反芻動(dòng)物葉酸營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展

■劉 強(qiáng)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是瘤胃微生物和反芻動(dòng)物的 必需營(yíng)養(yǎng)因子，作為一碳單位的載體，參與嘌呤、嘧啶的合成和蛋氨酸的再生，對(duì)DNA 的甲基化、細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等代謝具有重要調(diào)控作用[1]。反芻動(dòng)物瘤胃微生物能合成葉酸，合成量隨日糧精料比例的提高而增加[2]。飼料中的葉酸主要為多聚谷氨酸，在腸道內(nèi)被γ-谷氨酰羧肽酶水解成谷氨酸單體或二谷氨酸后，主要在小腸近端被主動(dòng)吸收[3]。葉酸也能通過(guò)擴(kuò)散作用被動(dòng)吸收，因此，瘤胃壁也能吸收少量的葉酸[3]。在消化道壁和肝臟中，葉酸在二氫葉酸還原酶連續(xù)還原作用下轉(zhuǎn)化為二氫葉酸和四氫葉酸，四氫葉酸是葉酸的輔酶形式，稱為輔酶F（CoF），主要存在于肝腸門脈循環(huán)，經(jīng)膽汁排泄[3]。血液中的葉酸主要以5-甲基四氫葉酸的形式存在。肝臟是葉酸代謝的主要器官，吸收后的葉酸，約50%以多聚谷氨酸的形式貯存在肝臟中[2-3]。反芻動(dòng)物外源甲基供應(yīng)不足，對(duì)葉酸的需求量較高[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，日糧中含有的和瘤胃微生物合成的葉酸不能滿足反芻動(dòng)物和瘤胃微生物的需求[2]，因此，反芻動(dòng)物葉酸營(yíng)養(yǎng)的研究和葉酸在生產(chǎn)中的應(yīng)用成為熱點(diǎn)。

1 葉酸在牛生產(chǎn)中的應(yīng)用

補(bǔ)充葉酸能提高反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能。日糧中的葉酸約97%在瘤胃中被微生物降解或破壞，到達(dá)小腸被吸收的量不到3%[2]，因此，生產(chǎn)中成年反芻動(dòng)物應(yīng)使用包被葉酸添加劑。試驗(yàn)證明，采用pH 敏感材料作為壁材制作的包被葉酸添加劑，能降低葉酸在瘤胃中的釋放率，使添加的葉酸既能滿足瘤胃微生物的需求，又能最大限度達(dá)到小腸[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，10日齡犢牛每周肌肉注射葉酸40 mg，斷奶后日增重、血液葉酸和血紅蛋白濃度、肝臟組織RNA/DNA增加[7]；犢牛或生長(zhǎng)牛日糧中補(bǔ)充葉酸，日增重和飼料利用率提高[6，8]。

補(bǔ)充葉酸有助于改善泌乳牛產(chǎn)奶性能。葉酸影響蛋氨酸、DNA和RNA的合成，參與奶牛繁殖和乳蛋白合成代謝的調(diào)控[1-2]。依據(jù)NRC（2001），體重650 kg、日產(chǎn)乳脂矯正奶35 kg 的泌乳奶牛，葉酸需要量為35 mg/d，但是，瘤胃葉酸合成量只有4 mg/d[2]，需要外源補(bǔ)充才能滿足需求。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加包被葉酸，乳和乳蛋白產(chǎn)量提高，能量平衡改善[4-5]；泌乳后期奶牛每周肌肉注射葉酸160 mg，產(chǎn)奶量提高了14%[9]；經(jīng)產(chǎn)泌乳牛日糧中添加葉酸，奶中粗蛋白和酪蛋白的含量增加，且增加的幅度隨著泌乳期的延長(zhǎng)而提高[10]。

葉酸的添加效果與奶牛的泌乳階段、胎次、日糧中維生素B12及甲基供體（蛋氨酸或甜菜堿）的含量有關(guān)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，日糧中添加包括葉酸的瘤胃保護(hù)B族維生素混合物，泌乳早期奶牛乳、乳脂肪和乳蛋白產(chǎn)量均提高，泌乳中期奶牛乳和乳脂肪產(chǎn)量不變，乳蛋白產(chǎn)量提高[11]。試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的原因，可能與不同階段泌乳牛干物質(zhì)采食量和對(duì)葉酸的需要量不同有關(guān)。相對(duì)于產(chǎn)奶量而言，泌乳早期奶牛的干物質(zhì)采食量較低[11]，而且，因?yàn)樘ケP胎兒復(fù)合體對(duì)葉酸的需求，產(chǎn)前2 周，奶牛血液葉酸水平下降40%，分娩后血液葉酸濃度提高，肝臟中葉酸的濃度在產(chǎn)后2周開(kāi)始升高，8周達(dá)到最高[2,12]。初產(chǎn)牛血液葉酸濃度低于經(jīng)產(chǎn)牛[13-14]，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，日糧中添加葉酸，初產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶量無(wú)顯著變化，經(jīng)產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶量顯著提高[15]。但是，日糧中維生素B12供應(yīng)不足時(shí)，添加葉酸對(duì)經(jīng)產(chǎn)牛305 d產(chǎn)奶量和乳成分產(chǎn)量無(wú)顯著影響[10]；葉酸和維生素B12共同添加，經(jīng)產(chǎn)泌乳牛泌乳早期，產(chǎn)奶量和乳成分產(chǎn)量有提高的趨勢(shì)；單獨(dú)補(bǔ)充葉酸，產(chǎn)奶量和乳成分產(chǎn)量無(wú)顯著變化[16]。另有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉酸和蛋氨酸共同添加，與二者單獨(dú)添加相比，奶牛乳糖含量降低[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能而言，葉酸和甜菜堿之間互作效應(yīng)不顯著；但是，單獨(dú)添加甜菜堿，血液中葉酸濃度降低；與單獨(dú)添加包被葉酸相比，葉酸和甜菜堿共同添加，奶牛血液葉酸濃度提高的幅度更大，試驗(yàn)結(jié)果表明，添加甜菜堿可能提高了日糧中葉酸的利用率[17]。目前，不同生理階段奶牛葉酸的代謝特點(diǎn)和需要量，日糧中維生素B12、蛋氨酸和甜菜堿等含量對(duì)葉酸代謝影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

現(xiàn)有的研究表明，補(bǔ)充葉酸后，牛生產(chǎn)性能提高，與葉酸對(duì)養(yǎng)分利用效率、蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝的調(diào)控有關(guān)[11，17]。

2 葉酸對(duì)養(yǎng)分利用效率的調(diào)控

補(bǔ)充葉酸能提高日糧養(yǎng)分利用率，與葉酸對(duì)牛瘤胃發(fā)酵和養(yǎng)分消化率的促進(jìn)有關(guān)。葉酸是反芻動(dòng)物瘤胃微生物的必需營(yíng)養(yǎng)因子，日糧中的葉酸被還原成二氫葉酸和四氫葉酸，四氫葉酸接受一碳基團(tuán)，以5,10-亞甲基四氫葉酸和5-甲基四氫葉酸的形式參與一碳單位代謝，對(duì)微生物DNA 合成和細(xì)胞增殖起重要作用[1]。早期體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃色瘤胃球菌的生長(zhǎng)需要二氫葉酸、四氫葉酸或5-甲基四氫葉酸，而且這些物質(zhì)不能被葉酸替代[18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，60日齡斷奶犢牛日糧中添加葉酸，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度、纖維類分解酶的活性以及白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量增加[8]。奶?；蚬Ｈ占Z中添加在瘤胃中釋放率為23%的包被葉酸添加劑，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸/丙酸、纖維類分解酶的活性以及總細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)和主要纖維分解菌的數(shù)量增加[6，17，19]；干物質(zhì)、中性洗滌纖維和蛋白質(zhì)瘤胃降解率提高[19]。白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌是反芻動(dòng)物瘤胃中主要的纖維降解菌[2-3]。瘤胃原蟲(chóng)、真菌和纖維降解菌分泌纖維類分解酶，將飼料纖維物質(zhì)降解為乙酸[2-3]。試驗(yàn)結(jié)果表明，瘤胃微生物合成的葉酸不能滿足自身的需求，需要通過(guò)日糧補(bǔ)充；外源補(bǔ)充葉酸能刺激瘤胃纖維類降解菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)飼料養(yǎng)分在瘤胃的降解。但是，關(guān)于瘤胃微生物葉酸營(yíng)養(yǎng)代謝特點(diǎn)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

奶?；蚬Ｈ占Z中添加包被葉酸的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)分全消化道表觀消化率提高[6，17，19]，與養(yǎng)分瘤胃降解率提高的試驗(yàn)結(jié)果一致[19]?；谠囼?yàn)用的包被葉酸添加劑中約67%的葉酸能到達(dá)小腸被吸收，因此，養(yǎng)分在腸道的消化可能因葉酸的添加而提高。葉酸參與DNA的生物合成，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起重要作用[1]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，葉酸是維持小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能完整、胰腺細(xì)胞生長(zhǎng)和胰液分泌的必需營(yíng)養(yǎng)因子[20-21]；日糧葉酸缺乏，鼠胰腺淀粉酶的分泌減少[22]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加葉酸，瘤胃和瘤胃后消化道干物質(zhì)的消化率提高[23]。但是，要明確葉酸對(duì)反芻動(dòng)物腸道發(fā)育、胰腺功能、消化酶活性及養(yǎng)分消化率的影響，還需要進(jìn)一步研究。

3 葉酸對(duì)牛蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控

葉酸參與DNA、RNA 和蛋氨酸合成的營(yíng)養(yǎng)生理功能[1]，以及日糧中添加葉酸后，生長(zhǎng)牛日增重[6，8]、泌乳牛乳和乳蛋白產(chǎn)量提高[4-5]的試驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸參與蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，通過(guò)影響生長(zhǎng)軸激素的分泌、蛋氨酸循環(huán)或作為營(yíng)養(yǎng)因子，葉酸實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞與組織蛋白質(zhì)合成，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能。

葉酸通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）/磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控。細(xì)胞培養(yǎng)研究報(bào)道，補(bǔ)充葉酸，促進(jìn)了C1C12 細(xì)胞的分化，提高了蛋白激酶B1（Akt1）、mTOR 和核糖體S6 激酶（P70S6K）磷酸化水平[24]。犢?；蚬Ｈ占Z中補(bǔ)充葉酸，犢?；蚬Ｑ褐腥~酸、生長(zhǎng)激素、胰島素和IGF-1濃度增加，肝臟組織IGF-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體（IGF-1R）、PI3K、Akt1、mTOR和P70S6K mRNA的表達(dá)量增加[25-27]。IGF-1/PI3K/Akt1/mTOR 是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵信號(hào)通路，IGF-1和IGF-1R結(jié)合，刺激PI3K、Akt1、mTOR 和P70S6K mRNA 的表達(dá)和磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和動(dòng)物生長(zhǎng)[28]。試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的原因，可能與補(bǔ)充葉酸改善了牛瘤胃發(fā)酵和養(yǎng)分利用率有關(guān)。瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度和日糧養(yǎng)分利用率提高可促進(jìn)IGF-1分泌[29-30]。

補(bǔ)充葉酸，一碳單位轉(zhuǎn)移效率可能提高，使更多的蛋氨酸用于蛋白質(zhì)合成[10]。在一碳單位代謝中，亞甲基四氫葉酸還原酶將5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，蛋氨酸合成酶催化同型半胱氨酸接受5-甲基四氫葉酸的甲基重新轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，蛋氨酸合成酶還原酶是蛋氨酸合成酶維持活性所必需的輔助因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，犢牛日糧中添加葉酸，肝臟5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶、蛋氨酸合成酶還原酶和蛋氨酸合成酶mRNA 的表達(dá)量上調(diào)[25]。其他研究發(fā)現(xiàn)，奶牛產(chǎn)犢前3周補(bǔ)充葉酸，泌乳早期產(chǎn)奶量、乳蛋白產(chǎn)量和血液中丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸和總含硫氨基酸的濃度顯著提高[14]；肝臟組織中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶mRNA 的表達(dá)量和磷脂酰膽堿/磷脂酰乙醇胺提高[12]。圍產(chǎn)期奶牛補(bǔ)充葉酸、維生素B12和包被蛋氨酸的3因子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉酸和維生素B12共同補(bǔ)充，促進(jìn)了蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，減少了蛋氨酸氧化，進(jìn)而提高了日糧蛋氨酸用于合成蛋白質(zhì)的效率[16]。另有報(bào)道，單獨(dú)添加包被葉酸或甜菜堿與包被葉酸和甜菜堿共同添加相比，公牛日增重的提高的幅度無(wú)顯著差異[31]。肝臟組織中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的比例可作為衡量甲基轉(zhuǎn)移效率的指標(biāo)；甜菜堿又稱為三甲基甘氨酸，是一碳單位代謝中重要的甲基供體[1，12]。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)充葉酸促進(jìn)牛蛋白質(zhì)合成，可能與甲基利用效率或一碳單位循環(huán)效率的提高有關(guān)。

另外，比較功能基因組研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體α調(diào)控牛乳蛋白的合成[32]。但是，現(xiàn)有的研究結(jié)果還不能明確葉酸對(duì)牛一碳單位代謝和蛋白質(zhì)合成代謝的具體調(diào)控方式與機(jī)制。

4 葉酸對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控的研究

葉酸通過(guò)肝臟激酶B1（LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，犢牛日糧中添加葉酸，肝臟組織LKB1和AMPK mRNA 表達(dá)上調(diào)[25]；公牛日糧中添加包被葉酸，肝臟總脂肪和三酰甘油含量降低，PPARα和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT1）mRNA表達(dá)上調(diào)，SREBP1、脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶α（ACACA）mRNA表達(dá)下調(diào)，且能有效緩解日糧添加棕櫚脂肪粉引起的肝臟脂肪積累[33]。對(duì)模型動(dòng)物鼠的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充葉酸，飼喂高脂日糧鼠的肝臟或HepG2 細(xì)胞腺苷酸（AMP）含量、LKB1 和AMPK磷酸化水平提高，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性和膽固醇水平降低[34]；母代日糧中添加葉酸，采食高脂日糧子代肝臟中PPARα的表達(dá)、腹部脂肪的積累、血液膽固醇和三酰甘油含量降低[35]。AMPK 參與碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝的調(diào)控，可被AMP 和上游基因LKB1激活，促進(jìn)脂肪酸的氧化和能量釋放[34]。AMPK通過(guò)激活其下游基因PPARα和SREBP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪酸代謝，PPARα負(fù)責(zé)上調(diào)參與脂肪酸氧化的酶CPT1的轉(zhuǎn)錄與活性，SREBP1通過(guò)控制脂肪生成酶FAS和ACACA的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)脂肪酸的合成[34-35]。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶是負(fù)責(zé)催化肝臟中膽固醇合成的關(guān)鍵酶[34]?，F(xiàn)有的研究表明，通過(guò)LKB1/AMPK/PPARα/SREBP1 信號(hào)通路，葉酸能抑制肝臟脂肪酸的合成，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化。

5 葉酸與其他養(yǎng)分間互作效應(yīng)的研究

葉酸參與對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝的調(diào)控，與其他B族維生素和微量元素之間存在互作效應(yīng)。維生素B12是蛋氨酸合成酶的組分，5-甲基四氫葉酸在蛋氨酸合成酶的催化下，將甲基傳遞給同型半胱氨酸才能轉(zhuǎn)化為四氫葉酸，接受一碳基團(tuán)，參與一碳單位代謝過(guò)程，維生素B12不足能引起葉酸缺乏，導(dǎo)致5-甲基四氫葉酸積累[1]。反芻動(dòng)物瘤胃微生物能利用日糧中的鈷合成維生素B12[2]。但是，鈷和葉酸共同添加，犢牛日增重提高的幅度顯著低于二者單獨(dú)添加[36]。闡明試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的原因，還需要探究維生素B12、葉酸及二者共同添加對(duì)一碳單位代謝的影響及機(jī)制。另外，泛酸以輔酶A 和?；d體蛋白的形式參與mRNA 的合成與碳水化合物、氨基酸和脂肪酸代謝[1]。葉酸以5,10-亞甲基四氫葉酸、10-甲?；臍淙~酸和5-甲基四氫葉酸的形式參與DNA、RNA 和蛋白質(zhì)的合成，其中，10-甲?；臍淙~酸合成嘌呤的過(guò)程需要泛酸化修飾才能被激活[37]。研究發(fā)現(xiàn)，公牛血液總蛋白濃度，葉酸和泛酸互作效應(yīng)顯著，即血液總蛋白濃度提高的幅度，葉酸和泛酸共同添加顯著高于二者單獨(dú)添加[38]。

葉酸與硒、銅和鋅之間存在互作效應(yīng)，共同參與DNA甲基化和一碳單位代謝的調(diào)控。鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硒缺乏時(shí)，同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽，減輕了葉酸缺乏導(dǎo)致的同型半胱氨酸積累，補(bǔ)充硒，肝臟DNA甲基化水平提高[39]；硒和葉酸共同添加，肝臟中谷胱甘肽還原酶活性降低，蛋白質(zhì)的過(guò)氧化減少[40]。牛試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硒和包被葉酸共同添加，奶牛瘤胃α-淀粉酶活性、總細(xì)菌和白色瘤胃球菌數(shù)量提高的幅度顯著高于二者單獨(dú)添加[41]；但是，公牛全消化道ADF消化率、瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成量、真菌和主要纖維分解菌數(shù)量的提高幅度顯著低于二者單獨(dú)添加[42]。葉酸與銅之間存在互作效應(yīng)。蛋氨酸合成酶為銅依賴酶，銅參與葉酸和同型半胱氨酸代謝的調(diào)控[43]，而且，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶為銅結(jié)合蛋白，催化S-腺苷同型半胱氨酸產(chǎn)生同型半胱氨酸和腺苷酸[44]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，包被葉酸和包被銅共同添加，公牛瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成量的提高幅度顯著低于二者單獨(dú)添加[45]。另有報(bào)道，葉酸及其衍生物能與Zn、Fe 和Cu 等結(jié)合形成不能被吸收的穩(wěn)定螯合物，補(bǔ)充葉酸，人血液Zn 濃度降低[46]。葉酸與各種微量養(yǎng)分之間互作效應(yīng)的研究有助于豐富動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)理論，需進(jìn)一步探究。

6 小結(jié)

綜上，日糧中補(bǔ)充葉酸能促進(jìn)瘤胃纖維類降解菌生長(zhǎng)，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能。葉酸對(duì)一碳單位循環(huán)、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)等代謝具有重要的調(diào)控作用。目前，對(duì)于反芻動(dòng)物葉酸營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究還存在欠缺，今后可以考慮充分利用活體組織采樣和體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)、qPCR 和Western Blot 等方法，解析葉酸對(duì)反芻動(dòng)物一碳單位、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝的影響及調(diào)控機(jī)制，同時(shí)開(kāi)展葉酸與其他微量養(yǎng)分之間互作效應(yīng)的研究。