蒲藍(lán)利咽合劑的指紋圖譜建立及含量測(cè)定Δ

王博，于曉濤，劉玉萍，赫振玉，王瑞，3#（.漯河市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 漯河 462000；2.河南省中藥制劑與加工中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 漯河 462000；3.河南省中藥制劑現(xiàn)代化技術(shù)研發(fā)與臨床應(yīng)用工程研究中心，河南 漯河 462000）

蒲藍(lán)利咽合劑由蒲公英、黃芩、木蝴蝶、忍冬藤等6味藥材組成，由《千家妙方》記載的“復(fù)方蒲公英湯”[1]加減化裁而來(lái)，能透泄里熱壅盛之邪，具有清熱解毒、涼血利咽之效，主要用于治療上呼吸道感染引起的發(fā)熱、咽喉腫痛等癥。方中蒲公英為君藥，清熱解毒、消腫散結(jié)[2]；黃芩為臣藥，善清上焦之火，可治火毒熾盛的瘡癰腫毒、咽喉腫痛[3]；木蝴蝶、忍冬藤等為佐使藥，疏風(fēng)通絡(luò)、清肺利咽[4―5]；諸藥共奏清熱解毒、抗炎消腫之效。蒲藍(lán)利咽合劑主要含有酚酸類、黃酮類、萜類、揮發(fā)油等成分，其中綠原酸、咖啡酸、菊苣酸為君藥蒲公英中酚酸類成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[6―8]；黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷為臣藥黃芩中黃酮類成分，具有抗病毒、神經(jīng)保護(hù)等作用[9]；馬錢苷為佐藥忍冬藤中環(huán)烯醚萜類成分，具有抗氧化、抗菌及增強(qiáng)免疫功能等作用[10]；木蝴蝶苷B為使藥木蝴蝶的特征性成分，具有抗菌、抗炎等作用[11]。目前，對(duì)蒲藍(lán)利咽合劑的質(zhì)量控制僅限于薄層鑒別及相關(guān)檢查項(xiàng)，尚缺少定量控制的方法。

由于中藥成分復(fù)雜，對(duì)一種或幾種成分的定量研究不能全面反映中藥制劑的整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜所含化學(xué)成分信息量大、特征性強(qiáng)，能對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)[12]，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別能對(duì)指紋圖譜的整體性和模糊性進(jìn)行更加科學(xué)合理的評(píng)價(jià)[13]?；诖?，本研究建立了蒲藍(lán)利咽合劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析；同時(shí)采用相同的HPLC法測(cè)定該制劑中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷共8種活性成分的含量，旨在為蒲藍(lán)利咽合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20A型HPLC儀、AUW-120D型十萬(wàn)分之一天平（日本Shimadzu公司），Milli-Q型純水儀（美國(guó)Millipore公司），KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-202119，純度96.8%）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，純度99.7%）、黃芩苷（批號(hào)110715-202122，純度95.4%）、漢黃芩苷（批號(hào)112002-201702，純度98.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（批號(hào)DSTDQ-004001，純度98.49%）、馬錢苷（批號(hào)DSTDM003801，純度99.31%）、菊苣酸（批號(hào)DSTDJ003901，純度98.23%）、木蝴蝶苷B（批號(hào)DSTDM002901，純度98.39%）均購(gòu)自成都德思特生物科技有限公司；乙腈、甲酸均為色譜純，水為純化水。

11批蒲藍(lán)利咽合劑[規(guī)格為每毫升含生藥0.52 g（100 mL/瓶），編號(hào) S1～S11，批號(hào)分別為 20210621、20220214、20220216、20220218、20220221、20220223、20220225、20220228、20220302、20220304、20220307]均為漯河市中心醫(yī)院自制。

黃芩飲片（批號(hào)20201201）、忍冬藤飲片（批號(hào)20191101）、木蝴蝶飲片（批號(hào)20201001）均購(gòu)自安徽桐花堂中藥飲片科技有限公司，蒲公英飲片（批號(hào)180601）購(gòu)自亳州市萬(wàn)草堂中藥飲片有限公司，均經(jīng)漯河市中心醫(yī)院制劑室于曉濤副主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以 Shimadzu Shim-pack GIST C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～7 min，7%B；7～15 min，7%B→8%B；15～27 min，8%B→10%B；27～32 min，10%B→15%B；32～45 min，15%B；45～55 min，15%B→19%B；55～60 min，19%B→22%B；60～80 min，22%B→25%B；80～85 min，25%B→40%B；85～100 min，40%B→50%B；100～105 min，50%B→90%B）；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm（馬錢苷）、280 nm（木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷）、327 nm（綠原酸、咖啡酸、菊苣酸）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為68.400、30.000、250.625、237.600、105.600、2 204.800、289.300、408.000 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取蒲藍(lán)利咽合劑1 mL，加水稀釋至10 mL，以14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按蒲藍(lán)利咽合劑處方工藝分別制備缺黃芩或蒲公英或忍冬藤或木蝴蝶以及同時(shí)缺蒲公英和忍冬藤（因兩者均含有咖啡酸）、黃芩和木蝴蝶（因兩者均含有黃芩苷）的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各陰性樣品溶液。

2.3 蒲藍(lán)利咽合劑HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密量取編號(hào)為S11的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。以黃芩苷為參照峰，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.010%～0.234%、0.083%～2.935%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取編號(hào)為S11的樣品，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以黃芩苷為參照峰，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.025%～0.481%、0.140%～2.777%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取編號(hào)為S11的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以黃芩苷為參照峰，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.034%～0.630%、0.272%～2.865%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的生成和相似度評(píng)價(jià) 取11批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰。將所得的色譜圖采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行分析，以峰面積適中的S11樣品為對(duì)照?qǐng)D譜，選擇中位數(shù)計(jì)算，采用多點(diǎn)校正生成HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）。結(jié)果顯示，11批樣品共有20個(gè)共有峰，詳見圖1。11批樣品的相似度分別為0.988、0.990、0.991、0.985、0.991、0.989、0.973、0.981、0.989、0.994、0.993。

2.3.5 共有峰指認(rèn) 經(jīng)過與相應(yīng)對(duì)照品圖譜（圖2）比對(duì)，共指認(rèn)出8個(gè)色譜峰，分別為綠原酸（5號(hào)峰）、咖啡酸（7號(hào)峰）、馬錢苷（8號(hào)峰）、菊苣酸（9號(hào)峰）、木蝴蝶苷B（13號(hào)峰）、黃芩苷（14號(hào)峰，由于其保留時(shí)間居中，將其作為參照峰）、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（17號(hào)峰）、漢黃芩苷（18號(hào)峰）。

2.4 HPLC指紋圖譜的化學(xué)模式識(shí)別分析

2.4.1 聚類分析 將11批樣品的20個(gè)共有峰相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，采用組間聯(lián)結(jié)法，以平方歐氏距離為區(qū)間進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)，11批樣品分為2大類，其中S3、S10～S11為一類，其余為一類。結(jié)果見圖3。

2.4.2 主成分分析 以11批樣品的20個(gè)共有峰相對(duì)峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行主成分分析（表1）。結(jié)果顯示，前4個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95.546%，表明這4個(gè)主成分能夠反映指紋圖譜共有峰的主要信息。采用SIMCA14.1軟件進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式的主成分建模分析（圖4）。結(jié)果顯示，11批樣品分為2類，S3、S10～S11為一類，其余為一類，與聚類分析結(jié)果一致。

表1 4個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 以11批樣品的20個(gè)共有峰相對(duì)峰面積為變量，運(yùn)用SIMCA14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（圖5）。結(jié)果顯示，所得模型參數(shù)RX2＝0.891，RY2＝0.963，Q2＝0.899＞0.5，表明模型穩(wěn)定，預(yù)測(cè)能力良好。

以變量重要性投影（variable importance in projec‐tion，VIP）值大于1[14]為指標(biāo)篩選對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分（圖6）。結(jié)果顯示，15、14（黃芩苷）、10、18（漢黃芩苷）、11、17（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸）、4、20、16、12、7（咖啡酸）、19號(hào)峰的VIP值大于1，表明這12個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)的成分可能是影響蒲藍(lán)利咽合劑質(zhì)量的標(biāo)志物。

2.5 蒲藍(lán)利咽合劑中綠原酸等8種成分的含量測(cè)定

采用相同的HPLC法測(cè)定蒲藍(lán)利咽合劑中綠原酸等8種活性成分的含量。

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)S11）、各陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖2，陰性樣品圖略）。結(jié)果顯示，各成分分離度良好，陰性樣品無(wú)干擾。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋，得系列濃度工作溶液。取系列濃度工作溶液及混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 綠原酸等8種成分的回歸方程與線性范圍

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.60%、0.67%、0.65%、0.60%、0.47%、0.54%、0.52%、0.54%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取樣品（編號(hào)S11），共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷含量的RSD分別為0.79%、0.27%、0.22%、0.12%、0.68%、0.49%、0.08%、0.12%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S11），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為1.02%、0.69%、0.54%、0.35%、0.16%、0.32%、0.30%、0.26%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取樣品（編號(hào)S11）0.5 mL，共6份，按1∶1加入混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷的平均加樣回收率分別為100.69%、98.50%、101.86%、99.97%、104.34%、100.38%、101.84%、99.74%，RSD 分別為 1.99%、2.64%、1.42%、1.54%、2.89%、2.73%、1.53%、1.25%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 樣品含量測(cè)定 精密量取11批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見表3。

表3 綠原酸等8種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）

3 討論

本課題組前期分別考察了以甲醇-甲酸溶液、乙腈-甲酸溶液、乙腈-乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)各成分的分離效果，結(jié)果表明，以乙腈-甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)各成分的分離效果較好，故選擇其為流動(dòng)相。同時(shí)還考察了不同波長(zhǎng)下（230、254、280、330 nm）各色譜峰的吸收度，結(jié)果顯示，在254 nm波長(zhǎng)下所得色譜峰較多且分離度較好，能夠較為全面地反映樣品的化學(xué)成分信息，故選擇254 nm為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)；此外還對(duì)綠原酸等8種成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的最大吸收波長(zhǎng)為327 nm，馬錢苷為237 nm，木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷均為280 nm，因此選擇237、280、327 nm為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了11批蒲藍(lán)利咽合劑的HPLC指紋圖譜，確定了20個(gè)共有峰，與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.97，說(shuō)明各批次樣品的質(zhì)量均一穩(wěn)定、差異較小。聚類分析、主成分分析的結(jié)果均顯示，S3、S10～S11為一類，其余為一類。正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示，15、14（黃芩苷）、10、18（漢黃芩苷）、11、17（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸）、4、20、16、12、7（咖啡酸）、19號(hào)峰為影響樣品質(zhì)量的標(biāo)志物?？紤]到復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，故選擇樣品中發(fā)揮抗菌消炎作用的主要藥效成分綠原酸、菊苣酸、馬錢苷和木蝴蝶苷B[6，8，10―11]，與 VIP 值＞1 的黃芩苷、千層紙素 A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷、咖啡酸共8種成分作為蒲藍(lán)利咽合劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，11批樣品中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷的含量分別為0.287～1.021、0.163～0.485、0.735～3.641、0.587～4.012、1.920～9.063、37.443～115.974、3.623～13.942、7.135～18.736 mg/g，表明不同批次樣品含量存在差異，其中S3、S10～S11樣品中8種成分的總含量高于其他批次。其原因可能與蒲藍(lán)利咽合劑原藥材的產(chǎn)地、制劑提取濃縮工藝等多種因素有關(guān)[15―16]。

綜上所述，建立的蒲藍(lán)利咽合劑HPLC指紋圖譜和綠原酸等8種成分的含量測(cè)定方法，可用于蒲藍(lán)利咽合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)；黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸等12種成分可能是影響蒲藍(lán)利咽合劑質(zhì)量的標(biāo)志物。