間充質干細胞來源的外泌體治療慢性創(chuàng)面研究進展

李岱洛，付海亮

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨外科，哈爾濱 150086)

皮膚傷口愈合的過程復雜。受傷會引發(fā)一系列重疊的事件：①止血；②炎癥反應；③組織的形成/細胞增殖；④組織重塑、成熟[1]。糖尿病、感染、靜脈淤滯會使傷口愈合過程出現(xiàn)異常，具體表現(xiàn)為傷口出現(xiàn)過度炎癥反應、成纖維細胞遷移和增殖能力受損、膠原形成與沉積異常、再上皮化受阻等，最終導致傷口延遲愈合、瘢痕化和慢性創(chuàng)面的形成。慢性創(chuàng)面存在遷延不愈、治療時間長、治療難度大、費用高、反復發(fā)作、致殘率高等問題，使患者喪失正常的生活自理能力，給個人、家庭及社會造成沉重的負擔[2]。外泌體作為間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的一種細胞外囊泡，在MSC參與組織修復過程中發(fā)揮重要作用。作為一種非細胞治療手段，MSC來源的外泌體(MSC-derived exosomes,MSC-exo)的應用既可以避免干細胞移植所帶來的免疫排斥反應和致癌風險[3]，又可以促進慢性創(chuàng)面的修復,為慢性創(chuàng)面治療提供了一個新策略?，F(xiàn)就MSC-exo治療慢性創(chuàng)面的研究進展進行綜述。

1 外泌體的概述

外泌體是細胞主動分泌的大小均一，直徑為30～100 nm，密度為1.10～1.18 g/ml的囊泡樣小體[4]。外泌體富含膽固醇和鞘磷脂，具有脂質雙分子層結構，廣泛存在于各種體液中，如尿液、唾液、血液[5]。提取和純化外泌體主要依據(jù)其理化特性，具體方法包括超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、超濾法、聚乙二醇沉淀法、色譜法、免疫磁珠法及試劑盒提取法等[6]。由于外泌體是由細胞分泌的一種含有多種調控細胞代謝因子的載體，可攜帶多種蛋白質、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)，參與細胞通信、細胞遷移、細胞免疫和腫瘤細胞生長等過程[7]。近年發(fā)現(xiàn)，外泌體具有修復肌肉損傷、軟骨修復、促進骨再生等功能[8-10]。

2 MSC-exo治療慢性創(chuàng)面的機制和應用

MSC-exo可以通過促進血管形成，加速皮膚細胞增殖和遷移，抑制過度炎癥反應和瘢痕形成，促進慢性創(chuàng)面的愈合。

2.1促進血管形成 慢性創(chuàng)面，尤其是糖尿病潰瘍部位常存在微血管病變，出現(xiàn)促血管生成因子的產(chǎn)生減少、內皮祖細胞減少等改變，最終造成血管網(wǎng)絡的功能異常[11]。血管重建和血管生成是傷口愈合的重要表現(xiàn)。利用物理、化學和生物學方法預處理MSC是增強MSC-exo生物學活性，提高其再生修復功效的有效方法。Yu等[12]用瑞伐他汀對人骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)進行預處理，之后分離提取阿托伐他汀預處理的人BMSC外泌體(BMSC-exosomes pretreated with atorvastatin,ATV-exo)。體外實驗顯示，ATV-exo在體外可促進內皮細胞的增殖、遷移和血管內皮生長因子的表達。體內實驗顯示，ATV-exo可加速鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠傷口愈合。結果表明，ATV-exo通過蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)/內皮型一氧化氮合酶信號通路上調miR-211-3p的表達，增強內皮細胞的血管生成，從而加速糖尿病大鼠的創(chuàng)面組織再生。另一方面，可以通過基因工程技術，將所需的目的基因導入MSC，進而獲得攜帶有促進血管形成基因的外泌體。Zhang等[13]通過慢病毒轉染獲得過表達miR-126的BMSC，并從其中提取外泌體。定量反轉錄聚合酶鏈反應顯示，轉染miR-126模擬物的BMSC分泌的外泌體中miR-126表達水平顯著升高。該外泌體在體外可增強人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖、遷移和管狀形成；而體內實驗中可加速小鼠全厚皮膚傷口愈合。攜帶過表達miR-126的BMSC來源的外泌體通過下調磷脂酰肌醇-3-激酶調節(jié)亞基2激活磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信號通路，從而促進HUVECs的血管生成。Liu等[14]經(jīng)慢病毒轉染，提取分離得到過表達促血管生成素-2的人臍帶MSC-exo(human umbilical cord MSC-exo,HucMSC-exo)，其可促進HUVECs的增殖、遷移。將該外泌體注入大鼠深層Ⅱ度皮膚燒傷部位，加速了SD大鼠傷口愈合。水凝膠因具有生物相容性，可作為一種覆蓋傷口的敷料。載有外泌體的水凝膠既能包裹創(chuàng)面，又能緩慢釋放外泌體，協(xié)同促進慢性創(chuàng)面愈合。Nooshabadi等[15]制備了基于殼聚糖的水凝膠，該水凝膠富含來自人子宮內膜干細胞分離的外泌體。研究者使用全厚度切除傷口模型研究由殼聚糖、甘油和外泌體底物組成的水凝膠對傷口的作用，結果顯示，用含有外泌體的殼聚糖支架覆蓋可使近83.6%的傷口閉合，并可明顯促進上皮再生。作為內皮細胞的標記，CD31在水凝膠-外泌體組中明顯升高。殼聚糖-甘油-外泌體水凝膠可用于全厚度皮膚傷口替代和皮膚組織工程，促進傷口血管形成。Yang等[16]發(fā)現(xiàn)，HucMSC-exo結合聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的聚合物(聚醚)水凝膠可以促進糖尿病慢性傷口愈合和皮膚再生。研究者將HucMSC-exo包裹在熱敏Pluronic F127(一種聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物)水凝膠中，應用于全厚度皮膚傷口。與HucMSC-exo、PF-127或對照組治療相比，PF-127和HucMSC-exo聯(lián)合治療可顯著加速創(chuàng)面愈合率，上調血管內皮生長因子的表達，促進肉芽組織再生。

2.2加速皮膚細胞增殖和遷移 成纖維細胞和角質形成細胞遷移和增殖是傷口愈合中重要的步驟之一。慢性非愈合傷口的成纖維細胞和角質形成細胞出現(xiàn)異常的表型，包括增殖減少、早期衰老和細胞因子釋放模式的改變[17]。成纖維細胞和角質形成細胞對于正常的傷口愈合至關重要。在增殖階段，它們分解血纖維蛋白凝塊，產(chǎn)生新的細胞外基質和膠原蛋白，以支持與有效傷口愈合相關的其他細胞，收縮傷口。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞來源的外泌體(adipose stem cell-derived exosomes，ADSC-exo)可以促進HaCaT細胞(人永生化角質形成細胞)增殖和遷移，抑制過氧化氫引起的細胞凋亡，表明ADSC-exo在傷口愈合中具有積極作用，ADSC-exo通過激活Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路促進皮膚傷口愈合。Zhang等[19]構建了HaCaT細胞模型和小鼠傷口愈合模型，以檢測ADSC-exo對傷口愈合的影響。細胞計數(shù)試劑盒-8檢測和劃痕實驗表明，ADSC-exo可促進HaCaT細胞的增殖和遷移。蛋白質印跡法和實時聚合酶鏈反應顯示，ADSC-exo可上調HaCaT細胞中Akt的磷酸化和缺氧誘導因子-1α的表達，抑制Akt磷酸化和降低缺氧誘導因子-1α表達，同時HaCaT細胞的遷移減慢。這些結果表明ADSC-exo可以促進HaCaT細胞增殖和遷移，從而促進傷口愈合。MSC-exo可能通過激活多種細胞信號通路，協(xié)同促進皮膚細胞的增殖和遷移。Gao等[20]將過表達miR-135a的人羊膜MSC-exo(human amniotic MSC-exo，hAMSC-exo)直接注射到傷口邊緣，這促進了大鼠背部全厚皮膚缺陷的傷口愈合和傷口表皮化。體內實驗顯示，hAMSC-exo中的miR-135a通過下調大腫瘤抑制因子2促進人皮膚成纖維細胞的增殖和遷移。此外，敲除miR-135a可有效減少外泌體對細胞遷移的促進作用，這為hAMSC-exo miR-135a傷口愈合提供了依據(jù)。已有報道顯示外泌體中存在長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，表明lncRNA也可能載于MSC-exo中，通過介導細胞與細胞之間的溝通調節(jié)成纖維細胞中的基因表達[21]。Li等[22]發(fā)現(xiàn)將過表達lncRNA H19的MSC-exo注射進傷口邊緣后，小鼠糖尿病足潰瘍痊愈。體內實驗結果顯示，MSC-exo通過將lncRNA H19轉入成纖維細胞，抑制miR-152-3p介導的人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN基因)的抑制作用，繼而激活磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信號通路，調節(jié)成纖維細胞的增殖、遷移和凋亡，最終促進傷口愈合。

2.3抑制過度炎癥反應 單核細胞和巨噬細胞被廣泛認為是早期傷口炎癥反應的原因，但其也有助于血管生成、傷口收縮和組織重塑。巨噬細胞分為2個主要亞群：M1型或促炎巨噬細胞和M2型或抗炎巨噬細胞。然而在糖尿病傷口中，從M1型到M2型的過度受損，這將導致這些傷口不會經(jīng)過正常的愈合階段，而是始終處于永久性的炎癥階段[23]。如何促進傷口巨噬細胞從M1型向M2型過渡，調節(jié)炎癥反應，是促進傷口愈合的關鍵因素。He等[24]發(fā)現(xiàn)MSC-exo中的miR-223通過靶向pknox1基因調節(jié)巨噬細胞極化，進而調控傷口的炎癥環(huán)境，促進皮膚傷口愈合。實驗顯示MSC-exo可促進大鼠皮膚傷口的愈合。流式細胞學分析和紅色熒光標記染料PKH26染色發(fā)現(xiàn)巨噬細胞攝取MSC-exo、CD206、RELM-α(M2型巨噬細胞表面標志物)和白細胞介素-10表達增加，腫瘤壞死因子-α表達下降，提示MSC-exo促進巨噬細胞極化為M2型和抗炎因子的釋放，并減少促炎因子的釋放。Dalirfardouei等[25]發(fā)現(xiàn)經(jīng)血的MSC-exo可促進糖尿病小鼠傷口愈合。在該研究中，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)作為M1型巨噬細胞的一個重要標記，精氨酸酶作為M2型巨噬細胞的重要標記。為了評估巨噬細胞的極化，測定了iNOS和精氨酸酶的活性。在外泌體組中，與細胞組和對照組相比，iNOS活性顯著降低，精氨酸酶活性顯著增高，這說明經(jīng)血的MSC-exo可以促進巨噬細胞從M1型轉化為M2型。經(jīng)藥物或激素預處理的MSC成為研究熱點，經(jīng)過預處理的MSC-exo能抑制促炎因子的表達，增加抗炎因子的表達，調節(jié)慢性創(chuàng)面的炎癥反應，促進慢性創(chuàng)面愈合。Liu 等[26]發(fā)現(xiàn),褪黑激素刺激的MSC-exo(melatonin-stimulated MSC-exo，MT-Exo)可改善糖尿病傷口愈合。將MT-Exo與小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MT-Exo降低了白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α和iNOS的相對基因表達，同時增加抗炎因子白細胞介素-10和Ⅰ型精氨酸酶的相對表達。通過流式細胞學分析發(fā)現(xiàn)，RAW264.7中M2型抗炎巨噬細胞的比例明顯增加。在體內研究中，他們用鏈脲佐菌素建立了大鼠糖尿病傷口模型，MT-Exo通過靶向PTEN/Akt途徑調控巨噬細胞M1型和M2型極化來抑制炎癥反應，促進糖尿病大鼠的傷口愈合、體內血管生成和膠原蛋白合成。Ti等[27]發(fā)現(xiàn)脂多糖預處理后的HucMSC-exo可以將炎癥人單核細胞系轉化為M2型。具體機制可能是經(jīng)脂多糖預處理后的外泌體通過將miR-let-7d轉移到巨噬細胞中，激活Toll樣受體4/核因子κB/信號轉導及轉錄激活因子3/Akt信號通路，繼而減少了大鼠糖尿病傷口的炎癥反應，促進傷口的愈合。

2.4抑制瘢痕形成 肥厚性瘢痕通常發(fā)生于嚴重的燒傷損傷或慢性創(chuàng)傷，是一種纖維增生的皮膚傷口愈合障礙，表現(xiàn)為肌成纖維細胞活性增加，成纖維細胞減少，膠原蛋白異常沉積。肥厚性瘢痕可影響局部美觀，導致功能障礙，極大影響患者的身心健康。因此在慢性創(chuàng)面的治療中，如何避免肥厚性瘢痕的生成是一個難點。Fang等[28]研究表明，臍帶來源的MSC-exo可通過減少肌成纖維細胞在創(chuàng)面的過度累積，從而抑制瘢痕形成。通過高通量轉錄組測序發(fā)現(xiàn)外泌體中富含miR-23a、miR-21等，該外泌體可阻斷轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad2信號通路，減少膠原沉積，抑制肌成纖維細胞的形成，從而抑制小鼠背部皮膚全層創(chuàng)面瘢痕的形成。Li等[29]發(fā)現(xiàn)ADSCs-exo可以抑制肥厚性瘢痕的成纖維細胞纖維化。體外實驗結果顯示，ADSCs-exo中的miR-192-5p靶向白細胞介素-17受體A/Smad信號通路，通過抑制白細胞介素-17受體A的表達和Smad2/3的磷酸化，下調α-平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白Ⅰ型和膠原蛋白Ⅲ型的表達水平，最終起到抑制瘢痕形成的作用。TGF-β是屬于一組調節(jié)細胞生長和分化的TGF-β超家族。TGF-β分子家族在瘢痕形成方面似乎發(fā)揮著核心作用，因為TGF-β1和TGF-β2亞型在瘢痕愈合的成人創(chuàng)傷中過表達，并且在沒有瘢痕愈合的胚胎創(chuàng)傷中缺失或低水平表達。相反，TGF-β3亞型在沒有瘢痕的傷口愈合中高表達。TGF-β3被認為可以預防和減少皮膚瘢痕[30]。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)，人脂肪MSC-exo(human adipose MSC-exo，ASC-Exos)通過調節(jié)膠原蛋白Ⅰ型∶膠原蛋白Ⅲ型、TGF-β3∶TGF-β1和基質金屬蛋白酶3∶組織金屬蛋白酶抑制物1的比例，并通過抑制成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，促進皮膚傷口修復中的細胞外基質重建。具體表現(xiàn)為增加膠原蛋白Ⅲ型的比例，降低膠原蛋白Ⅰ型的比例，增加TGF-β3的比例，降低TGF-β1的比例，ASC-Exos激活了胞外信號調節(jié)激酶/促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，并通過該途徑提高了基質金屬蛋白酶3的水平，最終重塑慢性創(chuàng)面基質，減少瘢痕的形成。MSC-exo通過減少肌成纖維細胞的形成、增加TGF-β3的表達等方式減少慢性創(chuàng)面瘢痕的產(chǎn)生，進而改善患者的生活質量。

3 小 結

MSC-exo參與慢性創(chuàng)面愈合的各個階段。其具體作用是促進血管形成，加速皮膚細胞增殖和遷移，抑制過度炎癥反應，抑制瘢痕形成。這些作用相互協(xié)同，共同促進創(chuàng)面恢復。隨著對外泌體研究的深入，發(fā)現(xiàn)外泌體治療具有安全性高、免疫原性低、可作為藥物載體等優(yōu)勢。然而，外泌體的應用存在無法大規(guī)模制備、最佳提取，以及分離方式尚未確認、作用機制尚未闡明、容易降解等局限性。因此，開發(fā)一種低成本、高產(chǎn)量、高可重復性的外泌體提取方式將有利于外泌體研究。而認識和了解外泌體確切作用，掌握外泌體生成、劑量、體內分布和清除效率可為外泌體進一步臨床應用提供安全性保障。通過藥物、組織工程等預處理方式，提高外泌體的作用效率和靶向運輸能力，降低外泌體的消除速率，從而增加外泌體的治療效果。