結(jié)核分枝桿菌分泌性抗原在結(jié)核診斷中的研究進(jìn)展*

段紹琪 孫 杰 劉鳳君

1 川北醫(yī)學(xué)院國際教育交流學(xué)院，四川省南充市 637000； 2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科

結(jié)核病，是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所引起的一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，是目前已知傳染病中最致命的傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《2020年全球結(jié)核病報(bào)告》，2019年全球約有1 000萬人患結(jié)核病，特別是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家未能實(shí)現(xiàn)“終止結(jié)核病策略”既定目標(biāo)[1]，尋找高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的診斷方法是控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵。目前已知的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)和病理診斷受結(jié)核分枝桿菌本身特性及卡介苗廣泛接種的影響，靈敏度和特異性較低，尚不能達(dá)到理想的診斷率。1998年結(jié)核分枝桿菌基因序列公布，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的檢測(cè)方法越來越受到國內(nèi)外研究者的重視，張敦熔在2000年《現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)》也指出：如果我們掌握了結(jié)核分枝桿菌主要蛋白質(zhì)的氨基酸序列,就可以合成一系列多肽，用單克隆抗體作為探針鑒定的具有免疫優(yōu)勢(shì)的抗原決定簇, 其診斷的敏感性、特異性分別高達(dá)90%、100%[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前已報(bào)道的結(jié)核分泌抗原多達(dá)800多種，但其中只有13種被確定為主要結(jié)構(gòu)[3]。因此，選擇特異性和敏感性均高的抗原是重中之重。本文就已報(bào)道的具有重要診斷意義的結(jié)核分枝桿菌分泌性抗原在結(jié)核檢測(cè)方法中的應(yīng)用研究進(jìn)展情況加以概括。

1 結(jié)核分枝桿菌菌屬抗原

1.1 Ag85復(fù)合體 Ag85復(fù)合體又稱為MPT54，屬于胞外蛋白，是存在于結(jié)核桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期濾液中的主要組成成分，是分枝桿菌共有抗原，由Ag85-A、Ag85-B、Ag85-C3種相對(duì)分子質(zhì)量相近，且抗原性有交叉的蛋白質(zhì)組成的異三聚體復(fù)合物[4]。其中，Ag85-A和Ag85-B具有較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫活性，由于其具有多種T細(xì)胞的抗原決定因子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)和保護(hù)性免疫應(yīng)答。Ag85復(fù)合體參與MTB細(xì)胞壁脂質(zhì)的生物合成、補(bǔ)體介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌吞噬作用以及結(jié)核分枝桿菌侵襲力的組成[5]，Ag85復(fù)合體屬于纖連結(jié)合蛋白，其受體是人類細(xì)胞表面纖連蛋白，在結(jié)核病的急性感染期產(chǎn)生重要作用[6]。

姬祥等[7]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人血清中，以Ag85A+Ag85B或Ag85C血清IgG抗體陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用ELISA法檢測(cè)血清結(jié)核分枝桿菌IgG抗體敏感性和特異性分別為60.4%和86.1%，提示Ag85復(fù)合體對(duì)結(jié)核病血清學(xué)診斷具有一定的臨床意義。Ernst JD等[8]采用ELISA法研究發(fā)現(xiàn)Ag85B在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體不同的菌株和譜系分泌具有顯著差異，在結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠的肺細(xì)胞勻漿中可以找到大量的Ag85B，這些差異可能影響T細(xì)胞反應(yīng)的頻率和幅度，提示Ag85B不僅可以鑒別活動(dòng)性結(jié)核病、既往感染、卡介苗接種人群，還可能參與調(diào)節(jié)細(xì)菌環(huán)境以促進(jìn)新宿主細(xì)胞的感染。滿昌軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)Ag85復(fù)合體免疫組化染色(IHC)對(duì)腎結(jié)核的敏感度為100%，特異性為69.38%，提示Ag85復(fù)合體可以作為診斷腎結(jié)核的補(bǔ)充檢查。車南穎等[10-11]通過免疫組化法檢測(cè)石蠟包埋組織標(biāo)本中Ag85B的表達(dá)，并與Ziehl-Neelsen染色進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Ag85B的表達(dá)位點(diǎn)和表達(dá)強(qiáng)度與抗酸桿菌的分布位點(diǎn)和數(shù)量一致，且Ag85B免疫組化產(chǎn)生的信號(hào)及免疫組化的敏感性明顯強(qiáng)于Ziehl-Neelsen染色，提示Ag85B免疫組化在結(jié)核的病理診斷中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。而且，免疫組化還具有不需使用油鏡觀察結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，大大提高了病理醫(yī)生的診斷速度，是一種簡(jiǎn)便、靈敏的結(jié)核病理診斷方法。

1.2 16Ku蛋白 16Ku蛋白屬于膜蛋白，是hsp X基因編碼的早期分泌蛋白，它是一種小分子熱休克蛋白，可耐高溫，是結(jié)核分枝桿菌處于靜息期時(shí)分泌的主要膜蛋白。在高溫環(huán)境中，轉(zhuǎn)錄因子Rv3133v/dosR通過與16Ku蛋白的核心功能區(qū)crystallin結(jié)合發(fā)揮其抑制熱凝集功能。16Ku蛋白不僅能激活B細(xì)胞，還能誘導(dǎo)T細(xì)胞引導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，其獨(dú)特之處在于它具有不依賴ATP分子伴侶的活性，這對(duì)結(jié)核桿菌的穩(wěn)定性和存活起著重要的作用。

在85%肺結(jié)核病人的血清中都可以檢測(cè)到16Ku蛋白。Raja A等[12]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用ELISA法檢測(cè)聯(lián)合檢測(cè)結(jié)核病患者血清中IgA和IgG的16Ku，敏感度可達(dá)到82%，特異性可達(dá)到97%,提示16Ku蛋白在結(jié)核病的血清學(xué)診斷中具有臨床應(yīng)用價(jià)值。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于結(jié)核病患者檢測(cè)16Ku和PPD抗體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在卡介苗陽性患者中，16Ku的特異性較高，提示16Ku可區(qū)分結(jié)核患者和卡介苗接種者。

1.3 38Ku蛋白 38Ku蛋白(pab)屬于膜蛋白，是由Pst S基因編碼的一種早期分泌蛋白，占比為10%，為一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，僅在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)和部分卡介苗中。38Ku蛋白含有T和B淋巴細(xì)胞的抗原決定因子，其中有2種特異的B細(xì)胞原決定簇，對(duì)應(yīng)于單克隆抗體TB71和TB72[13]，可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，抗原性較強(qiáng)，能誘導(dǎo)早期反應(yīng)。

38Ku血清學(xué)活性較強(qiáng)，與其他抗體相比，痰涂陽性的結(jié)核病患者，抗38Ku陽性率最高，但總結(jié)目前已報(bào)道的研究結(jié)果，其敏感度為16%～89%，特異性為93%～100%，結(jié)果不全一致，在痰涂陰性結(jié)核病患者種敏感度仍有明顯局限，提示抗38Ku蛋白仍需與其他敏感度較高的抗體聯(lián)合檢測(cè)以提高診斷率。Ihama Y等[14]對(duì)采用福爾馬林固定石蠟包埋的腸道結(jié)核組織樣本使用38-kDa抗原的單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示除了經(jīng)典的檢查方法外，結(jié)核分枝桿菌單克隆抗體免疫組化染色可能是一種有效和簡(jiǎn)單的診斷工具。

2 卡介苗缺失抗原

2.1 MPT64蛋白 MPT64蛋白(MPB64)屬于胞內(nèi)蛋白，是結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液(ST-CF)的主要組成成分，是一種分泌蛋白，占8%，是最早被發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌特異抗原，只存在于MTBC中，卡介苗菌株在傳代過程中丟失了編碼該蛋白的MPT基因。在人類特異性T細(xì)胞應(yīng)答中，MPT64蛋白是最重要的結(jié)核分枝桿菌抗原之一，T細(xì)胞決定簇分布在整個(gè)蛋白分子序列中，包含CD4+和CD8+細(xì)胞表位[15]。MPT64對(duì)宿主細(xì)胞具有抗凋亡的功能。

在結(jié)核病或PPD陽性患者中，天然和重組MPT64均能誘導(dǎo)其產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)和DTH，而卡介苗接種者或環(huán)境分枝感染患者對(duì)MPT64皮膚試驗(yàn)無應(yīng)答。丁志鑫[16]發(fā)現(xiàn)，采用ELISA法檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液樣本中IgG抗體的敏感性為26.3%，特異性為95.6%；MPT64-Rv1958c融合蛋白的敏感性和特異性分別為54.9%和91.2%，提示MPT64作為單一抗原診斷結(jié)核病的敏感性低于其與Rv1958c結(jié)合的融合蛋白。楊瑜等[17]發(fā)現(xiàn)利用膠體金免疫層析法(GICA)檢測(cè)MPT64可在7d時(shí)準(zhǔn)確、快速地鑒定結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況。Purohit MR等[18]通過免疫組化法檢測(cè)采用福爾馬林固定的腹部結(jié)核和淋巴結(jié)結(jié)核標(biāo)本中MPT64的表達(dá)，其總體敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為92%、97%、98%和85%，表明MPT64免疫組化技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染建立早期和特異性診斷是一種簡(jiǎn)單、敏感的技術(shù)。

2.2 ESAT-6 ESAT-6蛋白屬于胞內(nèi)蛋白，是從ST-CF中分離出的另一種早期分泌蛋白，由卡介苗缺失的基因片段R1區(qū)的Rv3875基因編碼[19]，Harboe等研究證實(shí)ESAT-6蛋白僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，而不存在于卡介苗等非致病性結(jié)核分枝桿菌中。因此，ESAT-6是鑒別致病性結(jié)核分枝桿菌、非致病性結(jié)核分枝桿菌和卡介苗的最佳抗原之一。ESAT-6是一種重要的T細(xì)胞抗原，能在感染的早期識(shí)別有免疫活性的T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主特異性 CD4+T細(xì)胞、CD8+CTL增殖及γ干擾素的大量產(chǎn)生，具有免疫保護(hù)作用。ESAT-6與結(jié)核分枝桿菌的溶細(xì)胞活性相關(guān)，是抗結(jié)核分枝桿菌記憶免疫應(yīng)答的主要配體，具有免疫記憶作用。ESAT-6亦具有B淋巴細(xì)胞的抗原決定簇，能刺激特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生，但由于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜上沒有ESAT-6信號(hào)肽序列，其分泌到胞外的機(jī)制暫不明確，結(jié)核病患者血清中ESAT-6含量較低。

目前臨床上廣泛應(yīng)用的IGRA檢測(cè)就是利用結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的ESAT-6和CFP10可刺激結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)大量分泌γ干擾素的特性，在采集血樣后12～18h檢測(cè)γ干擾素含量，相對(duì)于結(jié)核皮膚試驗(yàn)，IGRA具有較高的敏感性和特異性，且不受卡介苗接種和大多數(shù)非致病分支感覺的影響。朱雅娟等[20]觀察結(jié)核性腦膜炎(TBM)患者腦脊液中ESAT-6的動(dòng)態(tài)變化及其診斷意義，結(jié)果表明，不管是治療前還是治療1、2、4周后，TBM患者腦脊液中ESAT-6均高于非TBM患者，且腦脊液中ESAT-6水平隨病情改善而逐漸下降，提示早期檢測(cè)疑似TBM患者腦脊液中的ESAT-6具有一定的診斷意義，且動(dòng)態(tài)檢測(cè)TBM患者腦脊液中的ESAT-6可評(píng)估患者病情變化。孫立[21]通過檢測(cè)腎結(jié)核患者腎組織中ESAT-6表達(dá)，探討ESAT-6在腎結(jié)核早期診斷中的意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎結(jié)核患者腎組織中ESAT-6表達(dá)增強(qiáng)，ESAT-6免疫組化染色的敏感性和特異性分別為100%和83%，與Ag85相似但高于Ag85。Ag85為75%，提示抗ESAT-6抗體免疫組化可作為腎結(jié)核早期診斷的輔助試驗(yàn)，特異性高于抗Ag85抗體。

2.3 CFP10 CFP10由缺失卡介苗基因片段R1區(qū)的Rv3874基因編碼[19]，是另一種從ST-CF中分離出來的早期分泌蛋白,僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，不存在于卡介菌等非致病性結(jié)核分枝桿菌。編碼CFP10的基因位于編碼ESAT-6的基因的上游，兩個(gè)基因序列同源性為25%的，且兩個(gè)基因是共同轉(zhuǎn)錄，有研究發(fā)現(xiàn)CFP10和ESAT-6形成1∶1的緊密復(fù)合物來發(fā)揮作用[22]。CFP10是重要的T淋巴細(xì)胞靶抗原，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T淋巴細(xì)胞增殖活化，亦能刺激PBMC產(chǎn)生大量γ干擾素。同ESAT-6類似，CFP10具有免疫保護(hù)和免疫記憶功能。

有研究指出，CFP10還具有特異性的穿孔素，可作為一種基于細(xì)胞免疫的兒童結(jié)核病患者的新診斷標(biāo)志，并有可能區(qū)分ATB和LTBI[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，CFP10抗原單獨(dú)檢測(cè)結(jié)核患者血清中相應(yīng)抗體的敏感性并不理想。以ESAT-6和CFP10融合抗原為特異性抗原的新型皮膚測(cè)試(EC)在1.0μg/0.1ml的劑量下具有較高的特異性和敏感性，與T-SPOT.TB相當(dāng)，且EC皮膚測(cè)試不受卡介苗接種影響[24],其安全性能可，在測(cè)試觀察過程中沒有出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)事件。以ESAT-6和CFP10融合作為特異性抗原對(duì)外周單克隆細(xì)胞具有良好的活化能力，不但能產(chǎn)生大量γ干擾素，其主要優(yōu)勢(shì)在于不受接種卡介苗的影響，避免假陽性。

綜上所述，種類繁多的結(jié)核分枝桿菌分泌特異性抗原在結(jié)核診斷中的應(yīng)用尚未確定，但可以肯定的是，結(jié)核分枝桿菌分泌特異性抗原可以作為檢測(cè)和區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏性感染的重要手段。目前以血液、肺泡灌洗液為標(biāo)本關(guān)于結(jié)核分枝桿菌分泌特異性抗原檢測(cè)的研究已較多，而以結(jié)核病灶組織為標(biāo)本進(jìn)行相對(duì)較少，且僅以單一抗原為檢測(cè)對(duì)象，效果不夠理想。因此，以結(jié)核病灶組織為標(biāo)本，檢測(cè)相關(guān)抗原蛋白的融合表達(dá)或多種抗原的聯(lián)合應(yīng)用是未來結(jié)核病診斷的發(fā)展方向。