限制性和功能性氨基酸組合添加對瘤胃發(fā)酵特性的影響

■韋 肖 劉作桂 李 川 李艷嬌 歐陽克蕙 邱清華

（江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，江西農業(yè)大學動物營養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團隊，江西農業(yè)大學動物科學技術學院，江西南昌 330045）

傳統反芻動物營養(yǎng)學認為，瘤胃微生物能將日糧中的蛋白質或非蛋白氮降解合成微生物菌體蛋白，在一般情況下不需要在日糧中額外添加氨基酸就能滿足機體和產出的畜產品對于氨基酸的需求。隨著奶牛產奶性能的提高，奶牛機體代謝強度增加，對氨基酸需求量隨之增加，日糧降解和微生物合成的氨基酸可能無法滿足高產狀態(tài)下的需求量。王洪榮等[1]在體外培養(yǎng)試驗中發(fā)現，氨基酸缺乏會影響瘤胃微生物的生長和繁殖。而將氨基酸作為氮源時，更有利于微生物的生長和微生物蛋白質的合成[2]。因此，理論上可以在高產奶牛日糧中通過補飼氨基酸來優(yōu)化瘤胃發(fā)酵。

蛋氨酸（Met）和賴氨酸（Lys）是反芻動物主要的限制性氨基酸。在以玉米和豆粕為主的常規(guī)日糧中，蛋氨酸是第一限制性氨基酸，但在玉米和玉米副產物比例較高時，賴氨酸是第一限制性氨基酸[3]。在奶牛上的研究發(fā)現，補充賴氨酸和蛋氨酸有利于改善瘤胃健康并提高產奶性能和牛奶品質[4-6]。功能性氨基酸近年來在反芻動物營養(yǎng)研究中受到越來越多的關注。精氨酸（Arg）是尿素、一氧化氮和多胺類物質的合成前體，是動物生長、繁殖和體內穩(wěn)態(tài)代謝途徑中的重要調節(jié)因子[7]。雖然反芻動物體內可以合成精氨酸，但在生長或者高產狀態(tài)下，從頭合成途徑無法滿足精氨酸的需求[8]。Chacher等[9]在體外培養(yǎng)試驗中發(fā)現，與不添加氨基酸組相比，補充精氨酸可以提高發(fā)酵12 h 的pH 以及產氣量、氨態(tài)氮和總揮發(fā)性脂肪酸含量。谷氨酸（Glu）是細胞內最豐富的氨基酸，可以轉化形成其他氨基酸用于維持腸黏膜的完整性，與限制性氨基酸配合使用時，理論上對于蛋白質代謝有疊加效應[10]。然而，Jackeline 等[10]在犢牛代乳料中添加賴氨酸、蛋氨酸和谷氨酸后，并沒有提高犢牛的腸道健康水平。這些結果可能與動物的生理狀態(tài)相關。對于高產奶牛高精料飼喂模式下限制性和功能性氨基酸的組合添加效果，目前尚無報道。

本試驗采用體外發(fā)酵技術探究限制性氨基酸[賴氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）]和功能性氨基酸[精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）]組合添加對瘤胃發(fā)酵特性的影響，以期為高產奶牛日糧的氨基酸優(yōu)化供給提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的氨基酸均購自上海麥克林生化科技有限公司，Lys、Met、Arg和Glu的CAS編號分別為56-87-1、63-68-3、74-79-3和56-86-0，純度均≥99%。

1.2 試驗設計

采用正交設計，將占發(fā)酵底物不同質量比例的Lys（0、0.25%、0.50%）、Met（0、0.075%、0.150%）、Arg（0、0.15%、0.30%）和Glu（0、0.01%、0.02%）組合成9種處理（見表1），Lys和Met添加量的選取參照Hosford等[11]，Arg 和Glu 的添加量分別參照Teixeira 等[8]和Jackeline等[10]的報道。每個處理設置5 個重復，以高產奶牛的日糧為發(fā)酵底物，每個重復添加發(fā)酵底物0.40 g，加入60 mL混合培養(yǎng)液（其中新鮮瘤胃液20 mL，人工唾液40 mL，瘤胃液取自4頭長期飼喂該底物的奶牛）模擬體外瘤胃發(fā)酵，在培養(yǎng)24 h 后終止發(fā)酵，將發(fā)酵液經四層紗布過濾后作為后續(xù)檢測的樣品。體外發(fā)酵具體操作規(guī)程參照之前的研究[12]。發(fā)酵底物組成（干物質基礎）為商業(yè)化精飼料57.94%、進口苜蓿18.54%、進口燕麥2.64%和玉米青貯20.88%，營養(yǎng)水平為粗蛋白16.9%、產奶凈能7.3 MJ/kg、中性洗滌纖維31.0%。

表1 試驗處理正交表L9（34）

1.3 指標檢測

1.3.1 產氣量與有機物消化率

在發(fā)酵后的3、6、9、12、18 h 和24 h 時記錄每個發(fā)酵瓶的氣體產量，各時間段的產氣量之和為24 h的總產氣量。甲烷（CH4）產量采用Moss等[13]的公式估算。

式中：C2——乙酸的濃度（mmol/L）；

C3——丙酸的濃度（mmol/L）；

C4——丁酸的濃度（mmol/L）。

有機物消化率（OMD）采用Menke 等[14]的方法進行估算。

式中：GP24——0.20 g發(fā)酵底物24 h的產氣量（mL）；

CP——底物中的粗蛋白含量（%）；

Ash——底物中的粗灰分含量（%）。

1.3.2 pH

終止發(fā)酵后立即采用便攜式pH 計（雷磁PHBJ-260，上海儀電科學儀器股份有限公司，上海）測定發(fā)酵液的pH，每個重復測定3 次，取其平均值作為該發(fā)酵液的代表值。

1.3.3 氨態(tài)氮（NH3-N）

將四層紗布過濾后的瘤胃液先在4 000 r/min 離心10 min，后取上清液參照Broderick 等[15]描述的苯酚-次氯酸鈉化學比色法進行NH3-N含量測定。

1.3.4 微生物菌體蛋白（MCP）

將樣品2 100 r/min 離心5 min，取上清液在13 000 r/min 再次離心30 min后棄上清液，加入純化水重懸，再以13 000 r/min 離心30 min，棄上清液后加入1%的NaOH 溶液，洗滌3 次后加入NaOH 溶液在100 ℃水浴鍋中水浴10 min，在13 000 r/min 離心40 min 后取上清液參照Makkar 等[16]報道的方法測定MCP含量。

1.3.5 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）

將瘤胃液樣品10 000 r/min 離心15 min 后，取上清液與0.2 倍體積的25%偏磷酸均勻混合，再次10 000 r/min 離心15 min 后取上清液過濾膜后上機。測定的揮發(fā)性脂肪酸包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸。采用的是氣相色譜法，所用儀器為島津GC2014，樣品進樣量為0.4 μL。色譜柱溫控程序如下：初始溫度120 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速度升溫至180 ℃并在180 ℃處保留1 min。整個過程中，分流比設置為40∶1，流速保持為3.0 mL/min。通過氣相色譜儀運行得到色譜圖后，采用峰面積外標法，基于相對保留時間確定各種揮發(fā)性脂肪酸及其對應的含量。

1.4 多項指標綜合指數（MFAEI）

多項指標綜合指數（MFAEI）是每個單項指標綜合指數（SFAEI）相加的總和。

式中：n——時間點數；

A1——對照組各個時間點各指標的數值；

A2——不同處理組各個時間點各指標的數值；

A3——在每個時間點A2總和的平均值。

結合本試驗實際，將n=1 和A3=A2帶入公式，公式可簡化為SFAEI=（A2-A1）/A2，其中A1是未添加組（對照組，添加水平為0）的數值，A2為對應添加水平下的數值。

1.5 統計分析

所有數據采用SPSS 20 軟件進行多因素方差分析，各主效應不同水平之間用Tukey 進行多重比較，規(guī)定P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氨基酸組合添加對產氣量、甲烷產量與有機物消化率的影響（見表2）

由表2可知，4種氨基酸的添加對24 h的總產氣量和有機物消化率均沒有顯著影響（P＞0.05）。與未添加Lys組相比，添加0.25%和0.50%的Lys均顯著提高了甲烷的產氣量（P＜0.05）；添加0.15% Arg的甲烷產量顯著高于0.30% Arg組（P＜0.05），但與不添加Arg組沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2 氨基酸組合添加對pH、MCP 與NH3-N 濃度的影響（見表2）

由表2 可知，4 種氨基酸的添加均會顯著影響發(fā)酵液的pH，其中添加0.25%和0.50%的Lys、0.150%的Met 均會顯著提高發(fā)酵液的pH（P＜0.05），但0.15%的Arg 和0.02%的Glu 會顯著降低發(fā)酵液的pH（P＜0.05）。添加0.25%和0.50%的Lys、0.150%的Met均會顯著降低MCP的濃度（P＜0.05）。添加0.50%的Lys顯著提高了NH3-N的濃度（P＜0.05）。

表2 氨基酸組合添加對產氣量和瘤胃發(fā)酵特性的影響

2.3 氨基酸組合添加對VFA含量的影響（見表3）

由表3可知，添加0.25%的Lys顯著提高了乙酸的濃度，0.50%的Lys、0.075%和0.150%的Met 均顯著降低了丙酸的濃度（P＜0.05）。添加0.01%和0.02%的Glu 均顯著降低了異丁酸的濃度（P＜0.05）。添加0.25%和0.50%的Lys顯著升高了丁酸的濃度，而添加0.02%的Glu 顯著降低了丁酸的濃度（P＜0.05）。添加0.075%和0.150%的Met、0.30%的Arg、0.02%的Glu 均顯著降低了異戊酸的濃度（P＜0.05）。添加0.075%的Met、0.30%的Arg 均顯著降低了戊酸的濃度（P＜0.05）。添加0.25%的Lys顯著提高了總揮發(fā)性脂肪酸的含量（P＜0.05），添加0.075%的Met顯著降低了總揮發(fā)性脂肪酸的含量（P＜0.05）。

表3 氨基酸組合添加對揮發(fā)性脂肪酸含量的影響（mmol/L）

2.4 瘤胃發(fā)酵參數的綜合評定（見表4）

綜合評定參考盧德勛[17]提出的多項指標綜合指數（MFAEI）。由表4 可知，在本試驗中，以不添加氨基酸組作為參照，對產氣量、pH、MCP、NH3-N 和總VFA 含量分別計算單項指標綜合指數（SFAEI），同一添加水平上述指標的SFAEI相加即為MFAEI。對Lys而言，添加0.25%的MFAEI數值大于添加0.50%，且均為正值；對0.075%的Met、0.01%和0.02%的Glu 而言，MFAEI 均為負值；對Arg 而言，0.15%的MFAEI 大于0.30%，且均為正值。

表4 氨基酸組合添加對瘤胃發(fā)酵參數影響的綜合評定

3 討論

產氣量可以用來評價發(fā)酵底物的降解程度，常用來指示飼料原料的消化率[18]。發(fā)酵底物中的酸性洗滌纖維（ADF）含量是影響底物降解率的主要因素，其含量越高，產氣量越低[19]。本試驗氨基酸的添加并沒有改變底物中的ADF含量，因此會出現總產氣量和有機物消化率均不受影響。NH3-N 可以反映日糧蛋白的降解程度，由微生物分解日糧中的氨基酸和多肽產生；同時，瘤胃中的NH3-N 也可用作微生物生長和繁殖的氮源；因此，NH3-N 的濃度是日糧蛋白降解和微生物利用降解蛋白之間的一種動態(tài)平衡表現[12]。本試驗發(fā)現，Lys的添加提高了NH3-N的濃度，并且這種提升作用隨著添加量的增加而加強，這可能是額外添加Lys提高了降解生成的NH3-N含量，而微生物的利用相對恒定，最終使得積累的NH3-N濃度上升。瘤胃MCP是反芻動物重要的蛋白質來源，其產量的高低與微生物組成和活性、日糧中的非纖維性碳水化合物含量以及瘤胃食糜的通過速率相關[20-21]。Lys 和Met 的添加降低了MCP 的產量，并且降低程度隨著添加劑量的增加而增加，這可能是兩者的添加抑制了微生物的活性，使得合成量降低，然而這個猜想需要通過檢測微生物的活性和多樣性來進一步驗證。瘤胃pH的高低影響著瘤胃發(fā)酵效率和發(fā)酵模式[22]。本試驗發(fā)現，Lys和Met的添加提高了瘤胃pH，這是由于氨基酸的添加使得NH3-N的含量增加，進而使得pH上升。

VFA是反芻動物的主要能量利用形式，是微生物降解飼料的終產物，影響著反芻動物的生長性能和產品特性[23]。目前普遍認為，日糧中的結構性碳水化合物含量越高，乙酸的產量就越高；反之，非結構性碳水化合物含量越高，丙酸含量就更高[23]。本試驗發(fā)現，添加0.25%的Lys可顯著提高乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的產量，但繼續(xù)提高添加量時，并沒有顯著提高乙酸的產量，反而降低了丙酸的產量；添加0.075%的Met降低了丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的產量；這些結果可能是由于限制性氨基酸的添加改變了瘤胃的pH 環(huán)境，纖維分解菌和淀粉分解菌的活性受到影響，最終使得瘤胃發(fā)酵效率和發(fā)酵模式發(fā)生改變。由于甲烷產量是與乙酸正相關，而與丙酸負相關，因此會出現添加Lys后甲烷產量增加。瘤胃VFA中的支鏈揮發(fā)性脂肪酸（BCVFA）包括異丁酸和異戊酸，本試驗發(fā)現Glu的添加降低了異丁酸的含量，Met、Arg 和Glu 的添加降低了異戊酸的含量，這可能是高產奶牛日糧的蛋白質含量（16.9%）已經能夠滿足奶牛生長和產奶需求，過多的氨基酸補充會降低BCVFA 的產量[12]。另一種可能的解釋是，瘤胃pH 的提高更有利于纖維分解菌的生存，而纖維分解菌的生長繁殖需要BCVFA 的供給[24]，因此會使得停留在瘤胃中的BCVFA含量減少。

4 結論

①添加0.25%的Lys可顯著提高pH、乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的含量，但同時也會顯著增加甲烷的產量。

②MFAEI 分析表明，在本試驗條件下的高產奶牛日糧中，無需額外添加Met和Glu。