合成MRI 定量參數(shù)圖與ADC 圖直方圖特征對乳腺癌Ki-67表達(dá)狀態(tài)的預(yù)測研究

李方正，李芹，吳莎莎，孫勝君，于海童，陳永升，牛慶亮*

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，在臨床、組織學(xué)和分子水平均表現(xiàn)出多樣性的特點(diǎn)[1-2]。Ki-67 是由MKI67 基因編碼的細(xì)胞核蛋白質(zhì)，Ki-67 指數(shù)即蛋白質(zhì)染色陽性細(xì)胞的百分比。一般情況下，Ki-67 指數(shù)越高，表明細(xì)胞分裂增殖越活躍、侵襲性越強(qiáng)[3]。對于Ki-67 高表達(dá)的乳腺癌分子亞型，需采取及時(shí)、強(qiáng)效的干預(yù)措施，以控制疾病進(jìn)展。在臨床實(shí)踐中，乳腺癌術(shù)前腫瘤侵襲性的評估主要依靠穿刺活檢，通過局部組織的病理學(xué)檢測來評估Ki-67 的表達(dá)水平。然而，穿刺活檢為有創(chuàng)性檢查，且取材較為局限，往往難以獲取腫瘤組織的完整信息。因此如何能夠在治療前無創(chuàng)、精準(zhǔn)地評估乳腺癌的Ki-67表達(dá)狀態(tài)是十分有意義的臨床問題。

MRI具有高軟組織分辨率的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的診斷與療效評估中[4]。然而，傳統(tǒng)乳腺M(fèi)RI需要采集多個(gè)序列，而且圖像的解讀主要基于不同組織的對比度，易受診斷醫(yī)生主觀經(jīng)驗(yàn)的影響。此外，不同設(shè)備所采集的圖像差異較大，圖像標(biāo)準(zhǔn)化流程繁瑣，難以適用于多中心研究。合成MRI 是一種新型的成像方法，通過使用多回波和多延遲采集方法，一次掃描即可快速采集多種定量參數(shù)圖像[如T1-mapping、T2-mapping及質(zhì)子密度（proton density, PD）-mapping]并準(zhǔn)確量化組織的相應(yīng)定量參數(shù)值（如T1值、T2值以及PD 值）[5]。該技術(shù)已應(yīng)用于全身多個(gè)部位如大腦[6-9]、骨關(guān)節(jié)[10-11]、前列腺[12]及乳腺[13-14]等，有研究證明合成MRI 的臨床應(yīng)用具有較高的準(zhǔn)確性和較好的可重復(fù)性[15]。有研究分析得出合成MRI 相關(guān)定量參數(shù)圖的直方圖特征是鑒別乳腺浸潤性導(dǎo)管癌相關(guān)免疫組化指標(biāo)和分子亞型的潛在生物標(biāo)志物[16]。然而，合成MRI 定量參數(shù)圖的直方圖特征是否能夠用于無創(chuàng)性評估乳腺癌Ki-67的表達(dá)狀態(tài)尚不明確。因此，本研究的目的是評估合成MRI相關(guān)定量參數(shù)圖直方圖特征對乳腺癌Ki-67表達(dá)狀態(tài)的預(yù)測價(jià)值，并與傳統(tǒng)的表觀擴(kuò)散系數(shù)（apparent diffusion coefficient,ADC）圖直方圖特征進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 研究對象

該回顧性研究得到了濰坊市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，免除受試者知情同意（批準(zhǔn)文號：2021-02號）。本研究對自2019年12月至2021年3月期間在濰坊市中醫(yī)院就診的乳腺癌患者病例進(jìn)行了評估。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）MRI檢查前均未行臨床治療，檢查后1周內(nèi)行手術(shù)或穿刺術(shù)取得病理標(biāo)本；（2）經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)病理確診為乳腺癌；（3）MRI掃描序列完整，包括擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion-weighted imaging,DWI）、動(dòng)態(tài)對比增強(qiáng)MRI（dynamic contrast-enhanced MRI, DCE-MRI）和合成MRI；（4）乳腺癌患者均為女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）圖像有嚴(yán)重的偽影；（2）增強(qiáng)圖像病灶呈非腫塊型強(qiáng)化；（3）病灶最大徑＜1 cm。

1.2 MRI掃描方案

乳腺M(fèi)RI掃描采用3.0 T MRI系統(tǒng)（SIGNA Pioneer,GE Healthcare），患者取俯臥位，雙乳自然下垂置于8 通道相控陣乳房表面線圈內(nèi)。依次進(jìn)行常規(guī)軸位快速自旋回波（fast spin echo, FSE）T1WI序列、短時(shí)反轉(zhuǎn)恢復(fù)（short time inversion recovery, STIR）T2WI序列和DWI（b=0、800 s/mm2）序列、合成MRI序列及DCE-MRI序列（共8期）掃描。靜脈注射對比劑[釓雙胺注射液（歐乃影），GE藥業(yè)，愛爾蘭]，速率2 mL/s，劑量0.1 mmol/kg。各序列詳細(xì)掃描參數(shù)見表1。

表1 不同磁共振成像序列掃描參數(shù)Tab.1 Scan parameters of different magnetic resonance sequence

1.3 直方圖特征提取及MRI影像特征分析

MAGIC 的原始圖像數(shù)據(jù)使用SyMRI 8.0 軟件（SyntheticMRI, Link?ping, Sweden）處理以生成定量參數(shù)圖（T1-mapping、T2-mapping 和PD-mapping）（圖1A～1C）。為了清晰準(zhǔn)確地勾畫病灶邊界，我們首先對DCE-MRI 的第二期（病灶邊緣最明顯的峰值增強(qiáng)相）圖像與處理后的MAGIC圖像在MATLAB（MathWorks,Natick, MA）中進(jìn)行配準(zhǔn)。然后兩位分別具有5 年和8 年乳腺影像診斷經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師使用ITK-SNAP（http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php）軟件在配準(zhǔn)的DCE-MRI 圖像上手動(dòng)逐層勾畫感興趣區(qū)（region of interest, ROI），最終得到3D-ROI（圖1D、1E），勾畫時(shí)盡量避開壞死、囊變及出血區(qū)域。當(dāng)同側(cè)乳腺存在多個(gè)腫塊時(shí)，評估最大的一個(gè)腫塊。兩位診斷醫(yī)師在勾畫ROI 時(shí)對臨床資料、病理結(jié)果和其他影像學(xué)檢查結(jié)果均不知曉。最后，應(yīng)用Pyradiomics 軟件提取定量參數(shù)圖T1-mapping、T2-mapping、PD-mapping 的直方圖特，包括10th位數(shù)、90th位數(shù)、均值、熵、峰度、偏度。在DWI（b=800 s/mm2）原始圖像上手工逐層放置ROI，將獲得的ROI 復(fù)制到ADC圖提取ADC圖的直方圖特征，方法同上（圖1F、1G）。

MRI 影像特征的評估也由同樣由以上兩位主治醫(yī)師進(jìn)行，包括病灶最大徑（DCE-MRI 第二期測得）、形態(tài)（圓形或卵圓形、不規(guī)則形）、邊緣（光整、不光整）、強(qiáng)化方式（均勻、不均勻、環(huán)形強(qiáng)化）、纖維腺體類型（脂肪型、少量腺體型、多量腺體型、致密型）。

1.4 病理評估

病理結(jié)果判定，Ki-67 免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選10個(gè)高倍鏡視野（×400），計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)：陽性細(xì)胞數(shù)＜30%為低表達(dá)組，≥30%為高表達(dá)組（圖2）。ER、PR 染色陽性細(xì)胞比例大于1%記為陽性。免疫組織化學(xué)檢測顯示HER-2為3+記為陽性，1+或0記為陰性，如果HER-2 為2+，應(yīng)再進(jìn)行熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization,FISH）檢測以明確HER-2 狀態(tài)，F(xiàn)ISH 結(jié)果陽性記為HER-2 陽性，F(xiàn)ISH 結(jié)果陰性記為HER-2陰性。

圖2 2A、2B 分別為乳腺癌Ki-67 低表達(dá)（10%）和Ki-67 高表達(dá)（80%）的病理圖片（×400）。Fig. 2 2A and 2B pathological pictures of breast cancer with low (10%)and high(80%)expression of Ki-67(×400).

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0、MedCalc和GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)作圖，定量參數(shù)圖及ADC圖的直方圖特征以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床及病理特征以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Shapiro-wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（P25，P75）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（independent samplet檢驗(yàn)）或非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法進(jìn)行組間比較。將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的參數(shù)納入多因素logistic回歸分析，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線，并計(jì)算鑒別乳腺癌Ki-67表達(dá)狀態(tài)的曲線下面積（area under the curve,AUC）、敏感度、特異度及準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及病理免疫組化結(jié)果

146 例患者均為女性，年齡（49.86±9.83）歲，共147 個(gè)病灶，其中一例患者左、右乳各一個(gè)病灶。病理結(jié)果均為非特殊類型乳腺癌，其中浸潤性導(dǎo)管癌130例、浸潤性小葉癌4例、浸潤性導(dǎo)管癌伴導(dǎo)管原位癌11 例、浸潤性導(dǎo)管癌伴浸潤性小葉癌1 例，微乳頭狀癌1例。分子分型包括：Lumina A型29例，Lumina B型66例，HER-2過表達(dá)17例，三陰性（triple negative,TN）35 例。147 例乳腺癌病灶Ki-67 指數(shù)2%～95%，平均值39.86%±25.61%，其中低表達(dá)56例，高表達(dá)91例。

2.2 Ki-67 高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的臨床、MRI 影像特征比較

Ki-67高表達(dá)組與低表達(dá)組間，患者的年齡、病灶最大徑、形態(tài)、邊緣、強(qiáng)化方式及纖維腺體類型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值范圍為0.09～0.94）（表2）。

表2 乳腺癌Ki-67高、低表達(dá)組臨床及MRI影像特征比較Tab.2 Comparison of the clinical and MRI characteristics of breast cancer between the high and low expression of Ki-67

2.3 Ki-67高、低表達(dá)間MRI相關(guān)定量參數(shù)比較

Ki-67 高表達(dá)組與低表達(dá)組間，T1-平均值（P＜0.001）、T1-10th位 數(shù)（P＜0.001）、T2-平 均 值（P=0.002）、T2-10th位數(shù)（P＜0.001）、PD-熵值（P=0.005）及PD-峰度（P＜0.001）的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Ki-67高表達(dá)組的T1-平均值、T1-10th位數(shù)、T2-平均值、T2-10th位數(shù)和PD-峰度均大于Ki-67 低表達(dá)組，Ki-67 高表達(dá)組PD-熵值小于Ki-67 低表達(dá)組（表3）。Ki-67 高表達(dá)組與低表達(dá)組間，ADC 值的直方圖特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值范圍0.14 至0.96）。T1-平均值、T1-10th位數(shù)、T2-平均值、T2-10th位數(shù)、PD-熵值及PD-峰度區(qū)分Ki-67 高、低表達(dá)的AUC 值分別為0.69、0.75、0.68、0.74、0.63、0.67（表4）。

表3 Ki-67高、低表達(dá)組間合成MRI定量參數(shù)圖、ADC值直方圖特征比較Tab.3 Comparison of histogram features of synthetic MRI quantitative parameters and ADC values between the high and low expression of Ki-67

表4 Ki-67高、低表達(dá)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的定量參數(shù)的診斷效能Tab.4 The diagnostic efficacy of quantitative parameters with statistical significance between the high and low expression of Ki-67

將以上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的參數(shù)納入多因素logistic回歸分析得出，T1-10th位數(shù)、T2-10th位數(shù)是Ki-67表達(dá)狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)測因素（表5）。采用箱式圖顯示T1-10th位數(shù)、T2-10th位數(shù)在Ki-67 高、低表達(dá)組間數(shù)據(jù)的差異（圖3）。聯(lián)合T1-10th位數(shù)、T2-10th位數(shù)建立logistic回歸模型進(jìn)行診斷效能分析，得出AUC值為0.809（95%CI：0.737～0.869），敏感度為64.8%，特異度為87.5%，準(zhǔn)確度為72.8%（圖4）。

表5 區(qū)分Ki-67高、低表達(dá)組的多因素logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis to distinguish the high and low expression of Ki-67

圖3 T1-10th位數(shù)（3A）、T2-10th位數(shù)（3B）在Ki-67高、低表達(dá)組分布的箱式圖。Ki-67：細(xì)胞增殖指數(shù)；10th位數(shù)：第十百分位數(shù)。Fig.3 Box-whisker plot showing the T1-10th(3A),T2-10th(3B)percentile of the high and low expression of Ki-67.

圖4 合成磁共振定量參數(shù)圖直方圖特征聯(lián)合診斷模型預(yù)測Ki-67 高、低表達(dá)情況的ROC 曲線。Ki-67：細(xì)胞增殖指數(shù)；ROC：受試者工作特征。Fig.4 Receiver-operating characteristic (ROC) curve of predicting the high and low expression of Ki-67 by the combined diagnostic model of the histogram features of synthetic magnetic resonance imaging(SyMRI)quantitative parametric map.

3 討論

Ki-67 表達(dá)狀態(tài)是輔助乳腺癌分子分型、預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后及新輔助治療療效的重要指標(biāo)，可為臨床個(gè)體化精準(zhǔn)診療提供依據(jù)。本研究探討了乳腺癌合成MRI定量參數(shù)圖及ADC圖直方圖特征與Ki-67表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系，研究得出T1-10th位數(shù)與T2-10th位數(shù)是預(yù)測Ki-67狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)測因素,這為治療前精準(zhǔn)評估乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖情況提供了一種新的輔助診斷方法。

3.1 合成MRI定量參數(shù)直方圖特征的臨床意義

合成MRI 是一種2D 自旋回波多動(dòng)態(tài)多回波掃描技術(shù)，一次掃描即可獲得T1、T2、PD 三種定量參數(shù)圖像且可重建任意對比加權(quán)圖像。合成MRI 獲取的圖像顯示了僅基于單個(gè)組織參數(shù)的純對比度，并且由于內(nèi)部B1 場的校正，可以最大限度減少透射射頻場B1 對圖像的影響，這些特點(diǎn)為多中心研究提供了支持。與傳統(tǒng)的T1、T2、PD 定量方法相比，合成MRI 掃描可以減少長時(shí)間采集過程中可能出現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)偽影等影響。本研究使用了3D-ROI 畫法，相對于以往在最大層面繪制ROI,可以獲取更加完整的腫瘤信息，從而更全面地反映病變的整體異質(zhì)性。另外，直方圖特征可以將影像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為具有高分辨率的可發(fā)掘的特征空間數(shù)據(jù)，之前乳腺腫瘤領(lǐng)域的直方圖特征大多基于DWI 或DCE-MRI 技術(shù)，基于合成MRI 定量參數(shù)圖的直方圖特征少有報(bào)道。

3.2 評估Ki-67高低表達(dá)狀態(tài)對于乳腺癌的重要性

Ki-67水平可以反映乳腺腫瘤的增殖情況[17]。腫瘤增殖活性越高者，Ki-67 指數(shù)越高。世界衛(wèi)生組織將Ki-67 小于14%的情況稱之為低表達(dá)，但是不同種族、地區(qū)、國家的患者及不同衛(wèi)生組織，Ki-67 水平高低的評定標(biāo)準(zhǔn)有所區(qū)別。有研究對1800例早期TNBC患者Ki-67最佳分界進(jìn)行評估得出與預(yù)后最密切的臨界值是30%[18]。Sachiko等[19]將乳腺癌Ki-67以30%為界分為Luminal A型和Luminal B型。中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021 版）表明Ki-67 增殖指數(shù)的判定值在不同病理實(shí)驗(yàn)中心可能有所不同，可采用20%～30%作為判斷Ki-67 高低的界值。2021 年乳腺癌Ki-67 國際工作組根據(jù)最新的評估標(biāo)準(zhǔn)將Ki-67＞30%定義為高表達(dá)[20]。根據(jù)本研究乳腺癌Ki-67 數(shù)據(jù)的表達(dá)情況并結(jié)合以上標(biāo)準(zhǔn)，將Ki-67≥30%定義為高表達(dá)，＜30%定義為低表達(dá)。Ki-67在乳腺癌的診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后判斷以及判斷新輔助化療療效等方面具有重要價(jià)值。目前臨床上Ki-67 增殖指數(shù)主要通過活檢或手術(shù)后取材標(biāo)本獲得，不僅為有創(chuàng)性檢查，且不能反映整個(gè)腫瘤的異質(zhì)性，準(zhǔn)確率還常受抽樣誤差的影響，另一方面Ki-67增殖指數(shù)是動(dòng)態(tài)變化的[21]，活檢或手術(shù)后取材標(biāo)本的方法無法便捷、有效地反映Ki-67增殖指數(shù)的變化情況。

3.3 合成MRI定量參數(shù)T1值、T2值與乳腺癌Ki-67的關(guān)系

組織病理學(xué)是腫瘤影像學(xué)表現(xiàn)的基礎(chǔ)，因此MRI可以間接反映乳腺癌的免疫組織化學(xué)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況[22]。MRI 定量成像手段不僅能夠在術(shù)前無創(chuàng)反映腫瘤整體的異質(zhì)性，還可以進(jìn)行多次動(dòng)態(tài)評價(jià)，對指導(dǎo)臨床個(gè)性化診斷、治療及預(yù)后有重大意義。T1 值是組織的縱向弛豫時(shí)間，與組織含水量、水結(jié)合力和大分子濃度有關(guān)。以往T1定量值多用于評估心肌纖維化、肝纖維化以及膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，在乳腺癌Ki-67 表達(dá)方面的研究較少。Matsuda 等[23]對乳腺病變注射對比劑前、后的T1、T2和PD值及其標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)注射對比劑后T1值的標(biāo)準(zhǔn)差是Ki-67表達(dá)的獨(dú)立預(yù)測因素，AUC值可達(dá)到0.885。此外，該研究團(tuán)隊(duì)[15]還將乳腺病變注射對比劑前、后的T1、T2 和PD值及其差值和比值納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變注射對比劑前T1 值高于良性病變。本研究中，Ki-67高表達(dá)組的T1-平均值及T1-10th均高于Ki-67低表達(dá)組，分析認(rèn)為可能與Ki-67 高表達(dá)組腫瘤呈高增殖，腫瘤細(xì)胞密度高、瘤內(nèi)更易出血、壞死有關(guān)。

T2 值反映的是人體組織自由水分子之間能量交換的能力，主要與自由水含量、蛋白多糖、膠原含量和排列方式有關(guān)。Jung等[24]報(bào)道合成MRI獲得的乳腺癌T2 弛豫時(shí)間與基于多回波自旋回波（multi-echo spin echo, MESE）T2-mapping的T2弛豫時(shí)間呈正相關(guān)，這說明合成MRI所測得的T2值同樣可反映機(jī)體組織的微觀變化。有研究認(rèn)為當(dāng)惡性程度較高的腫瘤發(fā)生鄰近組織侵犯時(shí)，會分泌較多的透明質(zhì)酸酶，而透明質(zhì)酸酶具有延長橫向弛豫時(shí)間的屬性，是造成T2 值較高的原因[25]。本研究中Ki-67 高表達(dá)組的T2-10th高于低表達(dá)組，可能與Ki-67高表達(dá)組腫瘤組織增殖活性程度高及侵襲性強(qiáng)有關(guān)。

3.4 ADC值與乳腺癌Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性研究結(jié)果不一致

ADC 值能夠反映組織水分子擴(kuò)散受限的程度。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞體積或特殊的空間排列以及細(xì)胞的密集程度是影響水分子運(yùn)動(dòng)的重要因素[26]。以往有研究表明ADC 值與Ki-67 指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[27]，即Ki-67指數(shù)越高，細(xì)胞增殖越明顯，相應(yīng)地ADC值就越低。但也有研究顯示乳腺癌的ADC 值與Ki-67 無明顯相關(guān)性[28-29]。李芹等[30]研究浸潤性乳腺癌ADC 值與Ki-67 無顯著相關(guān)性，作者分析可能與病例中未排除非腫塊型病灶有關(guān)。由此可見，ADC 值與Ki-67 的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。在本研究中，Ki-67 高、低表達(dá)組之間的ADC圖的直方圖特征之間沒有顯著差異，分析原因可能是由于乳腺癌基質(zhì)成分較復(fù)雜，癌灶內(nèi)可能存在的微鈣化及微液化壞死區(qū)對ADC 值的影響等因素有關(guān)。此外，乳腺癌新生血管豐富，血流灌注也可能成為影響ADC值的重要因素。

3.5 局限性及展望

本研究有一定的局限性：（1）本研究屬于單中心研究，未進(jìn)行外部驗(yàn)證；（2）本研究DWI 為單指數(shù)模型，相對于多b值DWI模型的研究[如體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)（intravoxel incoherent motion, IVIM）]，可能未完全排除微血管灌注對ADC 值的影響；（3）本研究未將最大徑＜1 cm 的乳腺癌病變納入分析，因此建立的模型對該類病變Ki-67表達(dá)狀態(tài)的預(yù)測效能尚不可知。下一步研究將會探討多b值DWI與乳腺癌免疫組化指標(biāo)的關(guān)系，并且對于＜1 cm的乳腺癌病變還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，合成MRI定量參數(shù)圖的直方圖特征可以用于評估乳腺癌Ki-67的表達(dá)狀態(tài)，這為術(shù)前全面地預(yù)測乳腺癌的侵襲性提供了一種新的無創(chuàng)性方法。

作者利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。