基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討運脾化濁膏干預(yù)代謝綜合征的作用機制

林鵬展 金清龍 池美華

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是一組以腹型肥胖、高血糖、高血壓、血脂代謝異常、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為主要特征的代謝紊亂癥候群，并能顯著增高罹患心腦血管疾病及糖尿病等疾病的風(fēng)險[1]。因生活方式與飲食習(xí)慣的改變，我國中老年人MS 患病率高達33.9%，并呈逐年上升趨勢[2]。此外，肥胖兒童患MS 亦不在少數(shù)[3]。目前西醫(yī)治療MS 雖可采用干預(yù)生活方式并結(jié)合降糖、降壓、降脂等手段，但臨床療效有限[4]。中醫(yī)根據(jù)四診合參辨證論治，整體調(diào)節(jié)個體氣血陰陽，對改善MS 的癥狀及防治并發(fā)癥有良好效果[5]。運脾化濁膏由國醫(yī)大師王琦院士的體質(zhì)膏方加減變化而來，具有健脾理氣，利濕化濁的功效[6]。本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方向分析運脾化濁膏的藥物活性成分、靶點與痰濕質(zhì)MS 之間的作用關(guān)系，以期闡明其作用機制[7]。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源網(wǎng)址及數(shù)據(jù)分析軟件 中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，Uniprot）（https://www.uniprot.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM數(shù)據(jù)庫）（http://www.omim.org）、Disgenet 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）、Draw Venn Diagram 平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、STRING11.5 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）、Metascape平臺（https://metascape.org/）、生物信息在線作圖網(wǎng)站微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/）、Cytoscape 3.8.2 軟件。

1.2 運脾化濁膏藥物成分靶點篩選 運脾化濁膏成分為蒼術(shù)、白術(shù)、厚樸、陳皮、姜半夏、茯苓、薏苡仁、炒白扁豆、瓜蔞、桔梗、大腹皮、枳殼、絞股藍、太子參、砂仁、澤瀉、木香、浙貝母、干姜。挖掘TCMSP 數(shù)據(jù)庫，依據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[8]初步篩選出藥物活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點，將篩選出活性化合物靶點在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)化成規(guī)范化基因名稱。

1.3 構(gòu)建藥物四氣五味歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建出藥物的四氣五味及歸經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)圖，將藥物四氣五味導(dǎo)入軟件并進行網(wǎng)絡(luò)特征分析。

1.4 構(gòu)建運脾化濁膏“藥物-成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建運脾化濁膏“藥物-成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，將篩選出藥物有效成分與作用靶點導(dǎo)入軟件并以分析工具進行網(wǎng)絡(luò)特征分析。

1.5 MS 疾病靶點篩選 設(shè)代謝綜合征（Metabolic Syndrome）為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards、TTD、OMIM、Disgenet 數(shù)據(jù)庫等來獲取其疾病潛在靶點，整理靶點合并并刪除重復(fù)值后獲得MS 的疾病靶點。

1.6 構(gòu)建運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò) 取運脾化濁膏與MS 兩者靶點通過Draw Venn Diagram 平臺繪制出韋恩圖，在String11.5 平臺中構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI），將物種限定為人，最低相互作用評分設(shè)置成最高置信度（0.900），構(gòu)建出運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape3.8.2 軟件中進行優(yōu)化與拓撲分析，預(yù)測關(guān)鍵靶點。

1.7 運脾化濁膏-MS 關(guān)鍵靶點GO、KEGG 分析 將已預(yù)測的關(guān)鍵靶點提交至Metascape 平臺中進行基因本體（geno ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析通路富集分析，運用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建運脾化濁膏-MS 關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并利用微生信平臺繪制GO-BP 通路與KEGG 通路的條形圖。

1.8 構(gòu)建運脾化濁膏活性成分-重合靶點-MS-通路網(wǎng)絡(luò)圖 通過Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建出運脾化濁膏活性成分-重合靶點-MS-通路靶點網(wǎng)絡(luò)圖，利用“network analyzer”分析工具進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，節(jié)點程度以連接度值調(diào)節(jié)，連接度值越大表明其生物活性越高，功能越齊全，重要性越高。

2 結(jié)果

2.1 運脾化濁膏藥物成分信息 挖掘TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得運脾化濁膏藥物有效成分及作用靶點，其中蒼術(shù)有效成分4 種，作用靶點57 個；白術(shù)有效成分7種，作用靶點20 個；厚樸有效成分2 種，作用靶點27個；陳皮有效成分5 種，作用靶點63 個；姜半夏有效成分12 種，作用靶點86 個；茯苓有效成分6 種，作用靶點19 個；薏苡仁有效成分6 種，作用靶點28個；炒白扁豆有效成分7 種，作用靶點68 個；瓜蔞有效成分10 種，作用靶點15 個；桔梗有效成分4 種，作用靶點66 個；大腹皮有效成分6 種，作用靶點25個；枳殼有效成分5 種，作用靶點85 個；絞股藍有效成分14 種，作用靶點146 個；太子參有效成分6 種，作用靶點85 個；砂仁有效成分9 種，作用靶點49個；澤瀉有效成分7 種，作用靶點5 個；木香有效成分5 種，作用靶點29 個；浙貝母有效成分5 種，作用靶點48 個；干姜有效成分5 種，作用靶點42 個；合并并刪除重復(fù)值后可獲得藥物有效成分共99 個，作用靶點共261 個。其中β-谷固醇與豆甾醇為較多藥物共有化合物。見表1。

表1 運脾化濁膏主要成分表

2.2 運脾化濁膏藥物四氣五味歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 將運脾化濁膏藥物及其四氣五味與歸經(jīng)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件進行分析，構(gòu)建運脾化濁膏“藥物—四氣”“藥物-五味”“藥物-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。全方藥物四氣以溫性為主，占藥物的47.36%，五味主要以辛甘苦味為主，占藥物的94.73%，歸經(jīng)主歸肺胃二經(jīng)，占總藥物的84.12%。

圖1 “藥物-四氣”“藥物-五味”“藥物-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 運脾化濁膏“藥物-成分-作用”網(wǎng)絡(luò) 將運脾化濁膏中99 個有效成分及261 個作用靶點導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件進行分析，構(gòu)建出運脾化濁膏“藥物-成分-作用”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點表示靶點信息，邊表示節(jié)點間的作用聯(lián)系。網(wǎng)絡(luò)圖中共有379 個節(jié)點，1460 條邊，其網(wǎng)絡(luò)度中心性均值為5.97，介度中心性均值為5.60E-03，緊密中心度均值為0.29。見圖2。

圖2 運脾化濁膏“藥物-成分-作用”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 MS 疾病靶點 通過挖掘Genecards 數(shù)據(jù)庫可獲得15716 個MS 疾病靶點，根據(jù)相關(guān)性得分由大致小進行排序，選取前八分之一的靶點作為目標(biāo)靶點，可獲得1964 個靶點，繼續(xù)挖掘OMIM 數(shù)據(jù)庫、Disgenet 數(shù)據(jù)庫與TTD 數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，共獲得MS 疾病靶點2464 個。

2.5 運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò) 將運脾化濁膏與MS 獲得靶點通過Draw Venn Diagram 平臺繪制出韋恩圖（見圖3），可見兩者共存126 個共同靶點，通過String11.5 平臺構(gòu)建出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），本研究置信度設(shè)為0.900，并隱藏斷開連接節(jié)，該網(wǎng)絡(luò)圖中可視其PPI 中節(jié)點數(shù)為126，預(yù)期邊數(shù)133，邊數(shù)382，PPI 富集P 值為＜1.0e-16，平均節(jié)點數(shù)6.06，平均局部聚類系數(shù)0.344，于Cytoscape 3.8.2 軟件中勾畫網(wǎng)絡(luò)圖（見圖5），經(jīng)分析可知該網(wǎng)絡(luò)度中心性均值為7.01，介度中心性均值1.85e-02，選取均大于均值的度中心性與介度中心性可篩選出26 個核心靶點（見表2），占共同靶點的20.63%

表2 核心靶點拓撲屬性參數(shù)

圖3 運脾化濁膏-MS 韋恩圖

圖4 運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)（1）

圖5 運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)（2）

2.6 GO 與KEGG 通路分析 將核心靶點置于Metascape 數(shù)據(jù)庫進行GO 及KEGG 通路富集分析，分析以P＜0.01 為標(biāo)準(zhǔn)，將P 值由小到大進行排序，選擇前20 條GO 及KEGG 進行分析。通過Cytoscape 3.8.2 軟件、生物信息在線作圖網(wǎng)站微生信進行繪制其網(wǎng)絡(luò)圖與條形圖，整理可獲得圖6、圖7、表3。經(jīng)分析，運脾化濁膏改善MS 的細胞成分主要為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、膜筏、膜微區(qū)、囊腔、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、小窩、質(zhì)膜筏、分泌顆粒腔、胞質(zhì)泡腔、血液微粒、主軸、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、粘著斑、質(zhì)膜的外在成分、細胞-基底連接、蛋白質(zhì)DNA 復(fù)合物、胞體、細胞基部、膜側(cè)等；生物過程主要涉及有機環(huán)化合物、生長因子、氧化應(yīng)激、類固醇激素、激素刺激、細胞死亡、活性氧、無機物、脂質(zhì)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞程序性死亡等的反應(yīng)；分子功能包括結(jié)合DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、磷酸酶、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、、細胞因子受體、轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)、核心啟動子序列特異性DNA、蛋白激酶、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性蛋白磷酸酶，并調(diào)節(jié)信號受體激活劑、受體-配體、核受體、配體激活轉(zhuǎn)錄因子等活性。KEGG 通路分析可視，其主要通路可能為AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路相關(guān)。

表3 KEGG 前20 條通路表

圖6 富集分析通路條形圖

圖7 富集分析通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 構(gòu)建運脾化濁膏-MS-通路網(wǎng)絡(luò)圖 將運脾化濁膏藥物成分，活性化合物、重合靶點、核心靶點，KEGG 通路信息通過Cytoscape 3.8.2 軟件進行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（見圖8）。

圖8 運脾化濁膏-MS-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

MS 病情多樣冗雜，常常以腹型肥胖、高血糖、高血壓、血脂代謝異常、IR 為主要特征，MS 發(fā)病機制雖進行多方面的研究，目前仍未完全闡明。中醫(yī)根據(jù)MS 的臨床癥狀，將其歸納為“肥胖”“消渴”“眩暈”等諸證[9]，多由于患者飲食不節(jié)、安逸少動、情志失調(diào)或稟賦不足等，導(dǎo)致出現(xiàn)痰濕等病理產(chǎn)物，繼而影響脾臟的生理功能[10]。脾者，后天之本也，主運化，運化失常無力輸布水谷精微，則濕邪內(nèi)生，痰濁內(nèi)阻，痰濕與脾虛互相影響，表現(xiàn)為一系列MS 癥狀。王琦教授首次提出痰濕體質(zhì)，并構(gòu)建出痰濕體質(zhì)理論體系[6]，并擅長以體質(zhì)膏方調(diào)理MS 患者，運脾化濁膏為體質(zhì)膏方改制而來。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測運脾化濁膏治療MS 的潛在機制。挖掘TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得藥物有效成分99 種，作用靶點261 個，主要有效成分包括β-谷固醇與豆甾醇等；繪制出組成藥物四氣五味歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖，分析可知，全方以溫性，辛甘苦味為主，主歸脾胃二經(jīng)；挖掘各項疾病數(shù)據(jù)庫獲得MS 靶點2464個，繪制出韋恩圖獲得交集靶點126 個。通過String11.5 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI，以Cytoscape 3.8.2 軟件進行拓撲分析篩選出26 個核心靶點，占總靶點數(shù)的20.63%，關(guān)鍵靶點為TP53、AKT1、MAPK1、CTNNB1、TNF、ESR1、EGFR、CAV1、IL6、FOS、STAT1、AR、CASP3、IL10、IL4、INS、PPARA、F2、PLG、PPARGC1A、EDN1、FN1、NR3C1、PPARG、CASP8、IGFBP3。將核心靶點通過Metascape 數(shù)據(jù)庫進行GO 及KEGG 分析，經(jīng)分析，運脾化濁膏可通過結(jié)合DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、磷酸酶、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子受體、轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)、核心啟動子序列特異性DNA、蛋白激酶、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性蛋白磷酸酶，并調(diào)節(jié)信號受體激活劑、受體-配體、核受體、配體激活轉(zhuǎn)錄因子等活性來改善MS 相關(guān)癥狀，及主要通路可能與AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、Toll樣受體信號通路相關(guān)。

早在1988 年研究者已發(fā)現(xiàn)β-谷固醇具有降血糖與胰島素釋放的功效[11]。Cicero Arrigo 等[12]研究發(fā)現(xiàn)低劑量β-谷固醇可降低血脂水平，且安全性與有效性良好。Babu 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷固醇是通過IRS-1/Akt 介導(dǎo)的胰島素信號通路減輕胰島素抵抗。近年來研究證實豆甾醇是通過抑制腸道相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白表達[14]、抑制各項酶類活性[15]，增加膽固醇逆向轉(zhuǎn)運相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白[16]來提高膽固醇的排泄，并且通過干擾腸道脂肪酸吸收[17]、調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝來降低三酰甘油的水平[18-19]。

金代醫(yī)家張元素所著《醫(yī)學(xué)啟源》曰：“脾胃：味甘補，苦瀉，氣溫?zé)嵫a，寒涼瀉[20]?！庇钟小遁o行決》言：“脾德在緩，故經(jīng)云：以甘補之，辛瀉之[21]?！毙詼厣菩袣饣瘽裼旨嫜a脾，味苦則燥濕，味辛則發(fā)散濕邪，味甘則補脾，又走脾胃二經(jīng)，因而本方可行健脾理氣，利濕化濁之功。

根據(jù)GO 及KEGG 分析，運脾化濁膏可能是通過結(jié)合DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、磷酸酶、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子受體、轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)、核心啟動子序列特異性DNA、蛋白激酶、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性蛋白磷酸酶，并調(diào)節(jié)信號受體激活劑、受體-配體、核受體、配體激活轉(zhuǎn)錄因子等活性來改善MS 相關(guān)癥狀，作用通路可能與AGE-RAGE信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路相關(guān)。AGE-RAGE 信號通路與MS 息息相關(guān)，患者一旦發(fā)生胰島素抵抗，則血糖升高，繼而蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等出現(xiàn)非酶糖基化，形成糖基化終末產(chǎn)物，通過與細胞膜上的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)[22]。研究表明IL-17 信號通路與胰島素抵抗也存在相關(guān)性，并且對限制性肥胖相關(guān)性胰島素抵抗與驗證控制方面均有積極作用[23]。Toll 樣受體2 作為一種識別受體，可通過識別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式而啟動機體的免疫防御反應(yīng)同時引發(fā)炎癥，與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)[24]。

綜上所訴，本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步分析預(yù)測了運脾化濁膏治療MS 的潛在機制，但后期仍需要分子層面及臨床試驗研究佐以驗證，為其臨床運用提供有效的理論依據(jù)。