代謝及外源物質(zhì)的解毒(Ohkawaetal.,1998)。研究表明細(xì)胞色素P450可通過參與蛻皮類固醇和保幼激素等的生物合成在昆蟲的發(fā)育和繁殖中起到重要作用(Whiteetal.,1980;Huberetal.,2007)，也能夠參與西方蜜蜂體內(nèi)殺蟲劑的代謝過程(Zhangetal.,2019)。本研究中，生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示ame-miR-79與CYP450之間存在潛在的負(fù)調(diào)控關(guān)系。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示過表達(dá)ame-miR-79后，意大利蜜蜂工蜂4和5日齡幼蟲腸道內(nèi)CYP450的表達(dá)量均為極顯著下調(diào)；而敲減ame-miR-79后CYP450在4日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)水平為極顯著上調(diào)，在6日齡幼蟲腸道內(nèi)上調(diào)表達(dá)(圖4)。上述結(jié)果表明在意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79負(fù)調(diào)控CYP450的表達(dá)。需要強(qiáng)調(diào)的是，過表達(dá)ame-miR-79后CYP450在6日齡幼蟲腸道內(nèi)上調(diào)表達(dá)，敲減ame-miR-79后CYP450在5日齡幼蟲腸道內(nèi)下調(diào)表達(dá)，體現(xiàn)出ame-miR-79與CYP450之間的正調(diào)控關(guān)系。推測不同日齡幼蟲腸道內(nèi)靶基因CYP450表達(dá)趨勢的不一致與幼蟲個體差異性有關(guān)，或者CYP450在個別日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)還受到其他因素(如長鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA的競爭性結(jié)合)的共同調(diào)節(jié)。

FG編碼fringe糖基轉(zhuǎn)移酶，在Notch信號通路中屬于“修飾分子”，其對Notch信號通路的糖基化修飾能改變Notch受體對不同配體的敏感性(楊曦等,2021)。Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物，在進(jìn)化上高度保守，通過細(xì)胞間的相互作用參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化及組織和器官發(fā)育(Previsetal.,2015)。FG在高爾基體中起到糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，它可以修飾Notch的表皮生長因子模塊，并改變Notch與配體Delta結(jié)合的能力(Brückneretal.,2000)。此外，F(xiàn)G也被證實與果蠅和小鼠等的發(fā)育密切相關(guān)(Wu and Rao,1999;Jineketal.,2006)。但在蜜蜂中，F(xiàn)G基因的相關(guān)研究迄今仍然缺失。本研究中，過表達(dá)ame-miR-79后FG在4日齡幼蟲腸道內(nèi)下調(diào)表達(dá)，在5日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)水平為顯著下調(diào)；敲減ame-miR-79后，F(xiàn)G基因在4日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)量為顯著上調(diào)，5和6日齡幼蟲腸道內(nèi)的表達(dá)量均為極顯著上調(diào)(圖5)。以上結(jié)果表明在意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79負(fù)調(diào)控FG的表達(dá)。推測ame-miR-79通過負(fù)調(diào)控FG表達(dá)潛在調(diào)節(jié)Notch信號通路進(jìn)而影響幼蟲腸道發(fā)育。

下一步的研究重點是通過體外轉(zhuǎn)錄得到CYP450和FG的dsRNA，再通過飼喂法對意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)的CYP450和FG進(jìn)行沉默以探究其功能，進(jìn)而結(jié)合本研究的結(jié)果進(jìn)一步闡明ame-miR-79調(diào)控腸道發(fā)育的分子機(jī)理。綜上，本研究證實意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79真實存在，通過飼喂模擬物和抑制物能分別實現(xiàn)幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-79的有效過表達(dá)和敲減，并揭示ame-miR-79負(fù)調(diào)控意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)CYP450和FG的表達(dá)。