基于tau蛋白的阿爾茨海默病藥物研發(fā)方法概述

仲蘇月，譚秋龍，姚炫豹，楊佳穎，肖時鋒

(深圳大學生命與海洋科學學院,廣東 深圳 518060)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進行性認知損傷為主要臨床表現的神經退行性疾病，發(fā)病比例隨著年齡的增長而增加。2018年全球AD患者大約有4 800萬人，隨著全球老齡化程度加重，患病人數將會不斷增加。AD患者的記憶力減退、主觀認知能力下降，導致其正常生活受到嚴重困擾。AD已成為一種常見的老年人死亡病因[1]。90%以上AD為散發(fā)性病例，其發(fā)病機制復雜多變，以β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)級聯假說和tau蛋白假說為主。近年來，以Aβ或淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)剪切酶為靶點的藥物在臨床試驗中效果均不理想，促使更多研究者將目光轉向tau蛋白在AD發(fā)病中的作用和分子機制[2]。與Aβ相比，tau蛋白的聚集水平與認知功能障礙之間具有更為密切的正相關性[3]。目前，進入臨床研究的tau病理靶向藥物大多通過免疫療法促進tau蛋白清除。AADvac1是第一個進入臨床的tau蛋白疫苗，2021年6月，AADvac1在Ⅱ期臨床試驗中達到主要終點和關鍵次要終點[4]。由AC Immune公司開發(fā)的抗p-tau疫苗ACI-35.030目前正在Ⅱ期臨床試驗中。除了免疫療法之外，LMTM是一種基于抑制tau蛋白聚集開發(fā)的藥物，目前Ⅲ期臨床試驗正在進行[5]。本綜述總結了基于tau蛋白的藥物研究所常用的方法和模型，以供科研工作者參考。

1 Tau蛋白

Tau蛋白是一種在神經系統(tǒng)廣泛表達的微管結合蛋白，其編碼基因位于人類17號染色體上，經選擇性剪接后，在人腦內可以產生6種異構體。生理狀態(tài)下，tau蛋白與微管結合，協(xié)助微管組裝并穩(wěn)定微管，對神經元細胞骨架的維持、細胞內物質運輸及信號轉導具有重要作用[6]。病理狀態(tài)下，tau蛋白在胞內異常聚集形成雙螺旋絲，并進一步折疊形成神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)。1986年，Grundke-lqbal等[7-8]發(fā)現AD患者NFTs中的主要成分是tau蛋白，并于同年發(fā)現AD患者腦中的tau蛋白呈現高度磷酸化狀態(tài)。目前對tau聚集較為合理的解釋是，tau蛋白上的異常翻譯后修飾(主要是過度磷酸化)導致其與微管的結合能力減弱，tau從微管上脫落，從而聚集形成寡聚體，并進一步形成原纖維絲，最終形成NFTs。此過程中產生的tau蛋白寡聚體被認為是最具神經毒性的形式，并且其能夠在神經元之間或腦區(qū)之間傳播，誘導神經元內正常的tau蛋白病變[9]。因此抑制tau蛋白過度磷酸化、阻斷tau蛋白聚集、穩(wěn)定微管、清除tau寡聚體等成為針對tau病理靶向藥物研發(fā)的主要策略[10]。

2 常用研究模型及評價方法

2.1 體外分子水平研究方法 體外分子研究主要利用肝素、磷脂酰等試劑，在體外將人工合成的tau蛋白(全長型、突變型、截短型等)誘導形成寡聚體或纖維，其主要優(yōu)勢是可以快速、高通量地篩選有可能抑制tau蛋白聚集或過度磷酸化的小分子或化合物。Tau蛋白的聚集與其蛋白序列中兩段易于聚集的六肽片段具有高度相關性，分別是位于微管結合區(qū)第二和第三重復序列的275VQIINK280(PHF6*)和306VQIVYK311(PHF6)[11]。PHF6在高度有序的反平行β片層結構中形成立體拉鏈，有很強的自聚集傾向，在體外形成類似全長tau的纖維絲。因此PHF6片段作為一種體外模型被廣泛地用于高通量篩選tau蛋白聚集抑制劑的候選藥物[12-14]。除了全長tau蛋白和這兩種六肽段，含PHF6*的第二重復序列(R2)、含PHF6的第三重復序列(R3)、包含4個重復序列的K18片段以及由第一、三、四重復序列組成的K19片段也是體外研究的常用模型[15-16]。上述tau蛋白的截短片段在一定條件下確實可以幫助研究者更快地進行相關藥物研究，但是利用截短片段得到的結果未必能真實地反映人體內存在的tau蛋白聚集特性。而且以不同類型的截短片段進行實驗可能得到相反的實驗結果，2008年發(fā)表在Science期刊的一項關于tau蛋白與馬達蛋白研究中，較短的tau23與較長的tau40表現出了截然相反的結果[17]。

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Tau蛋白的微管結合域富含帶正電荷的賴氨酸殘基，在生理條件下具有高溶解度。故而在體外實驗中通常采用陰離子輔助劑誘導其聚集。用于誘導tau蛋白體外聚集的誘導劑主要可以分為聚陰離子(如肝素)和脂肪酸(如花生四烯酸)兩大類。1996年，Goedert等[18]發(fā)現未過度磷酸化的tau蛋白在體外與硫酸化的糖胺聚糖一起孵育時，會形成成對的螺旋狀細絲。1997年，Wilson等[19]發(fā)現游離脂肪酸在體外可以誘導tau蛋白和Aβ聚集。此后，肝素和花生四烯酸誘導的聚集模型被廣泛應用于tau蛋白的體外聚集研究。在沒有誘導劑的情況下，tau蛋白在體外的聚合能量屏障極高，誘導劑有效地降低了這種能量屏障。需要引起注意的是，大多數tau蛋白或其截短片段聚集的體外誘導只模擬了聚集的終點事件，而缺少對聚集動力學過程的模擬。在生理狀況下，tau蛋白的聚集存在一個起始的“成核”過程。Van Ameijde等[20]對以往的體外tau聚集模型進行了優(yōu)化，他們在全長tau蛋白中引入了C291A和C322A突變，并且對tau和肝素的比例進行優(yōu)化，在他們的體外誘導tau聚集實驗中，成功模擬了蛋白聚集的成核階段，并隨后驗證了抗體對tau聚合早期階段的干擾作用。但是最近的研究顯示，使用肝素誘導的tau細絲與AD患者腦中的細絲在結構上存在很大的差異[21]。Zhang等[22]通過冷凍電鏡和免疫電鏡觀察也得出了類似的結論。因此，在tau蛋白聚集抑制劑的體外篩選中，研究者在解釋試驗結果時應當將上述差異充分考慮在內。盡管如此，用肝素等聚陰離子或花生四烯酸誘導仍是目前常用的誘導tau蛋白體外聚集的方法之一[23]。

隨著近年來誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)技術的發(fā)展，利用其構建疾病細胞模型來也被廣泛地用于人類疾病研究和藥物篩選。傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)由于間質區(qū)室的缺乏，難以概括神經組織的復雜性，3D細胞培養(yǎng)技術在一定程度上彌補了2D細胞培養(yǎng)這方面的缺陷。2014年，Choi等[30]首次用3D細胞培養(yǎng)技術在人神經干細胞中同時重現了Aβ病理和tau病理。2018年，Gonzalez等[31]采用額顳葉癡呆患者來源的iPSC誘導出類腦器官，觀察到了Aβ和tau蛋白聚集，以及與病理蛋白聚集程度成正比的細胞凋亡現象。同年Yan等[32]使用患者來源的iPSC構建了3D類皮層組織模型，發(fā)現了Aβ分泌增多、tau蛋白過度磷酸化以及神經細胞死亡等典型的AD病理特征。這些細胞模型均有望后續(xù)能夠用于AD的藥物設計和篩選。

2.2 細胞水平研究方法 細胞水平研究主要采用以已建立的細胞系或者原代神經元、膠質細胞等為研究對象，在機制研究及藥物篩選中是不可或缺的重要組成部分。常用于構建tau病理細胞模型的細胞系有人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y、小鼠腦神經瘤細胞Neuro-2a(N2a)、大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC-12、人胚胎腎細胞293(human embryonic kidney cell 293,HEK293)、人髓核細胞(human nucleus pulposus cell,hNPC)和小鼠或大鼠的原代海馬神經元等[24]。主要技術方法是通過穩(wěn)定轉染tau、瞬時轉染tau或采用誘導劑處理，從而在一定程度上模擬AD患者腦內tau蛋白的聚集狀態(tài)，進而用于研究藥物對于抑制tau聚集的相關效果。如在穩(wěn)定表達tau441的HEK293細胞中觀察到了tau聚集體，用漆黃素處理后這些胞內的聚集體消失[25]。誘導細胞tau病理常用的誘導劑有剛果紅、多西環(huán)素、岡田酸、甲醛和外源性淀粉樣蛋白原纖維等[26]。檢測方法主要是硫黃素S染色、針對磷酸化tau蛋白進行免疫染色、引入熒光蛋白和免疫組織化學等方法。此外，本課題組用體外制備的具有細胞毒性的tau寡聚體處理N2a細胞，誘發(fā)細胞凋亡，同時發(fā)現了兩種黃酮類化合物能夠保護該tau寡聚體誘導的細胞凋亡[15，27]。最近人們通過熒光漂白恢復技術和超高分辨顯微鏡觀察到神經細胞內的tau蛋白液分離現象[28-29]，這為以tau寡聚體為靶點的藥物開發(fā)提供了一種全新的研究模型和方法。

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第二，房產稅。房產稅主要以抵債時公允價值進行計算，而房產抵債后，債權人在持有期間可以行使出租或使用的權利，但是需要繳納對應的稅款，按照抵債房產租金收入的12%申報納稅，如果不出租的，則應按照抵債房產余值的1.2%申報納稅。

在包括AD在內的tau相關疾病研究中，tau轉基因鼠是引用最為廣泛的動物模型[34]。1998年，Hutton等[35]對FTDP-17家族中的tau基因進行了測序，確定了患者攜帶的幾個錯義突變，其中一個是301位的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?000年，Lewis等[36]創(chuàng)建了表達突變型tau-P301L蛋白的轉基因小鼠模型。在該模型中，隨著年齡的增長小鼠腦內NFT增多，并且觀察到膠質細胞的增生、營養(yǎng)不良性軸突、神經元萎縮等現象，較好地模擬了NFT的病理特征。PS19模型是另一種表達tau-P301S突變的轉基因模型鼠，其內源性tau蛋白的表達水平約為正常小鼠的5倍，大約6個月后出現認知、學習、記憶缺陷以及tau病理特征。因為脊髓中的轉基因表達而導致后肢麻痹，該品系小鼠大多10至12月齡死亡[37]。rTg4510是一種雙基因品系小鼠，攜帶由CaMK Ⅱ啟動子控制的tau-P301L突變，其腦內tau蛋白表達水平高達正常小鼠的13倍，在2～3月齡即出現磷酸化tau蛋白，在4月齡時可在在皮層檢測出NFT，6月齡時在海馬檢測到NFT[38]。然而該品系小鼠的擴大繁殖較為煩瑣，其飼養(yǎng)繁殖成本較高。在AD研究中，2003年Oddo等[39]研發(fā)的3×Tg-AD小鼠的應用更為廣泛，通過將APPswe和tau-P301L顯微注射進Psen1-M146V突變基因敲入小鼠的單細胞胚胎中所得到的攜帶3種基因共存的穩(wěn)定遺傳小鼠，該品系小鼠可同時表現出tau異常聚集和β淀粉樣蛋白沉積這兩種典型病理特征。

在全部AD患者中，遺傳型AD患者只占不到5%，大部分的AD患者是散發(fā)型的。因此轉基因小鼠模型對散發(fā)型AD患者來說可能缺乏一定代表性。對于非轉基因AD小鼠模型，目前已有相關報道。岡田酸(okadaic acid，OA)是一種磷酸酯酶2A和磷酸酯酶Ⅰ的抑制劑，可以誘導神經元內tau蛋白過度磷酸化以及細胞凋亡[40]。Baker等[41]通過單腦側室注射OA后發(fā)現在雙側的皮層和海馬區(qū)均出現tau過度磷酸化以及tau聚集物。該模型多用于與tau蛋白磷酸化相關的藥物研發(fā)。另外，通過注射AD患者樣本分離提取出的tau寡聚體至野生型小鼠腦內，數月后發(fā)現注射區(qū)域以及鄰近區(qū)域出現豐富的tau蛋白纖維，同時其認知相關行為表現葉出現明顯損傷[42]。近年，Clavaguera等[43]將表達tau-P301S的小鼠腦tau寡聚體提取物注射到未出現認知損傷的人源tau小鼠的腦中，也可誘導小鼠內源tau蛋白自聚集形成纖維細絲，并且tau的聚集物從注射部位擴散到鄰近部位腦區(qū)。盡管這些模型都可用于tau蛋白聚集和傳播的藥物篩選，但是由于來源稀缺、過程復雜、不夠穩(wěn)定等因素，難以實現大規(guī)模的應用。在盡量模擬AD病人腦內真實情況的基礎上，性狀穩(wěn)定可控、易獲取的tau蛋白靶向藥物研究模型仍需進一步探索研發(fā)。

2.3 整體動物水平研究方法 研究人類疾病的動物疾病模型最早出現在1800年，并在隨后的時間里不斷改良和發(fā)展，推動了許多疾病的病理研究和藥物開發(fā)的進程。合適的動物模型對于藥物研發(fā)至關重要[33]。

關于tau蛋白的CADD方向主要集中在抑制tau蛋白過度磷酸化、聚集及乙?；萚45]。Pradeepkiran等[46]以tau蛋白作為靶蛋白，通過分子對接和三維藥效團在數據庫中篩選出5個針對于tau蛋白過度磷酸化中絲氨酸蛋白激酶的潛在抑制分子，并采用相應的算法對篩選出的5個分子進行了代謝性能和藥物毒性的預測。Zeb等[47]設計了細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinase 5，cdk25)/p25抑制劑的基本化學結構特點的藥效團模型，進而用該藥效團模型和分子對接篩選天然產物類藥物數據庫得到一系列候選藥物分子，最后通過分子動力學模擬確定了兩種通過占據該激酶中ATP結合部位而靶向cdk5/p25的潛在藥物分子。Kiss等[48]以全長tau蛋白和K18片段的單體結構為基礎，通過分子對接技術發(fā)現了一系列能夠與tau蛋白結合從而影響蛋白自身聚集的小分子化合物。有報道發(fā)現組蛋白去乙?；?histone deacetylase 6，HDAC6)在AD病理模型中上調[49]，而一種HDAC6抑制劑能夠顯著降低AD細胞模型內的tau磷酸化程度以及改善AD小鼠模型的記憶、學習障礙[50]。Zeb等[51]基于HDAC6的結構，通過藥效團模型和分子對接從一個含841分子的化合物庫中篩選出11個能夠穩(wěn)定對接HDAC6的化合物，進一步用分子動力學模擬手段發(fā)現3種最具潛力的HDAC6抑制劑，具有一定的AD治療潛力。隨著人工智能技術的飛躍發(fā)展，CADD也將更加廣泛地應用在AD的藥物研發(fā)領域，為攻克AD藥物研發(fā)提供有力的輔助和支撐作用。

2.4 計算機輔助藥物開發(fā)隨著計算機軟件和硬件的快速發(fā)展，計算機輔助藥物設計(computer aided drug design，CADD)被廣泛應用在各類疾病的藥物篩選中，提高了藥物開發(fā)的速度和準確性。CADD常用的技術模塊主要包括同源模建、分子對接、藥效團模型、定量構效關系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)等。與傳統(tǒng)的高通量篩選相比，CADD通過更具針對性的搜索來提高先導化合物的命中率，已經被廣泛應用于許多疾病的藥物篩選中。通過CADD，藥物研發(fā)工作者將大型化合物庫過濾為范圍較小的活性化合物集，大大減少實驗工作量。此外，CADD可以指導優(yōu)化先導化合物，增加其親和力、增強藥效或降低不良反應[44]。對于像AD這種發(fā)病機制復雜的疾病，單靶點藥物的藥效可能十分具有局限性，CADD可以幫助研究人員篩選或設計多靶點藥物分子。

3 小結與展望

隨著我國人口老齡化程度日益嚴重，AD逐漸成為危害老年人生活質量和生存壽命的主要危險因素，是我國公共衛(wèi)生和老年醫(yī)學領域面臨的嚴峻挑戰(zhàn)之一。盡早開發(fā)出可用于預防或治療AD的有效臨床藥物已成為一項迫切需求。自2003年美金剛上市后，長達十幾年沒有針對AD的藥物獲批。2019年耿美玉團隊開發(fā)了中國原創(chuàng)首款多靶點治療AD的藥物——GV971[52]，并正式在中國有條件上市，但是其臨床有效性有待更全面的臨床數據支持。2021年6月，靶向Aβ的單抗藥物Aducanumab獲FDA加速批準上市。該藥物由Biogen和Eisai合作開發(fā)，由于截至目前臨床獲益數據不是十分明確，存在很大爭議，其臨床有效性同樣需要更全面的臨床數據進一步支持。

早期靶向Aβ的藥物開發(fā)屢屢失敗使得許多藥物研發(fā)工作者將目光tau蛋白。但是近幾年一些靶向tau相關病理的藥物同樣由于在臨床試驗中未能達到有效臨床終點而宣告失敗[5，53]。AD藥物研發(fā)的臨床試驗反復失敗的原因之一可能是缺乏能夠全面模擬AD復雜發(fā)病機制的臨床前研究模型。本文在分子、細胞、動物以及計算機模擬4個水平上，總結了基于tau病理藥物研究的常用實驗方法及模型。這些方法模型各有利弊，研究人員可以根據自身條件及藥物研發(fā)所處階段選擇不同的模型。

豎井工程除井口部設置了單層SSm明洞襯砌外，其余地段均采用復合式襯砌；復合式襯砌是在豎井開挖完成后進行初期支護的施工，待其達到設計強度后施工二次襯砌；初期支護由系統(tǒng)錨桿、雙層鋼筋網、格柵鋼架、噴射混凝土組成，一般情況下二次襯砌采用素混凝土，以方便施工，但在V級圍巖以及洞口淺埋地段為了保證隧道的施工安全和整體的結構穩(wěn)定性，二次襯砌使用鋼筋混凝土施工。另外初期支護與二次襯砌之間鋪設300 g/m2土工布、1.5 mm厚單面自粘防水板作為復合防水層。

目前尚未建立一種模型可以很好地模擬AD的全部病理特征。研究人員在藥物開發(fā)的臨床前研究中可以盡可能采用人源化的實驗材料，或是結合多種模型綜合分析以得到更可靠的結論，利用計算機模擬技術提升發(fā)現潛在藥物的速度和準確性。此外，可以有效診斷早期AD標志物的研究對藥物的開發(fā)也具有很強的推動作用。臨床前研究成果向臨床轉化失敗率很高的一個可能原因是，根據目前臨床前疾病模型篩選出的潛在藥物極有可能是適用于相對早期的AD患者，而臨床招募的患者大多數是已經表現出臨床癥狀的中晚期患者。如果能有效地篩查出早期AD患者，可能可以開展不同適應階段的臨床試驗，降低臨床前研究的失敗率。在世界各國研究者的共同努力下，隨著對AD發(fā)病機制了解的不斷深入，相信AD的藥物開發(fā)會有快速的發(fā)展和突破。