microRNA在心搏驟停后腦損傷中的研究進(jìn)展

王靜綜述 謝吐秀，呂菁君審校

microRNA(miRNA)作為一種小的非編碼RNA分子，含18～22個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯和/或降解編碼目標(biāo)蛋白的mRNA來調(diào)控基因表達(dá)[1]。在大腦中，miRNA在神經(jīng)細(xì)胞的分化、胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、樹突和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[2]。有研究表明，心搏驟停(cardiac arrest，CA)期間，大腦缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致缺血性腦損傷，其外周循環(huán)中存在的腦源性miRNA水平反映了血腦屏障受損和神經(jīng)細(xì)胞死亡的程度[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在CA后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，可能成為預(yù)測(cè)和治療CA后腦損傷的潛在靶點(diǎn)。因此，亟需進(jìn)一步探索miRNA在CA后腦損傷中的病理生理特點(diǎn)及分子機(jī)制。本文擬從miRNA概述、CA后腦損傷概述和miRNA在CA后腦損傷中的作用及機(jī)制三方面進(jìn)行綜述，旨在為CA后腦損傷的預(yù)測(cè)和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 microRNA概述

生物體內(nèi)RNA種類繁多，功能復(fù)雜。一般根據(jù)其能否編碼蛋白質(zhì)分為編碼RNA和非編碼RNA，前者主要是指mRNA,后者則包括rRNA、tRNA、miRNA等。在miRNA家族中，其生物發(fā)生存在差異，但均會(huì)經(jīng)歷從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終都會(huì)形成功能性核糖核蛋白復(fù)合物，又稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。在細(xì)胞核中，初級(jí)miRNA (pri-miRNA)以染色體DNA為轉(zhuǎn)錄模板，由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ催化轉(zhuǎn)錄，然后被RNase Ⅲ Drosha和DGCR8切割成雙鏈發(fā)夾狀前體miRNA (pre-miRNA)。隨后，pre-miRNA經(jīng) Exportin5/RanGTP復(fù)合物穿梭到細(xì)胞質(zhì)中，由RNase Ⅲ Dicer進(jìn)一步加工形成成熟的 miRNA雙鏈體[5]。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白結(jié)合，形成RISC，并與靶標(biāo) mRNA 的 5' UTR 相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯或切割mRNA來調(diào)控基因表達(dá)[5]。成熟的細(xì)胞外miRNA可被包裝到外泌體、微粒、脂囊泡中，并與Argonaute-2、nucleophosmin-1蛋白、高密度或低密度脂蛋白結(jié)合，分泌到血液循環(huán)中以保護(hù)其不被核糖核酸酶降解[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一種miRNA可同時(shí)與多個(gè)靶基因的mRNA結(jié)合發(fā)生聯(lián)合作用,參與各種病理生理過程，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、細(xì)胞分化等[3]。 目前常采用高通量miRNA芯片技術(shù)來研究miRNA和疾病的關(guān)系、診斷疾病，甚至將miRNA作為疾病治療靶點(diǎn)以研發(fā)新藥物或材料。

2 CA后腦損傷概述

CA作為全球的一種臨床急癥，具有極高的致死率和致殘率，可導(dǎo)致廣泛的腦損傷和認(rèn)知障礙。由于神經(jīng)元主要依賴于有氧呼吸，因此，在CA自主循環(huán)停止期間大腦更易出現(xiàn)不可逆性損害，從而導(dǎo)致死亡、昏迷、持續(xù)植物人狀態(tài)，以及許多其他神經(jīng)功能障礙。有研究表明，CA后腦血流立即停止可引起大腦原發(fā)性損傷，在再灌注后的數(shù)小時(shí)和數(shù)天可出現(xiàn)更為嚴(yán)重的繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]。雖然CA后腦損傷的機(jī)制尚不完全清楚，但神經(jīng)炎性反應(yīng)已被廣泛認(rèn)為起著重要作用，表現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活、外周免疫和炎性細(xì)胞的涌入及促炎介質(zhì)的釋放，包括細(xì)胞因子和黏附分子[8]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的先天免疫細(xì)胞，可能會(huì)被過度激活，并在這些炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮主動(dòng)作用。除此之外，細(xì)胞焦亡(pyroptosis)、細(xì)胞凋亡、自噬、壞死性凋亡、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等亦被認(rèn)為與CA后腦損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-14]。可見，CA后腦損傷的病理機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，盡管心肺腦復(fù)蘇指南一直處于不斷更新和完善中，但CA后腦損傷患者的預(yù)后仍然不容樂觀。尋找新的CA后腦損傷預(yù)測(cè)指標(biāo)和進(jìn)一步探明其相關(guān)的分子機(jī)制，以更好地治療CA后腦損傷患者迫在眉睫。

3 miRNA在CA后腦損傷中的作用及機(jī)制

3.1 miRNA可作為CA后腦損傷的生物標(biāo)志物 目前CA后的神經(jīng)功能評(píng)估一般是在成功復(fù)蘇后至少72 h，但仍有許多因素會(huì)混淆CA后的神經(jīng)預(yù)后評(píng)估，包括治療性低溫、使用鎮(zhèn)靜劑、神經(jīng)肌肉阻滯劑及全身缺血引起的代謝紊亂[3]。NSE作為腦損傷后釋放到血液中的一種蛋白質(zhì)，一直以來被當(dāng)作CA后的預(yù)后標(biāo)志物，但其本身具有一定的局限性，如敏感度低、容易增加假陽(yáng)性結(jié)果[15]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在病理情況下，miRNA可較蛋白質(zhì)更早地釋放，且其表達(dá)水平可使用定量PCR、微陣列和高通量測(cè)序等輕松檢測(cè)，在預(yù)測(cè)神經(jīng)功能方面具有高特異度和敏感度等優(yōu)點(diǎn)[16]。神經(jīng)功能預(yù)后差的院外CA患者血清miR-122和miR-2顯著上調(diào)，而miR-191-5p呈顯著下調(diào)，可作為CA后腦損傷的預(yù)測(cè)因子[17-18]。Stefanizzi等[19]的研究結(jié)果亦證實(shí)，CA后患者循環(huán)中的腦源性miR-9-3p、miR-124-3p、miR-129-5p的水平與NSE水平、6個(gè)月時(shí)的神經(jīng)功能和存活率顯著相關(guān)。此外，循環(huán)中的miR-574-5p水平與女性CA后的神經(jīng)功能結(jié)果顯著相關(guān)[20]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，前腦缺血后3 h時(shí)，miR-100-5p和miR-125b-5p的表達(dá)在海馬CA1區(qū)呈顯著上調(diào)；在再灌注24 h后，miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-181a-5p、miR-219a-2-3p、miR-23b-3p和miR-338-3p在齒狀回(dentate gyrus，DG)中顯著上調(diào)；在再灌注72 h時(shí)，miR-219a-2-3p在DG中顯著上調(diào)，而miR-329-3p在CA1區(qū)顯著上調(diào)[21]。可見，miRNA有望成為預(yù)測(cè)和治療CA后腦損傷的生物標(biāo)志物。然而，目前尚不清楚CA后釋放到循環(huán)中的大腦特異性miRNA的動(dòng)力學(xué)，以及何時(shí)測(cè)定miRNA可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)神經(jīng)功能預(yù)后。此外，不同樣本來源的miRNA水平與神經(jīng)功能預(yù)后及病死率的關(guān)系需待進(jìn)一步探討。

3.2 miRNA在CA后腦損傷中的調(diào)控機(jī)制 miRNA在調(diào)控CA后腦損傷過程中起著十分重要的作用，尤其是在CA后的神經(jīng)炎性反應(yīng)和神經(jīng)元死亡方面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)控CA后腦損傷的具體機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前主要涉及的是神經(jīng)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，且其相互之間存在串?dāng)_。

3.2.1 miRNA在CA后腦損傷中調(diào)控炎性反應(yīng)：越來越多的研究表明，炎性反應(yīng)是CA誘導(dǎo)的短暫性全身缺血后神經(jīng)功能缺陷的主要致病因素[22]。并且，CA后腦損傷的各個(gè)階段均與炎性反應(yīng)有關(guān)，通?？赏ㄟ^增加炎性因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，啟動(dòng)下游的中樞促炎細(xì)胞因子信號(hào)通路來加重神經(jīng)損傷[23]。近年來的研究表明，miRNA在CA后腦損傷所致的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[22, 24]。Sun等[24]研究表明，CA后大鼠海馬回的miR-155顯著上調(diào)，可顯著增強(qiáng)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，而抑制海馬回miR-155的表達(dá)，可顯著降低上述炎性因子的水平。其可能機(jī)制為miR-155-5p是通過靶向DUSP14，激活NF-κB和MAPKs信號(hào)通路來引發(fā)神經(jīng)元炎性反應(yīng)，繼而加重腦I/R損傷的[25]。此外，在腦I/R損傷過程中，miR-124-5p可直接與CYBB 3'-UTR結(jié)合并負(fù)性調(diào)節(jié)CYBB和NOX2的表達(dá)，且miR-124的過表達(dá)可通過負(fù)性調(diào)控NOX2顯著抑制NF-κB信號(hào)激活和TNF-α、IL-6的產(chǎn)生[26]。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天免疫反應(yīng)的第一線，在CA后幾分鐘即被激活[27]。有研究表明，CA后腦損傷的初始炎性反應(yīng)是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并且腦損傷的早期，小膠質(zhì)細(xì)胞具有抗炎作用(M2表型)，而在腦損傷晚期，具有促炎作用的小膠質(zhì)細(xì)胞(M1表型)會(huì)分泌炎性因子，如TNF-α、Toll樣受體4、基質(zhì)金屬蛋白酶9等，來增加血腦屏障的通透性[9]。目前，小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)機(jī)制已成為腦I/R損傷的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導(dǎo)的腦缺血小鼠模型中，皮質(zhì)、海馬和基底節(jié)區(qū)的miR-424在缺血后8 h時(shí)呈顯著低表達(dá)，且小膠質(zhì)細(xì)胞被激活；而過表達(dá)miR-424可通過將小膠質(zhì)細(xì)胞周期阻滯在G1期來抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，繼而減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)[28]。Ni等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中的患者和動(dòng)物血漿中miR-7c-5p呈顯著低表達(dá)，而miR-7c-5p的過表達(dá)除了可以抑制炎性因子的釋放外，還可通過靶向Caspase3 mRNA的3'-UTR抑制Caspase3的表達(dá)來調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2型轉(zhuǎn)變，繼而抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)。NF-κB作為產(chǎn)生神經(jīng)炎性反應(yīng)的重要因素之一，在腦I/R損傷過程中受到miRNA的調(diào)控，繼而可加重或減輕腦損傷[30]。此外，miR-210可部分通過靶向SIRT1來誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型激活，繼而阻斷NF-κB亞基p65去乙酰化，并激活NF-κB信號(hào)通路，而抑制miR-210的表達(dá)則可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)，顯著減輕腦損傷[31]。除此之外，miR-210還可與TET2結(jié)合，通過促進(jìn)NF-κB亞基p65發(fā)生乙?；?，增強(qiáng)其與小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β啟動(dòng)子的DNA結(jié)合能力，繼而加重神經(jīng)炎性反應(yīng)[32]。盡管目前miRNA調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化的相關(guān)研究主要聚焦于缺血性腦卒中，但可以推測(cè)miRNA亦可調(diào)控CA后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)[24]。并且，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)可能是未來用于治療CA后腦損傷的重要策略之一。

3.2.2 miRNA在CA后腦損傷中調(diào)控氧化應(yīng)激：以活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量產(chǎn)生為特征的氧化應(yīng)激是CA后I/R損傷的主要根源之一[13]。氧化應(yīng)激在整個(gè)CA、心肺復(fù)蘇(CPR)期間都會(huì)出現(xiàn)，尤其是在CA后自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation，ROSC)之后。既往的研究表明，適度的氧化應(yīng)激可保護(hù)機(jī)體，而嚴(yán)重且持續(xù)的氧化應(yīng)激會(huì)破壞機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制，極易對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，尤其是神經(jīng)元。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件作為機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，參與調(diào)控內(nèi)源性抗氧化基因的表達(dá)[33]。有研究表明， ROSC后24 h海馬回的丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性升高，伴有GSK-3β的磷酸化被抑制，Nrf2易位到細(xì)胞核，HO-1的表達(dá)下調(diào)[10]。在許多I/R損傷過程中，miRNA被證明可通過microRNAs靶向Nrf2的3'-UTR或其上游的調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)Nrf2的表達(dá)和激活[34]，但其在CA后腦損傷中的作用及機(jī)制尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CA后大鼠海馬回的miR-155上調(diào)可顯著增強(qiáng)氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-iso PGF2α和蛋白質(zhì)氧化標(biāo)志物8-OHdG的表達(dá)，而給予miR-155抑制劑后可通過抑制海馬回氧化應(yīng)激產(chǎn)物和NADPH氧化酶的表達(dá)來改善神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分和腦水腫[24]。Wang等[35]的長(zhǎng)時(shí)間(60 min)體外循環(huán)大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c的上調(diào)可抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)的表達(dá)，增加丙二醛的表達(dá)，且術(shù)后14 d前庭功能和認(rèn)知功能顯著降低；而給予深低溫(18℃)處理可通過抑制miR-29c的表達(dá)，啟動(dòng)PGC-1α依賴性途徑來減輕長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)停止所致的神經(jīng)損傷[35]?？梢?，CA后腦損傷期間，miRNA表達(dá)失?？烧{(diào)控氧化應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，而通過抑制或增強(qiáng)miRNA的表達(dá)可提供神經(jīng)保護(hù)作用。

3.2.3 miRNA在CA后腦損傷中調(diào)控細(xì)胞凋亡：miRNA已經(jīng)成為腦I/R損傷期間神經(jīng)元存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。越來越多的研究表明，細(xì)胞凋亡是CA后腦損傷過程中神經(jīng)元死亡的主要機(jī)制之一[36]。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，CA后ROSC 24 h時(shí)，miR-26a顯著表達(dá)；而miR-26a的過表達(dá)可直接靶向GSK-3β的3'-UTR，導(dǎo)致β-catenin信號(hào)通路的激活，通過抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，增加神經(jīng)干細(xì)胞存活率來改善CA大鼠的神經(jīng)功能?？梢?，miR-26a可通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞凋亡來減輕CA誘導(dǎo)的腦損傷。Gao等[37]通過體外循環(huán)60 min大鼠模型發(fā)現(xiàn)，miRNA-23a的下調(diào)可促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡，而給予深低溫(18℃)處理可通過顯著抑制海馬回生長(zhǎng)停滯特異性蛋白5的表達(dá)來增強(qiáng)miRNA-23a表達(dá)，繼而降低PTEN和Bcl-2相關(guān)X蛋白的表達(dá)，以及增加Bcl-2的表達(dá)和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B的比率，神經(jīng)元凋亡被抑制，神經(jīng)功能得到了保護(hù)。因此，敲低生長(zhǎng)停滯特異性蛋白5可通過增強(qiáng)miRNA-23a的表達(dá)來抑制神經(jīng)元凋亡，繼而減輕組織學(xué)損傷，并增加海馬體中存活的神經(jīng)元數(shù)量。此外，Pan等[38]的大鼠CA模型表明，miR-126過表達(dá)可顯著下調(diào)大鼠海馬回p38MAPK、JNK和Caspase-3的表達(dá)，并上調(diào)ERK1/2的表達(dá)，通過抑制海馬回神經(jīng)元凋亡來提高大鼠心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能評(píng)分和改善海馬回的病理形態(tài)?？梢姡ㄟ^抑制或過表達(dá)miRNA可調(diào)控CA后神經(jīng)元凋亡，這為治療CA后腦損傷開辟了一條潛在的道路。

多數(shù)研究表明，炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在CA后腦損傷的發(fā)生發(fā)展均起著舉足輕重的作用，它們?cè)谡{(diào)控機(jī)制上并非單獨(dú)發(fā)揮作用，可能存在著相互串?dāng)_[22]。

4 小 結(jié)

綜上所述，miRNA種類繁多，在CA后腦損傷中既可發(fā)揮保護(hù)作用，亦可加重腦損傷，且其調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。目前已有大量研究表明，miRNA可預(yù)測(cè)CA后腦損傷的預(yù)后，且通過靶向miRNA抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)、減少神經(jīng)細(xì)胞死亡、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和再生來減輕腦損傷。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步深入探討miRNA在CA后腦損傷中的調(diào)控作用及機(jī)制，得出更多優(yōu)質(zhì)的miRNA，與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物聯(lián)合作為CA后腦損傷風(fēng)險(xiǎn)分層，預(yù)測(cè)CA早期、中期或長(zhǎng)期預(yù)后和治療效果的工具。此外，還可以進(jìn)一步深入探討在CA后腦損傷過程中，miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及鈣超載等的具體機(jī)制，為更好的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)和治療CA后腦損傷提供理論依據(jù)。