食品中二氧化鈦納米材料對消化道組織及腸道微生物群影響的研究進展

王 昊，王 然，巴 乾

上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025

二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）是一種具有強力著色能力的白色、無味粉末，在自然界以銳鈦礦、板鈦礦和金紅石3 種礦物形式存在，在食品領(lǐng)域其作為色素添加劑被廣泛應(yīng)用［1-2］。在聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）編寫的一份報告中，提到了1927、1928、1950、1955 和1963 年發(fā)表的5 項研究和1962 年的一項未發(fā)表研究，及其對動物攝入TiO2后的吸收和毒性作用的評估［3］。根據(jù)這些研究結(jié)果JECFA 得出結(jié)論，由于TiO2具有不可溶性、惰性、無毒性作用等特點，無需設(shè)立TiO2的可接受日攝入量［4-5］。因此在1969 年，TiO2被歐盟批準(zhǔn)為食品添加劑并編號為E171，且未對其使用量進行限制［2］。在美國，食品藥品監(jiān)督管理局于1966 年批準(zhǔn)TiO2作為食品添加劑，并規(guī)定其用量不應(yīng)超過產(chǎn)品總重量的1%［6］。而在2021 年，歐洲食品安全局對E171 進行了重新評估，且認為TiO2作為食品添加劑是不安全的［7］。目前，市面上的食品添加劑中TiO2顆粒的尺寸范圍為1～1 000 nm，其中納米尺寸顆粒（0.1～100 nm）占有一定的比例。PROQUIN 等［8］發(fā)現(xiàn)E171 由39%的納米尺寸顆粒和61%的微米尺寸顆粒組成。CHEN 等［9］對上海市售的6種口香糖中的TiO2進行分離，并通過透射電子顯微鏡對其粒徑進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)27.7%～43.7%的TiO2顆粒尺寸在100 nm 以下。同時，一項針對2010—2012 年間荷蘭人群的TiO2日攝入量的研究［10］發(fā)現(xiàn)，7 歲以上人群的攝入范圍為0.06～0.17 mg/kg，2～6歲兒童則達到0.67 mg/kg。另外，在15 名死者的尸檢中也發(fā)現(xiàn)，其肝、脾、腎、空腸和回腸樣本中的總Ti 含量范圍在0.01～2.0 mg/kg 之間，其中顆粒狀TiO2占總Ti 質(zhì)量的80%［11］。因此，這種長期的TiO2膳食暴露以及膳食TiO2中含有的TiO2納米顆粒（TiO2nanoparticles，TiO2NPs）對人體可能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)及毒性作用逐漸引起了我們的關(guān)注。

已有較多研究［12-13］發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群對調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境、控制腸道炎癥反應(yīng)發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而TiO2NPs經(jīng)口攝入會直接影響消化道組織以及腸道微生物群的豐度和代謝水平并破壞腸道微環(huán)境的平衡。本文對TiO2NPs被攝入后對消化道內(nèi)細胞組織及微生物群的影響以及該顆粒在腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的促炎作用進行綜述，以期為進一步完善TiO2納米材料在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的安全性研究提供參考。

1 TiO2 NPs對消化道的影響

1.1 TiO2 NPs對口腔的影響

TiO2NPs經(jīng)口腔攝入體內(nèi)時，首先會與口腔黏膜直接接觸。TEUBL 等［14］使用NM100（金紅石，普通尺寸）、NM105（金紅石，22 nm）、NM101（金紅石，7 nm）TiO2NPs處理豬頰黏膜模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏膜細胞活力和黏膜完整性均未受到影響，其中NM100 和NM105 穿透了頰黏膜上部和下部，而NM101 僅能穿透頰黏膜上部，且NM105 可導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，TEUBL等［15］又研究了親水性（NM103，金紅石，20 nm）和疏水性（NM104，金紅石，20 nm）TiO2NPs對相同體外模型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疏水性顆粒存在于囊泡結(jié)構(gòu)中，親水性顆粒則自由分布在細胞質(zhì)中，其中親水性顆粒比疏水性顆粒具有更強的引發(fā)毒性作用的潛力（如導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生）。

研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 與唾液接觸過程中能夠?qū)Ζ?淀粉酶的活性產(chǎn)生抑制作用，同時唾液中的黏蛋白會迅速吸附在TiO2NPs表面，改變顆粒間的膠體相互作用，從而降低顆粒聚集及形成團聚體的趨勢。這種變化會影響TiO2NPs 進入胃腸道的理化性質(zhì)，進而影響其穿透胃腸道的黏液層、被上皮細胞吸收和與腸道微生物相互作用的能力［16］。

1.2 TiO2 NPs對胃腸道的影響

1.2.1 TiO2NPs影響胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收 小腸是食物消化和吸收的主要場所，其中小腸固有層和上皮共同凸向腸腔所形成的葉狀結(jié)構(gòu)為小腸絨毛，其主要目的是增大腸道的表面積，利于小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。微絨毛是絨毛上的刷狀緣結(jié)構(gòu)，為細胞質(zhì)的突起。當(dāng)TiO2NPs進入小腸時，會通過破壞腸上皮細胞的絨毛和微絨毛，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。相關(guān)動物實驗中，DUDEFOI 等［18］使用TiO2NPs 對小鼠進行灌胃，電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞排列不規(guī)則且小腸絨毛變長；KWON 等［19］使用TiO2NPs 處理大型蚤后，觀察到其腸上皮細胞的突起和胞質(zhì)內(nèi)含物的擴張，且微絨毛形狀變得不規(guī)則。在模擬小腸環(huán)境的體外模型實驗［12，20-22］中發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 沉積可減少腸上皮細胞的微絨毛數(shù)量，并破壞微絨毛的正常組織形態(tài)。而該種破壞會直接影響金屬元素（如鐵、鋅）［20］、脂質(zhì)［20］、葡萄糖［22］和氨基酸［23］的轉(zhuǎn)運和吸收；同時，GUO等［20］還發(fā)現(xiàn)TiO2NPs暴露可使腸上皮細胞的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的表達發(fā)生變化，這提示TiO2NPs 影響了細胞的轉(zhuǎn)運機制。鑒于TiO2自身的化學(xué)惰性，人們常認為微絨毛的破壞與TiO2NPs的物理沉降有關(guān)；但FAUST等［21］通過創(chuàng)造出微重力條件，消除了TiO2NPs物理沉降的因素，分析其對細胞微絨毛的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TiO2NPs仍然能通過生物學(xué)效應(yīng)對微絨毛造成破壞。

除了通過破壞小腸絨毛和微絨毛來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收外，TiO2NPs還可以通過其他途徑影響脂質(zhì)的消化及吸收［24-25］。LI 等［25］發(fā)現(xiàn)脂肪酶會吸附在TiO2NPs表面，從而減少水解脂質(zhì)的脂肪酶含量；同時，該顆粒還會吸附在脂滴表面，從而減少脂滴暴露于脂肪酶的表面積。但目前，尚未有研究報道TiO2NPs的粒徑大小與脂質(zhì)消化、吸收有直接關(guān)聯(lián)。

1.2.2 TiO2NPs促進胃腸道炎癥的發(fā)生與發(fā)展 TiO2NPs可通過多個方面促進胃腸道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。一方面，TiO2NPs的暴露會引起腸道形態(tài)的變化，主要表現(xiàn)為病理性炎癥浸潤損傷［26-27］和線粒體異常［27］。PINGET 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠攝入TiO2NPs 會上調(diào)其腸上皮細胞的黏蛋白基因表達水平。LIMAGE等［29］發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 暴露會增加體外胃腸道模型（由Caco-2/HT29-MTX-E12 細胞模擬）的黏液層厚度及黏液分泌量，從而使其酸性和中性黏蛋白的分泌增加，并使二者的比例發(fā)生變化；且另有報道［30-31］證實，胃腸道的炎癥和癌癥的發(fā)生往往與酸性、中性黏蛋白的分布及比例的改變相關(guān)。值得關(guān)注的是，在動物實驗［32］中研究者卻發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 的攝入會顯著降低小鼠小腸黏液的厚度，并下調(diào)腸道中重組黏蛋白2（recombinant mucin 2，MUC2） 的 表 達 水 平，而MUC2是腸杯狀細胞分泌的腸黏液中的重要成分，對維持腸黏膜保護屏障起到了重要的作用［33］。因此，TiO2NPs對消化道及相關(guān)細胞的分泌和代謝的影響還有待后續(xù)研究加以探索。另一方面，消化道及相關(guān)細胞暴露于TiO2NPs的環(huán)境中會導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子的增加。研究顯示，TiO2NPs的暴露會上調(diào)THP-1巨噬細胞中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達和Caco-2 細胞中的IL-8 的表達［34］，還可上調(diào)結(jié)腸中的IL-1α、IL-6、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α， TNF-α） 和IL-17A 等 炎 癥 因 子 的 表達［32，35］。同 時，多 項 研 究 發(fā) 現(xiàn)，TiO2NPs 會 導(dǎo) 致ROS 的積累［34，36-37］及超氧化物的生成［37］，進而引起腸道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。

另外，TiO2NPs的暴露還會影響細胞活力及其代謝水平。研究顯示，TiO2NPs暴露可下調(diào)Caco-2細胞中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶的表達，使細胞內(nèi)DNA 發(fā)生氧化損傷［36］，且細胞活力呈劑量依賴性下降［34］。同樣地，體內(nèi)實驗［38］發(fā)現(xiàn)，向大鼠腹腔注射TiO2NPs可顯著降低其腎臟、肝臟和脾臟中的谷胱甘肽水平和抗氧化酶活性。CHEN等［27］對小鼠的糞便進行代謝組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TiO2NPs 暴露后增加的代謝物以N-乙酰組胺、己內(nèi)酰胺和甘油磷膽堿為主，而減少的代謝物以4-甲基-5-噻唑乙醇、L-組氨酸和L-鳥氨酸為主。MU 等［39］研究還發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs的長期暴露會顯著減少腸系膜淋巴結(jié)中CD4+T 細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞和巨噬細胞的數(shù)量。綜上所述，膳食中攝入TiO2NPs會影響胃腸道細胞的生理功能和代謝水平，干擾體內(nèi)免疫系統(tǒng)的平衡并導(dǎo)致胃腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

2 TiO2 NPs對腸道微生物群影響

2.1 TiO2 NPs對腸道微生物群多樣性的影響

許多研究證實TiO2NPs對于微生物群整體多樣性的 影 響 較 為 有 限［17，39-40］，但CHEN 等［41］通 過16S rDNA 測序分析發(fā)現(xiàn)大鼠亞慢性暴露于TiO2NPs 的膳食環(huán)境中可導(dǎo)致其腸道微生物群多樣性呈劑量依賴性增加。KOLBA 等［42］發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 暴露可導(dǎo)致雞的盲腸質(zhì)量/體質(zhì)量比顯著增加，而盲腸質(zhì)量的增加提示細菌總量有所增加［43］。目前，TiO2對微生物群的研究主要為體外實驗和動物實驗，且多以中短期的暴露為主。因此長期攝入TiO2NPs對于人體腸道微生物群多樣性的影響尚不清楚，仍需開展進一步的研究。

2.2 TiO2 NPs對腸道微生物群豐度的影響

與人體細胞不同，腸道微生物菌群雖能阻隔納米材料的細胞壁，但缺乏特定的主動攝取機制（如哺乳動物細胞具有的內(nèi)吞作用）。因此，TiO2NPs 影響腸道微生物菌落的機制與人體細胞主動攝取TiO2NPs的機制間存在較大差異。目前，納米材料的抗微生物作用主要歸因于該材料解離出的離子，由于不同微生物群對離子的敏感性存在差異，使得納米材料對微生物群的影響有較大的種屬差異性，進而其也會給微生物群的豐度帶來一定影響［12，44］。

研究［45］表明，納米材料的抗菌和促炎作用可能會促進原本低豐度的機會細菌的“繁殖”。體內(nèi)、體外實驗均發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs暴露后腸道微生物群的豐度會發(fā)生顯著變化， 如厚壁菌門 （Phylum Firmicutes）［46-47］、蛋白菌門（Proteobacteria）［17］、紅球 菌 屬（Rhodococcus）［17］、 梭 狀 芽 孢 桿 菌 屬（Clostridium）［40，47］等細菌的豐度增加，普氏菌屬（Prevotella）［17］、韋榮氏球菌屬（Veillonella）［27］、擬桿 菌 屬 （Bacteroides）［32，40，46］、 羅 氏 菌 屬（Rothia）［41］、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）［39，42，46］、乳桿菌屬（Lactobacillus）［26，40，43，48-50］等細菌的豐度降低；其中，TiO2NPs對雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的生長和活力的影響值得關(guān)注。KHAN 等［49］使用益生菌制劑分離得到凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis），并從巧克力中分離得到平均粒徑約為40 nm 的TiO2NPs，共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)125 μg/mL 的TiO2NPs可有效抑制益生菌的生長和活力；繼而推測，僅20 g 測試巧克力中的TiO2NPs 含量足可以影響2～8 歲兒童的腸道微生物群。ZHAO 等［26］觀察連續(xù)14 d 攝入TiO2NPs 的小鼠并采集其糞便，通過糞便菌群移植實驗發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs可使小鼠腸道微生物群失調(diào)，并可激活腸道組織中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、誘發(fā)結(jié)腸炎癥；隨后，使小鼠口服鼠李糖乳桿菌補充劑后發(fā)現(xiàn)，口服補充劑可有效抑制原本被激活的NF-κB信號通路，并減輕TiO2NPs引起的結(jié)腸炎癥損傷。

2.3 TiO2 NPs對微生物代謝的影響和促炎作用

TiO2NPs引起的腸道炎癥反應(yīng)包括對腸道中各類細胞的直接促炎作用，以及影響腸道微生物代謝所致的間接促炎作用。PINGET 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs的攝入可影響體內(nèi)細菌代謝產(chǎn)物的生成，促進體外共生細菌的生物膜形成。同時，亦有大量研究發(fā)現(xiàn)攝入TiO2NPs會導(dǎo)致腸道微生物代謝紊亂，顯著增加脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的分泌，而后者則是膳食攝入TiO2NPs引起腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要媒介之一［27，32，41］。目前，已有研究［50］發(fā)現(xiàn)，LPS 主要通過刺激Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達來誘導(dǎo)促炎細胞因子的釋放，進而引起機體的免疫反應(yīng)。YAN 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs的攝入會導(dǎo)致小鼠腸內(nèi)容物中LPS水平顯著升高，同時伴隨腸PKC （protein kinase C，蛋白激酶C）/TLR4/NF-κB 信號通路的激活；因此推測，TiO2NPs導(dǎo)致的腸道炎癥反應(yīng)可能是由大量的LPS 觸發(fā)TLR4信號通路，繼而激活NF-κB 信號通路并產(chǎn)生大量的炎癥因子所致。

3 總結(jié)與展望

考慮到膳食中人們長期攝入TiO2的客觀事實，學(xué)者們針對TiO2的研究也長期集中在對該材料的急性毒性、慢性毒性等毒理學(xué)方面，而TiO2的不可溶性和惰性使其被認為是無毒性的。但多數(shù)體外實驗和動物實驗均發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs能從多個方面影響消化道組織和腸道微生物群。本文簡要綜述了TiO2NPs對消化道組織和腸道微生物群造成的影響，以及其在腸道炎癥發(fā)生與發(fā)展中的促炎作用。目前，在食品安全領(lǐng)域仍缺少對TiO2NPs的安全性風(fēng)險分析及相應(yīng)的控制手段，同時亦缺乏中長期TiO2NPs膳食暴露的人群試驗數(shù)據(jù)。因此，隨著人們健康意識的覺醒和科研技術(shù)的發(fā)展，中長期TiO2NPs膳食暴露的潛在危害將會得到更多的關(guān)注，而有關(guān)TiO2NPs對人體各方面的生物學(xué)作用機制亦會得到進一步的探索。