Wnt/β-catenin通路調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和中藥干預(yù)策略及機(jī)制

凌 靜，甄玉花，張明子，杜雪蓮

(深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033)

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是指子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮體以外的部位；子宮腺肌病(亦稱子宮腺肌癥)是指子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層，其特征是異位的內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮肌層彌漫性生長，并伴隨周圍纖維組織增生[1]。郎景和院士強(qiáng)調(diào)把子宮腺肌病作為內(nèi)異癥的一種表型來對待[2]。無論是內(nèi)異癥亦或子宮腺肌病，均為具有生長功能的子宮內(nèi)膜異位他處繼續(xù)生長所致。盡管病因不盡相同，但均受雌激素的調(diào)節(jié)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在二者發(fā)病過程中均扮演了重要角色。Wnt/β-catenin信號通路是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵信號通路。本文就Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控內(nèi)異癥、子宮腺肌病EMT機(jī)制及中藥干預(yù)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 內(nèi)異癥與子宮腺肌病發(fā)病相關(guān)性

內(nèi)異癥與子宮腺肌病臨床上常共存[3]。曾有回顧性研究發(fā)現(xiàn)21.8%內(nèi)異癥患者手術(shù)過程中發(fā)現(xiàn)合并子宮腺肌病[4]。既往曾將子宮腺肌病稱為“內(nèi)在性子宮內(nèi)膜異位癥”，而其他部位的內(nèi)異癥稱為“外在性子宮內(nèi)膜異位癥”。雖然內(nèi)異癥與子宮腺肌病臨床癥狀相似，如疼痛和不孕是二者共有的常見癥狀[5-6]，但是發(fā)病機(jī)制、危險(xiǎn)因素又存在各種差異[7]。由此引發(fā)二者是“兩種不同的疾病”亦或是“同種疾病的不同表型”一直是學(xué)術(shù)圈探討多年的熱點(diǎn)。內(nèi)異癥和子宮腺肌病都是古子宮起源疾病[8]。郎景和院士提出“在位內(nèi)膜決定論”是子宮腺肌病和內(nèi)異癥的共同發(fā)病基礎(chǔ)，即子宮腺肌病和內(nèi)異癥患者存在結(jié)合帶異常和異常子宮收縮[9]，深層原因在于子宮內(nèi)膜異常，包括干細(xì)胞、免疫和激素反應(yīng)異常等[2]。

2 Wnt/β-catenin信號通路與內(nèi)異癥、子宮腺肌病

2.1EMT在內(nèi)異癥、子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制中的作用 “EMT”指固定的具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有侵襲、轉(zhuǎn)移性的間質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[10]。通過EMT過程獲得侵襲及遷移能力的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞是內(nèi)異癥、子宮腺肌病發(fā)病的先決條件[11]。EMT過程的標(biāo)志特征是腺上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的降解和間質(zhì)表型標(biāo)記物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)的升高，并伴隨細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)[12]。早在1983年，就有日本學(xué)者在動物模型中發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病的早期征象是子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞沿血管分支進(jìn)入子宮肌層，然后子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞沿著子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的路徑侵入子宮肌層引起子宮腺肌病[13]。大量研究提示子宮腺肌病病灶、內(nèi)異癥異位內(nèi)膜組織均存在E-cadherin下降[14-16]，伴隨Vimentin升高[17-18]。子宮腺肌病子宮內(nèi)膜-肌層界面(endometrial myometrial interface，EMI)處腺體細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下調(diào)，直接導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞之間以及子宮內(nèi)膜細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附作用降低，從而變得易從在位部位解離，侵入和種植在肌層中[19]。內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜組織中轉(zhuǎn)錄抑制因子Twist蛋白表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與N-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系[20]。過表達(dá)Twist后在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞N-cadherin上調(diào)、E-cadherin下降并伴隨著細(xì)胞遷移和侵襲能力提高，可能與內(nèi)異癥在位及異位內(nèi)膜組織Twist基因啟動子區(qū)域性低甲基化有關(guān)[21]。子宮腺肌病的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中Snail的表達(dá)強(qiáng)度上升，并與E-cadherin表達(dá)強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)，表明子宮腺肌病的發(fā)病原因之一可能是由于轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的高表達(dá)抑制了E-cadherin的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞間的黏附性下降而異位于子宮肌層[22]。

2.2Wnt/β-catenin通路在內(nèi)異癥、子宮腺肌病EMT發(fā)生中的作用 Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞發(fā)生中起到重要作用[23]，也是誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵因素。β-catenin具備雙重生物學(xué)功能，一方面定位于胞膜內(nèi)側(cè)面，與跨膜的E-cadherin介導(dǎo)細(xì)胞的黏附，維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定[24]；另一方面存在于細(xì)胞質(zhì)中，作為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)控分子。當(dāng)信號通路激活，Wnt與卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)rz)受體及共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor related protein，LRP)結(jié)合，F(xiàn)rz作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(Dishevelled protein，Dsh)使其磷酸化，磷酸化的Dsh引起β-catenin-AXIN-APC-GSK3復(fù)合物解體，解體的GSK-3β切斷β-catenin的降解途徑，致β-catenin磷酸化受阻，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與T細(xì)胞/淋巴增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，Tcf/Lef)相互作用，啟動靶基因的表達(dá)[25]。

近年研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路的激活促進(jìn)了內(nèi)異癥及子宮腺肌病EMT的發(fā)生。內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞β-catenin在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于正常對照組，其中在位內(nèi)膜表達(dá)最高[26]。β-catenin在子宮腺肌病在位和異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平均比正常內(nèi)膜表達(dá)水平高，同時伴隨E-cadherin降低，Vimentin升高[27]。內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞β-catenin的表達(dá)明顯高于非內(nèi)異癥患者，阻斷 Wnt/β-catenin信號通路后，其下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的表達(dá)明顯受到抑制[28]。亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子樣蛋白(leucine zipper transcription factor like 1 protein,LZTFL1)、β-catenin蛋白在子宮腺肌病異位內(nèi)膜明顯降低。當(dāng)內(nèi)膜細(xì)胞上LZTFL1蛋白的表達(dá)下調(diào)，E-cadherin不能正常連接細(xì)胞骨架肌動蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞黏附復(fù)合體解體，使胞膜上β-catenin減少，胞漿池β-catenin的水平上升積聚到一定水平，激活Wnt/β-catenin信號通路，具有活性的β-catenin轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合激活靶基因，促使細(xì)胞膜表面介導(dǎo)細(xì)胞黏附的各種蛋白的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，而使細(xì)胞具有活動、遷移能力的相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞骨架崩解，侵襲能力增強(qiáng)[29]。

2.3雌激素介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路調(diào)控EMT 內(nèi)異癥和子宮腺肌病都是公認(rèn)的雌激素依賴性疾病。2010年，臺灣學(xué)者Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者異位病灶Vimentin的表達(dá)明顯增高，E-cadherin的表達(dá)較在位內(nèi)膜明顯降低，且與局部雌二醇(estradiol，E2)水平負(fù)相關(guān)，從而提出雌激素誘導(dǎo)EMT發(fā)生在子宮腺肌病發(fā)病中的重要性。E2作為細(xì)胞外信號，需要與其受體(Estrogen receptor，ER)結(jié)合后方能發(fā)揮進(jìn)一步生物學(xué)作用。子宮腺肌病中的EMT過程具有雌激素依賴性，并與局部E2濃度相關(guān)，而ER抑制劑可以消除這一效應(yīng)[31]。在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，過表達(dá)ERα上調(diào)了EMT水平，而敲除ERα則抑制細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化[32]。

與雌激素相關(guān)的子宮腺肌病EMT過程與激活的Wnt/β-catenin信號通路關(guān)系密切[33]。在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中，雌激素明顯增加去磷酸化β-catenin的表達(dá)，能增加β-catenin入核，與Tcf-3結(jié)合，作用于Snail啟動子上游，正向調(diào)控Snail基因的表達(dá)[34]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雌激素啟動Wnt/β-catenin通路活化是通過其受體ERα實(shí)現(xiàn)的[35]。Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin可與雌激素受體直接通過交叉作用(cross-talk)參與多種生理和病理過程[36]。雌激素通過受體ERα上調(diào)β-catenin表達(dá)，促進(jìn)其入核，激活Wnt通路，繼而β-catenin與核轉(zhuǎn)錄因子Tcf-3/Lef-1結(jié)合，啟動下游靶基因VEGF、MMP9，促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜的黏附、侵襲和血管生成[37]。17β-E2處理后的正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中β-catenin升高，這一效應(yīng)可被雌激素受體拮抗劑阻斷，沉默表達(dá)β-catenin也可拮抗雌激素造成的侵襲能力增加；免疫共沉淀結(jié)果表明，ERα和Lef-1/Tcf-3、β-catenin和Lef-1/Tcf-3存在蛋白相互作用，并且雌激素刺激時間越長，ERα和β-catenin蛋白表達(dá)也越高，相應(yīng)的Lef-1、Tcf-3的蛋白也顯示有所增高[38]。

3 中藥有效調(diào)控Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)EMT是治療內(nèi)異癥及子宮腺肌病的新靶標(biāo)

3.1內(nèi)異癥、子宮腺肌病中醫(yī)藥干預(yù)策略 內(nèi)異癥、子宮腺肌病屬于祖國醫(yī)學(xué)“痛經(jīng)”“癥瘕”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為子宮腺肌病主要病機(jī)為經(jīng)血不循常道，離經(jīng)之血蓄積胞宮而成，即血瘀為本，瘀血阻滯，不通則痛。女子一生以血為本?！毒霸廊珪D人規(guī)》婦人之癥由“瘀血留滯”所致，究其緣由不外乎經(jīng)期產(chǎn)后內(nèi)傷外寒，或情志傷肝、傷脾或積勞羸弱引起氣滯或氣虛而致血行不暢滯留，積累成癥。早在1990年，全國同道通過中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會婦產(chǎn)科專業(yè)委員會第三屆學(xué)術(shù)會議將內(nèi)異癥辨證為“血瘀證”。瘀血阻滯是內(nèi)異癥及子宮腺肌病的主要病機(jī)[39-40]，血瘀體質(zhì)既是子宮腺肌病的危險(xiǎn)體質(zhì)[41]，又是重度內(nèi)異癥痛經(jīng)患者最常見的體質(zhì)[42]。有學(xué)者利用數(shù)據(jù)挖掘的形式分析內(nèi)異癥、子宮腺肌病的中醫(yī)用藥規(guī)律，提示活血化瘀藥為最常用的類型[43-44]。因此在治療時需時刻把握以“血瘀”為核心病機(jī)，以“化瘀消癥、活血止痛”為主要治則。通常內(nèi)異癥和子宮腺肌病患者病程較長，久病耗損正氣，正氣不足是以營血行走遲滯或失去氣之固攝而溢出脈外，而成離經(jīng)之血；氣虛則衛(wèi)氣亦不足，機(jī)體防衛(wèi)功能下降，離經(jīng)瘀血難以清除，積累成癥。瘀血又阻塞經(jīng)脈，使氣行不暢滯澀經(jīng)脈。因此氣虛/氣滯與血瘀之間形成難以斬?cái)嗟膼盒匝h(huán)，病情更加纏綿難愈。因此需在一眾活血之品中酌加益氣扶正/行氣理氣之品以輔佐化瘀消癥之功。

3.2中藥調(diào)控內(nèi)異癥EMT 目前關(guān)于中藥干預(yù)子宮腺肌病EMT機(jī)制的研究尚屬少見。而近年來，關(guān)于中藥調(diào)控內(nèi)異癥EMT的作用主要關(guān)注中藥干預(yù)后腺上皮標(biāo)記物E-cadherin和間質(zhì)表型標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin等表達(dá)的變化，以此評估異位病灶細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變。朱小琳等[45]觀察黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)韓延華教授經(jīng)驗(yàn)方“內(nèi)異止痛方”對內(nèi)異癥大鼠E-cadherin的影響發(fā)現(xiàn)，以“三棱丸”為君藥的“內(nèi)異止痛方”具有上調(diào)E-cadherin，加強(qiáng)細(xì)胞間黏附，維持細(xì)胞間穩(wěn)定性的作用。蘇曉華等[46]發(fā)現(xiàn)天津中醫(yī)藥大學(xué)二附院院內(nèi)中藥制劑婦痛寧(丹參、三棱、鱉甲、海藻、薏苡仁、皂角刺)可提高內(nèi)異癥裸鼠異位病灶E-cadherin轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，降低病灶侵襲轉(zhuǎn)移能力[46]。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院戴德英教授根據(jù)“清熱活血散瘀、理氣止痛”治法組建中藥經(jīng)驗(yàn)方“紅藤方”，方中君藥紅藤清熱解毒、活血止痛，蒲黃化瘀止血，臨床反響較好。在探索其治療機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，“紅藤方”通過減少異位包囊壁中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而縮小異位包塊大小[47]。羅氏內(nèi)異方為嶺南中醫(yī)婦科名家羅元愷教授的經(jīng)驗(yàn)方。此方以益母草等活血化瘀藥為君；蒲黃等行氣活血藥為臣，可有效提高內(nèi)異癥大鼠E-cadherin表達(dá)，降低異位細(xì)胞遷移，減少異位病灶浸潤性生長[48]。

研究發(fā)現(xiàn)中藥單體也能有效地干預(yù)EMT。大黃功在逐瘀痛經(jīng)，其有效成分大黃素作用于異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞48 h后，間質(zhì)表型N-cadherin、Vimentin明顯降低，而上皮表型E-cadherin、keratin明顯提高，這一效應(yīng)具有時間依賴性和濃度依賴性[49]。姜黃素是破血行氣中藥姜黃的有效活性成分，研究顯示姜黃素可降低異位內(nèi)膜中Twist表達(dá)，升高E-cadherin表達(dá)，抑制內(nèi)異癥模型大鼠異位內(nèi)膜的生長[50]。活血化瘀依賴氣機(jī)的充沛且順暢，正如《醫(yī)林改錯》指出的：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”。因此益氣活血化瘀也是治療內(nèi)異癥的常用治法。大補(bǔ)元?dú)獾娜藚⒒钚猿煞秩藚⒖傇碥誖g3通過抑制內(nèi)異癥大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞E-cadherin進(jìn)而抑制血管生成[51]。

3.3中藥調(diào)控內(nèi)異癥、子宮腺肌病Wnt/β-catenin通路 姜心禪等[52]以“緩急止痛、活血化瘀”為治則的加味芍藥甘草湯干預(yù)體外培養(yǎng)子宮腺肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，加味芍藥甘草湯通過抑制β-catenin 在核內(nèi)的表達(dá)，降低EGFR磷酸化水平，促進(jìn)子宮腺肌細(xì)胞凋亡并抑制遷移?；钛鲋兴幍牧硪环N單體成分大黃酸通過增加垂體移植子宮腺肌病模型大鼠子宮病灶間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的降解物，控制β-catenin入核，進(jìn)而抑制EMT相關(guān)蛋白Snail的激活[53]。周華等[54]以“化瘀解痙止痛、活血化瘀消腫、補(bǔ)腎活血助孕”為治療大法組成“消瘤方”，給內(nèi)異癥大鼠連續(xù)灌胃4周后發(fā)現(xiàn)無論是在位內(nèi)膜還是異位內(nèi)膜，細(xì)胞中Wnt7a、β-catenin蛋白均明顯下降，并伴隨著異位病灶的萎縮。黃映紅等[55]以“清濕化瘀、行氣止痛、消癥散結(jié)”為法組成內(nèi)異康復(fù)片干預(yù)內(nèi)異癥大鼠，發(fā)現(xiàn)內(nèi)異康復(fù)片通過抑制Wnt進(jìn)一步抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9以治療內(nèi)異癥。還有學(xué)者深入研究中藥對Wnt/β-catenin通路各環(huán)節(jié)作用靶點(diǎn)。李霞等[56]給內(nèi)異癥患者口服復(fù)方莪術(shù)散3個月后，患者異位內(nèi)膜中Wnt、Frizzled、Dsh、β-catenin蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄均顯著下降，提示以“扶正祛邪、活血化瘀”為主要功效的復(fù)方莪術(shù)散具有抑制Wnt/β-catenin通路的作用。韋佳慧[57]受經(jīng)典名方“佛手散”啟發(fā)，以中藥單體川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素組成“內(nèi)異消”在內(nèi)異癥裸鼠模型中通過Wnt通路上調(diào)GSK3β、磷酸化-β-catenin蛋白的表達(dá)，下調(diào)Wnt3a、磷酸化-GSK3β、β-catenin表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達(dá)以影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低異位病灶體積。

4 總結(jié)及展望

進(jìn)行性加重的痛經(jīng)是內(nèi)異癥和子宮腺肌病的主要癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[58-59]。無論手術(shù)切除還是激素治療都因各自的不良反應(yīng)令患者接受度不高。中醫(yī)藥在緩解或消除痛經(jīng)癥狀，誘導(dǎo)異位病灶萎縮，提高患者生活質(zhì)量和生育能力，減少不良反應(yīng)等方面顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢[60]。研究表明Wnt/β-catenin通路的異常激活在內(nèi)異癥及子宮腺肌病EMT發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[61]。近年來中藥復(fù)方及單體在調(diào)控內(nèi)異癥及子宮腺肌病Wnt/β-catenin通路及EMT取得一些進(jìn)展。通過中藥干預(yù)有效調(diào)控Wnt/β-catenin通路各環(huán)節(jié)作用靶點(diǎn)干預(yù)EMT有望成為治療內(nèi)異癥及子宮腺肌病的新途徑，豐富中醫(yī)藥治療內(nèi)異癥及子宮腺肌病的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。目前有關(guān)中醫(yī)藥調(diào)控內(nèi)異癥及子宮腺肌病Wnt/β-catenin通路的研究仍占少數(shù)，未來研究方向應(yīng)關(guān)注中醫(yī)病-證結(jié)合模型Wnt/β-catenin通路與EMT機(jī)制的轉(zhuǎn)變特點(diǎn)，以及中藥有效成分與通路作用靶點(diǎn)的啟動機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。