過表達(dá)和敲減ace-miR-3720對(duì)中華蜜蜂工蜂幼蟲腸道的靶基因表達(dá)和重量的影響

蔡宗兵,王思懿,王紫馨,趙 蕭,張凱遙,郭意龍,姚雨彤,錢加珺,胡 穎,付中民,2,陳大福,2,*,郭 睿,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所,福州 350002)

中華蜜蜂Apisceranacerana是東方蜜蜂Apiscerana的指名亞種，也是一種兼具經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的本土蜂種，具有優(yōu)越的抗低溫、衛(wèi)生清理和群體防御等能力(Chenetal.,2018)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)度介于18～25 nt，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用的小非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)，已被證實(shí)在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、擬南芥Arabidopsisthaliana和黑僵菌Metarhiziumanisopliae等動(dòng)植物和微生物(Zhouetal.,2012;Gallicchioetal.,2020;Gaddametal.,2021)的細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能。

Lee等(1993)首次在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans胚胎中鑒定到miRNAlin-4，并發(fā)現(xiàn)其可負(fù)調(diào)控lin-14的表達(dá)進(jìn)而保證幼蟲的正常發(fā)育。隨后，人們?cè)诩倚QBombyxmori、水稻Oryzasativa和蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis等諸多生物體(Luetal.,2005;Zhangetal.,2009;陳華枝等,2020)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大量miRNA。相比于黑腹果蠅和按蚊Anopheles等模式昆蟲(Lampe and Levashina,2017;Klannetal.,2021)，蜜蜂的miRNA研究起步較晚。Freitas等(2017)研究發(fā)現(xiàn)miR-34-5p能靶向調(diào)控西方蜜蜂Apismellifera工蜂體節(jié)分化基因eve,ftz-f1和h以及結(jié)構(gòu)基因act5C，進(jìn)而調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)生過程。Michely等(2017)曾對(duì)西方蜜蜂工蜂體內(nèi)與神經(jīng)元可塑性相關(guān)的miR-12和miR-124進(jìn)行敲減，發(fā)現(xiàn)上述2個(gè)miRNA可參與工蜂短暫記憶和持久記憶的早期階段。Chen和Fu(2021)通過對(duì)西方蜜蜂蜂王的miR-14進(jìn)行過表達(dá)和敲減發(fā)現(xiàn)miR-14靶向調(diào)控EcR的表達(dá)并影響蜂王產(chǎn)卵數(shù)，表明miR-14在蜂王產(chǎn)卵行為中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。前人對(duì)于蜜蜂miRNA的研究主要集中在西方蜜蜂成蟲，而關(guān)于東方蜜蜂和蜜蜂幼蟲的研究很少。蜜蜂幼蟲腸道是食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、宿主-病原互作及免疫防御的主要器官，但miRNA調(diào)控幼蟲腸道發(fā)育的相關(guān)研究十分滯后，幼蟲腸道發(fā)育機(jī)理仍不清楚。前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)通過small RNA-seq和生物信息學(xué)在中華蜜蜂幼蟲腸道中鑒定到ace-miR-3720。

本研究擬通過Stem-loop RT-PCR和Sanger測(cè)序?qū)ce-miR-3720進(jìn)行表達(dá)和序列驗(yàn)證，然后預(yù)測(cè)其靶基因并分析二者間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而通過飼喂模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)對(duì)幼蟲腸道內(nèi)的ace-miR-3720分別進(jìn)行過表達(dá)和敲減，并檢測(cè)其過表達(dá)和敲減后ace-miR-3720和靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表達(dá)量以及幼蟲腸道的重量，以期明確ace-miR-3720對(duì)中華蜜蜂幼蟲腸道靶基因表達(dá)及重量的影響，揭示ace-miR-3720在腸道發(fā)育中的功能。本研究結(jié)果可豐富東方蜜蜂的miRNA信息，并為進(jìn)一步探究ace-miR-3720調(diào)控中華蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育的分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

本研究所用的中華蜜蜂工蜂幼蟲取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)蜜蜂保護(hù)課題組的實(shí)驗(yàn)蜂群。

1.2 ace-miR-3720的Stem-loop RT-PCR與Sanger測(cè)序驗(yàn)證

參照郭睿等(2019)的方法，依據(jù)ace-miR-3720的序列設(shè)計(jì)特異性的Stem-loop引物和上游引物及通用下游引物(表1)，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行合成。利用RNA抽提試劑盒(諾唯贊，南京)提取中華蜜蜂幼蟲腸道樣品的總RNA。參照cDNA第1鏈合成說明書(諾唯贊，南京)，然后使用Stem-loop引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(翊圣，上海)，反應(yīng)體系(20 μL):無菌水7 μL,PCR Mix 10 μL,cDNA模板1 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各 1 μL。PCR程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性 50 s,55℃退火30 s,72℃延伸50 s,共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。切膠回收目的片段，然后連接pMD-19T載體(TaKaRa，大連)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根，北京)，挑單菌落置于LB液體培養(yǎng)基(氨芐抗性)振蕩培養(yǎng)12 h，取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽性的菌液送至上海生工進(jìn)行Sanger測(cè)序(單端測(cè)序，M13引物)。

1.3 中華蜜蜂工蜂幼蟲飼喂及腸道樣品制備

根據(jù)ace-miR-3720的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的模擬物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,以及作為陰性對(duì)照的無義模擬物(nonsense mimic,mimic-NC)和無義抑制物(nonsense inhibitor,inhibitor-NC)(表1)，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。分別將上述模擬物和抑制物混入50 μL飼料(終濃度均為20 pmol/g) 備用。

參照筆者所在課題組前期建立的方法(熊翠玲等,2020)將中華蜜蜂蜂群巢脾上的2日齡幼蟲移至無菌的48孔培養(yǎng)板并進(jìn)行人工飼養(yǎng)。將上述含模擬物和抑制物飼料混勻后飼喂3日齡幼蟲，每12 h更換一次飼料，連續(xù)飼喂6次，飼養(yǎng)幼蟲至6日齡。在超凈臺(tái)中使用干凈的眼科剪和眼科鑷分別剖取4-6日齡幼蟲腸道，小心去除腸道上粘附的脂肪體，每3只腸道放入1個(gè)無菌的RNA-free EP管，作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)液氮冷凍后迅速轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱冷凍保存。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 ace-miR-3720的過表達(dá)和敲減效果及表達(dá)量檢測(cè)

使用RNA提取試劑盒(諾唯贊，南京)分別提取mimic-miR-3720組、mimic-NC組、inhibitor-miR-3720組和inhibitor-NC組4-6日齡幼蟲腸道樣品的總RNA，利用Stem-loop引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA。以U6 snRNA(GenBank登錄號(hào):107992425)作為內(nèi)參基因。按照SYBR Green試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)在ABI QuantStudio 3熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國(guó))進(jìn)行。反應(yīng)體系:SYBR Green Dye(諾唯贊，南京)10 μL,miR-3720-F/miR-3720-R(2 μmol/L) 各1 μL,cDNA模板1 μL,DEPC水7 μL。反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 10 s,59℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)置；每個(gè)反應(yīng)均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次平行重復(fù)。

1.5 ace-miR-3720的靶向預(yù)測(cè)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

聯(lián)用RNAhybrid、miRanda和TargetScan軟件預(yù)測(cè)ace-miR-3720的靶mRNA，各軟件均采用默認(rèn)參數(shù)。利用Blast工具將上述靶mRNA序列比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.omicshare.com/tools/Home/Soft/pathwaygsea)，從而獲得相應(yīng)的功能注釋。

1.6 ace-miR-3720的靶基因表達(dá)量的RT-qPCR檢測(cè)

根據(jù)1.5節(jié)預(yù)測(cè)到的靶基因酪蛋白激酶Ⅰ (casein kinase Ⅰ,CKⅠ)基因(GenBank登錄號(hào):108000939),絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)基因(GenBank登錄號(hào):107997332)和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(β-1,3-glucan binding protein,βGBP1)基因(GenBank登錄號(hào):107993481)的序列，使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的特異性引物(表1)。利用隨機(jī)引物和Oligo dT引物對(duì)1.4節(jié)中的總RNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA。以肌動(dòng)蛋白基因actin(GenBank登錄號(hào):107999330)作為內(nèi)參基因。采用SYBR Green法進(jìn)行RT-qPCR以檢測(cè)過表達(dá)和敲減ace-miR-3720后4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)3個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系:SYBR Green Dye(諾唯贊，南京)10 μL,靶基因上下游引物(2 μmol/L) 各1 μL,cDNA模板1 μL,DEPC水7 μL。反應(yīng)程序同1.4節(jié)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次平行重復(fù)。

1.7 過表達(dá)和敲減ace-miR-3720后中華蜜蜂幼蟲腸道重量檢測(cè)

按照1.3節(jié)的方法對(duì)中華蜜蜂幼蟲飼喂mimic-miR-3720,mimic-NC,inhibitor-miR-3720和inhibitor-NC。參照筆者課題組已建立的技術(shù)流程剖取mimic-miR-3720組、mimic-NC組、inhibitor-miR-3720組和inhibitor-NC組4-6日齡幼蟲腸道，用干凈的眼科鑷小心去除附在腸道上的脂肪體后用濾紙吸干腸道表面液體，置于干凈的稱量紙上，用分析電子天平(舜宇，上海)稱取重量。各組中每1個(gè)日齡的幼蟲均剖取和稱重3只腸道。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔΔCt法對(duì)ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。通過 Graphpad Prism 7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，采用Student氏t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 ace-miR-3720的表達(dá)和序列驗(yàn)證

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，克隆片段的序列與前期預(yù)測(cè)出的ace-miR-3720序列(TACGGTGATGAGTTT AAAC)一致，表明ace-miR-3720在中華蜜蜂幼蟲腸道中的真實(shí)存在。

2.2 ace-miR-3720的過表達(dá)和敲減效果

RT-qPCR結(jié)果顯示，相較于mimic-NC組，mimic-miR-3720組中ace-miR-3720在4和5日齡幼蟲腸道中均極顯著上調(diào)(P<0.01)，在6日齡幼蟲腸道中顯著上調(diào)(P<0.05)(圖1:A)；相較于inhibitor-NC組，inhibitor-miR-3720組中ace-miR-3720在4日齡幼蟲腸道中極顯著下調(diào)(P<0.01)，在5日齡和6日齡幼蟲腸道中均顯著下調(diào)(P<0.05)(圖1:B)。

2.3 ace-miR-3720的靶向預(yù)測(cè)與分析

靶向預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ace-miR-3720共靶向236條mRNA，對(duì)應(yīng)111個(gè)靶基因。進(jìn)一步對(duì)上述靶mRNA進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，發(fā)現(xiàn)有236條靶mRNA可注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)，54條靶mRNA可注釋到GO數(shù)據(jù)中分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)的29個(gè)功能條目；18條靶mRNA可注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中新陳代謝、細(xì)胞進(jìn)程、有機(jī)系統(tǒng)、環(huán)境信息處理和遺傳信息處理相關(guān)的19條通路。

圖1 過表達(dá)(A)和敲減(B)ace-miR-3720后中華蜜蜂工蜂4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)ace-miR-3720的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of ace-miR-3720 in the 4-6-day-old larval guts of Apis cerana cerana workers after overexpression (A) and knockdown (B) of ace-miR-3720無義模擬物(mimic-NC)和無義抑制物(mimic-inhibitor)分別作為mimic-miR-3720和inhibitor-miR-3720的陰性對(duì)照。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別表示兩組間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(t檢驗(yàn))。圖2和3同。Nonsense mimic (mimic-NC) and nonsense inhibitor (inhibitor-NC) were used as the negative controls of mimic-miR-3720 and inhibitor-miR-3720,respectively.Data in the figure are mean±SE.Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01),respectively,between two groups by t-test.The same for Figs.2 and 3.

圖2 過表達(dá)(A,C和E)和敲減(B,D和F) ace-miR-3720后中華蜜蜂工蜂4-6日齡幼蟲腸道內(nèi)3個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of three target genes in the 4-6-day-old larval guts of Apis cerana cerana workers after overexpression (A,C and E) and knockdown (B,D and F) of ace-miR-3720A,B:CKⅠ;C,D:MAPK1;E,F:βGBP1.

2.4 過表達(dá)和敲減ace-miR-3720后其靶基因的表達(dá)量變化

ace-miR-3720的“種子區(qū)”與2.3節(jié)預(yù)測(cè)的靶基因中3個(gè)靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的mRNA 3′UTR區(qū)均存在潛在靶向結(jié)合關(guān)系。對(duì)這3個(gè)靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示與mimic-NC組相比，mimic-miR-3720組的4和5日齡幼蟲腸道中CKⅠ的表達(dá)量均極顯著下調(diào)(P<0.01)，而6日齡幼蟲腸道中其表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)(圖2:A)；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-miR-3720組中4-6日齡幼蟲腸道中CKⅠ的表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2:B)。與mimic-NC相比，mimic-miR-3720組中4日齡幼蟲腸道中MAPK1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，而5和6日齡幼蟲腸道中其表達(dá)量均極顯著下調(diào)(P<0.01)(圖2:C)；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-miR-3720組中4日齡幼蟲腸道中MAPK1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，而5和6日齡幼蟲腸道中其表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2:D)。與mimic-NC組相比，βGBP1在mimic-miR-3720組4日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，而在5和6日齡幼蟲腸道中表達(dá)量均極顯著下調(diào)(P<0.01)(圖2:E)；與inhibitor-NC組相比，βGBP1在inhibitor-miR-3720組4和6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，而在5日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量極顯著上調(diào)(圖2:F)。

2.5 過表達(dá)和敲減ace-miR-3720后中華蜜蜂幼蟲腸道的重量變化

mimic-miR-3720組中4-6日齡幼蟲腸道的重量分別為0.0124±0.0001,0.0156±0.0003和0.0251±0.0010 g，而mimic-NC組4-6日齡幼蟲腸道的重量分別為0.0146±0.0005,0.0178±0.0004和0.0267±0.0003 g；mimic-miR-3720組與mimic-NC組4和5日齡幼蟲腸道重量之間的差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與6日齡幼蟲腸道重量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。inhibitor-miR-3720組中4-6日齡幼蟲腸道重量分別為0.0178±0.0010,0.0226±0.0004和0.0287±0.0007 g，而inhibitor-NC組中4-6日齡幼蟲腸道重量分別為0.0146±0.0004,0.0180±0.0011和0.0263±0.0009 g；inhibitor-miR-3720組與inhibitor-NC組之間5日齡幼蟲腸道重量差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，兩組間4和6日齡幼蟲腸道重量差異均達(dá)到顯著(P<0.05)(圖3)。

圖3 過表達(dá)和敲減ace-miR-3720后中華蜜蜂工蜂4 日齡(A)、5日齡 (B)和6日齡(C)幼蟲腸道的重量Fig.3 Weight of the 4-day-old (A),5-day-old (B) and 6-day-old (C) larval guts of Apis cerana cerana workers after overexpression and knockdown of ace-miR-3720

3 討論

此前，Chen等(2010)在不同發(fā)育階段的西方蜜蜂工蜂體內(nèi)鑒定到267個(gè)miRNA，其中ame-miR-3720與本研究鑒定到的ace-miR-3720高度同源，但二者的功能研究均未明確。本研究在前期基礎(chǔ)上通過Stem-loop RT-PCR和Sanger測(cè)序?qū)ce-miR-3720進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)ace-miR-3720在中華蜜蜂工蜂幼蟲腸道內(nèi)真實(shí)存在。這表明利用sRNA-seq能準(zhǔn)確鑒定中華蜜蜂和其他物種的miRNA。

通過飼喂法和注射法進(jìn)行成年蜜蜂的miRNA過表達(dá)和敲減此前均已見諸報(bào)道(Michelyetal.,2017)。但蜜蜂幼蟲不同于成年蜜蜂，前者較為柔軟和脆弱，筆者課題組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射產(chǎn)生的機(jī)械損傷會(huì)導(dǎo)致蜜蜂幼蟲大量死亡。鑒于此，本研究采用飼喂模擬物和抑制物的方法對(duì)中華蜜蜂幼蟲的ace-miR-3720分別進(jìn)行過表達(dá)和敲減。飼喂mimic-miR-3720后，ace-miR-3720在中華蜜蜂4-6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量均顯著上調(diào)(圖1:A)，而飼喂inhibitor-miR-3720后ace-miR-3720在4-6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量均顯著下調(diào)(圖1:B)，說明通過飼喂法可在中華蜜蜂幼蟲個(gè)體水平對(duì)腸道內(nèi)的miRNA實(shí)現(xiàn)有效的過表達(dá)和敲減，這為日后深入探究miRNA調(diào)控中華蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育的分子機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。前期研究中，筆者課題組研究發(fā)現(xiàn)通過飼喂模擬物和抑制物可分別實(shí)現(xiàn)中華蜜蜂幼蟲血淋巴中ace-miR-3759的過表達(dá)和敲減(未發(fā)表數(shù)據(jù))。以上研究結(jié)果共同表明通過飼喂模擬物和抑制物能對(duì)中華蜜蜂幼蟲不同的器官和組織中的miRNA分別進(jìn)行過表達(dá)和敲減，這為對(duì)中華蜜蜂幼蟲不同的器官和組織中miRNA的功能研究提供了基礎(chǔ)。中華蜜蜂幼蟲腸道細(xì)胞如何吸收模擬物和抑制物？模擬物和抑制物又是通過何種方式透過圍食膜和腸壁進(jìn)入血淋巴？這些都是尚未闡明且值得進(jìn)一步研究的科學(xué)問題。

miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用(Legeaietal.,2010)。為保證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，本研究聯(lián)用RNAhybrid,miRanda和TargetScan 3個(gè)軟件對(duì)ace-miR-3720進(jìn)行靶向預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到236條靶mRNA，對(duì)應(yīng)包括CKⅠ,MAPK1和βGBP1在內(nèi)的111個(gè)靶基因。CKⅠ是最早被分離的絲/蘇氨酸蛋白激酶之一，從酵母菌Saccharomycesspp.到人Homosapiens的許多真核生物中都廣泛表達(dá)且高度保守，其可通過Hedgehog(Hh),Hippo以及Wnt/β聯(lián)蛋白通路等調(diào)控機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、胚胎發(fā)育、能量代謝、晝夜節(jié)律等生命活動(dòng)(Jiang,2017)。MAPK信號(hào)通路包括p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)，是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和分化的關(guān)鍵信號(hào)分子(Tena,2019)。βGBP是一類模式識(shí)別蛋白，不僅可以與真菌表面的β-1,3-葡聚糖結(jié)合，進(jìn)而通過酚氧化酶原(PPO)激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)黑化，還可以識(shí)別結(jié)合革蘭氏陰性菌(梁虹等,2006)。本研究中，RT-qPCR結(jié)果顯示過表達(dá)ace-miR-3720后CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表達(dá)量均顯著下調(diào)，而敲減ace-miR-3720后上述3個(gè)靶基因的表達(dá)量皆顯著上調(diào)，表明ace-miR-3720與CKⅠ,MAPK1和βGBP1之間具有負(fù)調(diào)控關(guān)系(圖2)。研究表明CKⅠ影響黑腹果蠅和蜜蜂等昆蟲的的體節(jié)形成、色素沉淀和器官發(fā)育等生理過程(Barry and Camargo,2013;石元元,2014)。MAPK信號(hào)通路在二化螟Chilosuppressalis的抗真菌反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。miR-240可通過負(fù)調(diào)控MAPK信號(hào)通路參與小菜蛾P(guān)lutellaxylostella對(duì)蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis毒素的抗性(Qiuetal.,2017;Yangetal.,2021)。在東亞飛蝗Locustamigratoria的研究中，βGRPmRNA在真菌感染后顯著上調(diào)，通過RNAi沉默βGRP基因后被綠僵菌Metarhiziumacridum感染的蝗蟲的存活率明顯降低(Zhengetal.,2012)。本研究中，過表達(dá)ace-miR-3720后中華蜜蜂4-6日齡幼蟲腸道的重量均顯著降低，而敲減ace-miR-3720后中華蜜蜂4-6日齡幼蟲腸道的重量均顯著升高，說明ace-miR-3720參與調(diào)節(jié)中華蜜蜂幼蟲腸道的重量(圖3)。綜上，推測(cè)ace-miR-3720通過負(fù)調(diào)控CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表達(dá)參與中華蜜蜂幼蟲腸道的發(fā)育過程。西方蜜蜂的首個(gè)基因組早在2006年就已公布(Honeybee Genome Sequencing Consortium,2006)，而東方蜜蜂的參考基因組(Parketal.,2015)直到2015年才公布，導(dǎo)致東方蜜蜂的基因功能研究較為滯后。目前，CKⅠ,MAPK1和βGBP1的功能尚不明確。下一步的工作重點(diǎn)是通過RNAi對(duì)上述3個(gè)基因分別進(jìn)行敲減以明確其功能，并結(jié)合本研究的結(jié)果進(jìn)一步闡釋ace-miR-3720通過負(fù)調(diào)控CKⅠ,MAPK1和βGBP1介導(dǎo)中華蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育的分子機(jī)理。

綜上，ace-miR-3720在中華蜜蜂幼蟲腸道內(nèi)真實(shí)存在；通過飼喂模擬物和抑制物可分別對(duì)中華蜜蜂幼蟲腸道內(nèi)實(shí)現(xiàn)miRNA的有效過表達(dá)和敲減；ace-miR-3720可能通過調(diào)控CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表達(dá)影響中華蜜蜂幼蟲重量并參與幼蟲發(fā)育。