生地黃水提物對(duì)大鼠睡眠的影響及其機(jī)制研究

李堯善，申 旻，王 盼*

1西北大學(xué)化工學(xué)院；2西北大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，西安 710069； 3陜西省太白酒業(yè)有限責(zé)任公司，寶雞 722300

失眠在中醫(yī)領(lǐng)域有多種名稱(chēng)，比如“不寐”“目不瞑”等，一般認(rèn)為是機(jī)體受到外界及自身內(nèi)部多種因素刺激進(jìn)而導(dǎo)致的無(wú)法入睡、晨起困倦等心神不寧的現(xiàn)象。失眠同時(shí)還伴有其他癥狀，比如難以啟動(dòng)和維持睡眠、晨起早醒、難以重新入睡等[1]。目前全球失眠癥的患病率估計(jì)在10%～40%之間，不同程度的失眠都會(huì)對(duì)機(jī)體造成影響，比如短時(shí)間的失眠可使人面容憔悴、精神疲憊，而長(zhǎng)時(shí)間的失眠極易導(dǎo)致焦慮、抑郁等消極情緒，甚至可能引起心理障礙和精神疾病。因此改善睡眠質(zhì)量，保障正常的生理作息規(guī)律，是亟待解決的社會(huì)和健康問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：生地黃(批號(hào)C0402106072，陜西嘉禾生物科技股份有限公司)；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉(批號(hào)P11011、B0500，美國(guó)Sigma公司)；5-HT、GABA、NA、DA和Glu檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20210504、20210509、20210609、20210802、20210504，南京建成生物工程研究所)；梓醇、地黃苷D(批號(hào)SB21678、S38002，北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司)；TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)RA20035，RA20020，RA20607，武漢伊萊特生物科技有限公司)；RNAeasyTM動(dòng)物RNA提取試劑盒、BeyoRTTMII cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR試劑盒(批號(hào)R0024、D7168L-1、D7268M-1，碧云天生物技術(shù)有限公司)。

實(shí)驗(yàn)儀器：ME104E/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Z36-HK型離心機(jī)(美國(guó)賽默飛)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重180～210 g(許可證號(hào)SCXK(陜)2019-001)；SPF級(jí)KM小鼠，購(gòu)自陜西省西安市西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18～22 g(許可證號(hào)SCXK(陜)2018-001)。飼養(yǎng)條件為屏障級(jí)動(dòng)物房(溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%)，12 h照明和12 h黑暗交替模擬正常生長(zhǎng)環(huán)境，自由攝食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求操作，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展經(jīng)過(guò)西北大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NWU-AWC-20210809M)。

1.2 方法

1.2.1 生地黃水提物的制備及分析

取生地黃200 g，搗碎后加10倍水浸泡1 h，再煎煮30 min，過(guò)濾后重復(fù)3次并合并濾液。經(jīng)60 ℃減壓濃縮后經(jīng)噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度140～190 ℃，出風(fēng)溫度75～85 ℃)，干燥后粉碎過(guò)80目篩密封保存，生地黃水提物的得率為20%。生地黃水提物成分分析參照《中國(guó)藥典》(2020版)中地黃的含量測(cè)定及通則0512進(jìn)行[4]，梓醇檢測(cè)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液(體積比1∶9)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；地黃苷D檢測(cè)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液(體積比1∶19)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

1.2.2 生地黃水提物改善大鼠睡眠的評(píng)價(jià)方法

為評(píng)估生地黃水提物改善睡眠的效果，選擇SD雄性大鼠，參照《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》(2022版)中“有助于改善睡眠”的檢驗(yàn)方法設(shè)置三組。每組均設(shè)4個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只動(dòng)物，分別為對(duì)照組、生地黃水提物低劑量組(RR-L，150 mg/kg·BW，生藥量折合人體劑量3.75 g/d)、生地黃水提物中劑量組(RR-M，300 mg/kg·BW，生藥量折合人體劑量7.5 g/d)、生地黃水提物高劑量組(RR-H，600 mg/kg·BW，生藥量折合人體劑量15 g/d)，每天給各劑量組動(dòng)物灌胃給藥一次，對(duì)照組給予等體積的ddH2O灌胃，連續(xù)進(jìn)行30 d并每天記錄大鼠的體重。直接睡眠實(shí)驗(yàn)通過(guò)判斷末次給藥后大鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)的數(shù)量，依據(jù)為當(dāng)大鼠置于背臥位時(shí)，超過(guò)30～60 s不能翻正，即說(shuō)明大鼠翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的試驗(yàn)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定戊巴比妥鈉溶液劑量為50 mg/kg·BW，在末次給藥15 min后，按0.1 mL/10 g·BW腹腔注射戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg·BW，開(kāi)始觀察大鼠是否有翻正反射，當(dāng)翻正反射消失達(dá)1 min為睡眠指標(biāo)，觀察并記錄生地黃水提物能否延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。戊巴比妥鈉閾下劑量的催眠試驗(yàn)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定戊巴比妥鈉的閾下催眠劑量為30 mg/kg·BW。生地黃水提物于末次灌胃15 min后，給大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉閾下催眠劑量(30 mg/kg·BW)，以翻正反射消失達(dá)1 min以上為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄30 min內(nèi)入睡動(dòng)物數(shù)。觀察并記錄規(guī)定時(shí)間內(nèi)入睡的大鼠動(dòng)物只數(shù)。巴比妥鈉的睡眠潛伏期試驗(yàn)是在末次給藥15 min后，大鼠腹腔注射0.1 mL/10g·BW的巴比妥鈉(250 mg/kg·BW)，觀察并記錄大鼠的睡眠潛伏期時(shí)間。

1.2.3 氯苯丙氨酸(PCPA)誘導(dǎo)失眠大鼠模型的建立

將50只SD大鼠分為兩組，模型組(n= 40)腹腔注射PCPA溶液(400 mg/(kg·d))，每天上午九點(diǎn)開(kāi)始注射一次，連續(xù)注射三天。對(duì)照組(n= 10)腹腔注射等體積0.9%的生理鹽水。最后一次注射24 h后，對(duì)大鼠活動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。失眠模型大鼠行為特征包括晝夜節(jié)律喪失、興奮性和攻擊性增強(qiáng)、尿液和糞便增多等現(xiàn)象。此外通過(guò)大鼠眼眶取血后測(cè)定血清中5-HT含量，定量判斷失眠大鼠模型是否成功建立。

1.2.4 生地黃水提物對(duì)PCPA失眠大鼠的治療給藥

將40只建模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組，RR-L組(生地黃水提物150 mg/kg·BW)、RR-M組(生地黃水提物300 mg/kg·BW)、RR-H組(生地黃水提物600 mg/kg·BW)。每天給各劑量組動(dòng)物灌胃給藥一次，連續(xù)給藥7 d，對(duì)照組和模型組給予等體積的0.9%生理鹽水。每天給藥后放回籠內(nèi)并保證籠內(nèi)鼠糧和水。

1.2.5 大鼠下丘腦組織內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的測(cè)定

最后一次給藥后開(kāi)始斷食供水，12 h后10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死，快速剝離腦組織并確定下丘腦位置后取約1 mm深度的下丘腦組織，用已經(jīng)預(yù)冷卻的生理鹽水清洗組織3次，再用干凈的濾紙拭干，加入9倍質(zhì)量的生理鹽水，玻璃勻漿器勻漿(冰水浴條件下)，采用低溫4 ℃方式(5 000 r/min)離心10 min，取上清用于檢測(cè)。嚴(yán)格按照GABA、5-HT、Glu、DA、NA各試劑盒步驟對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)受體mRNA表達(dá)量的測(cè)定

低溫條件下將收集的大鼠下丘腦組織進(jìn)行總RNA的提取。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)GABA的受體GABAAα1和GABAAα2、5-HT的受體5-HT1α和5-HT2α、Glu的受體mGluR1和mGluR2、DA受體D2的mRNA表達(dá)情況，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)受體基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增引物的序列見(jiàn)表1。

表1 大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)受體的引物序列Table 1 Primer sequences for neurotransmitter-associated receptors in the rat hypothalamus

1.2.7 大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量的測(cè)定

最后一次給藥后開(kāi)始斷食供水，12 h后麻醉采血并迅速離心(5 000 r/min，5 min)，收集血清，根據(jù)大鼠TNF-α、IL-1β和IL-10檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的含量。

1.2.8 生地黃水提物的小鼠急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)主要參照GB15193.3-2014的試驗(yàn)方法進(jìn)行[5]。其中，小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)灌胃劑量分別為15 000、30 000 mg/kg·BW(以樣品干重計(jì)，下同)，給藥體積為20 mL/kg體重。

選購(gòu)KM小鼠60只(雄性30只，雌性30只)，體重18～22 g。觀察5 d后，隨機(jī)按體重分成3組，每組各20只，其中雄性(M)10只，雌性(F)10只。3組分別為：急性毒性低劑量組(AT-L-M組和AT-L-F組，15 000 mg/kg·BW，折合人體生藥劑量為75 g/d)，急性毒性高劑量組(AT-H-M組和AT-H-F組，30 000 mg/kg·BW，折合人體生藥劑量為150 g/d)，對(duì)照組(對(duì)照組-M，對(duì)照組-F，給予等體積的ddH2O)，試驗(yàn)周期14 d。每天觀察試驗(yàn)小鼠的表現(xiàn)，在試驗(yàn)周期的0、3、7、14 d，稱(chēng)量小鼠體重，評(píng)價(jià)生地黃水提物對(duì)小鼠體重的影響。在小鼠灌胃給藥后需連續(xù)觀察4 h，注意小鼠的飲食情況等有無(wú)異常，之后每天最少進(jìn)行1次觀察，連續(xù)觀察14 d。試驗(yàn)結(jié)束后觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎等器官的組織、顏色和質(zhì)地有無(wú)異常變化。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett法進(jìn)行多個(gè)劑量組與一個(gè)對(duì)照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差出現(xiàn)不齊現(xiàn)象，則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗(yàn)后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到方差齊性的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Tamhane’s T2檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 生地黃水提物成分分析

生地黃水提物經(jīng)過(guò)干燥處理后得率為20%。將生地黃水提物配置成0.5 g/mL溶液，通過(guò)HPLC-DAD檢測(cè)各成分濃度，其中梓醇和地黃苷D的含量分別為15、12 mg/mL。

2.2 生地黃水提物改善大鼠睡眠的試驗(yàn)評(píng)價(jià)

經(jīng)口灌胃后連續(xù)記錄大鼠的體重，由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，RR-L、RR-M和RR-H三個(gè)給藥組對(duì)大鼠體重?zé)o顯著影響，各組大鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，皮毛有光澤，飲食、活動(dòng)正常，表明不同劑量的生地黃水提物對(duì)大鼠正常生長(zhǎng)無(wú)影響(P>0.05)。

表2 生地黃水提物對(duì)大鼠體重的影響Table 2 Effects of Rehmanniae Radix water extract on body weight in rats

大鼠直接睡眠作用研究試驗(yàn)表明，經(jīng)口灌胃后，對(duì)照組與RR-L、RR-M和RR-H三個(gè)給藥組的大鼠在30 min內(nèi)均沒(méi)有出現(xiàn)進(jìn)入睡眠的現(xiàn)象，說(shuō)明生地黃水提物的各劑量組均對(duì)大鼠無(wú)直接睡眠作用。

根據(jù)圖1A可知，經(jīng)口灌胃給予各劑量組對(duì)應(yīng)藥物30 d后，與對(duì)照組相比，RR-L、RR-M和RR-H三個(gè)給藥組均對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠時(shí)間具有延長(zhǎng)作用，延長(zhǎng)率分別為24.30%、25.19%和20.29%，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可知，各劑量組灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物30 d后，RR-H組睡眠發(fā)生率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明生地黃水提物高劑量組(600 mg/kg·BW)與閾下劑量的戊巴比妥鈉在助眠方面有協(xié)同增效的作用。

表3 生地黃水提物對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠發(fā)生率的作用Table 3 Effects of Rehmanniae Radix water extract on the incidence of sleep in rats induced by subthreshold sodium pentobarbital

巴比妥鈉的睡眠潛伏期試驗(yàn)結(jié)果由圖1B可見(jiàn)，經(jīng)口灌胃給予各劑量組對(duì)應(yīng)藥物30 d后，與對(duì)照組相比，RR-M和RR-H能顯著縮短大鼠睡眠潛伏期(P<0.05)，縮短率分別為41.79%和43.18%。RR-L組大鼠的睡眠潛伏期雖然也比對(duì)照組有所縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 生地黃水提物對(duì)大鼠睡眠時(shí)間及睡眠潛伏期的影響Fig.1 Effects of Rehmanniae Radix water extract on sleep time and sleep latency in rats注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05。

根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》(2022版)中“有助于改善睡眠”的結(jié)果判定，本研究中生地黃水提物各劑量均對(duì)大鼠體重?zé)o直接影響，對(duì)大鼠無(wú)直接睡眠作用，且能夠延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間，增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠的睡眠發(fā)生率，并且生地黃水提物中、高劑量組能顯著縮短大鼠睡眠潛伏期。綜上結(jié)果，可判定生地黃水提物具有有助于改善睡眠的作用。

2.3 失眠大鼠模型的建立

利用PCPA誘導(dǎo)動(dòng)物是國(guó)際公認(rèn)的一種研究失眠機(jī)制模型的方法。如圖2所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中5-HT含量顯著降低，且模型組大鼠集中表現(xiàn)出晝夜節(jié)律消失、興奮性和攻擊性增強(qiáng)、尿液和糞便偏多等現(xiàn)象，說(shuō)明本研究中失眠大鼠的模型已構(gòu)建成功。

2.4 生地黃水提物對(duì)失眠大鼠下丘腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

由表4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠下丘腦中GABA和5-HT含量顯著降低(P<0.01)，而GLu、NA和DA均含量顯著升高(P<0.05)，該結(jié)果符合失眠小鼠相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化趨勢(shì)。

圖2 大鼠血清中5-HT的含量Fig.2 The content of 5-HT in rat serum注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01.

與模型組相比，生地黃水提物各組均能顯著提高大鼠下丘腦中GABA和5-HT的含量，且生地黃水提物高劑量組對(duì)大鼠GABA和5-HT的效果更顯著一些(P<0.01)。Glu和DA含量在各給藥組的含量顯著降低(P<0.05)，而NA含量在各給藥組雖有降低，但是結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 生地黃水提物對(duì)大鼠下丘腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響Table 4 Effects of Rehmanniae Radix water extract on the content of neurotransmitters in hypothalamus of

2.5 生地黃水提物對(duì)大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)受體mRNA表達(dá)的影響

由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的GABA受體GABAAα1和GABAAα2mRNA表達(dá)量、5-HT的受體5-HT1α和5-HT2αmRNA表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，而Glu的受體mGluR1和mGluR1 mRNA表達(dá)量、DA的受體D2mRNA表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。與模型組相比，生地黃水提物各組均能顯著提高GABA受體GABAAα1和GABAAα2、5-HT受體5-HT1α和5-HT2α的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低Glu的受體mGluR1和mGluR2、DA受體D2mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。

2.6 生地黃水提物對(duì)失眠大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量的影響

由表5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α(P<0.01)和IL-1β(P<0.05)含量顯著增加，IL-10含量顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，生地黃水提物各組均能顯著降低TNF-α的含量(P<0.05)，而RR-M組和RR-H組均可以顯著減低IL-1β(P<0.05)和提高IL-10的含量(P<0.05)。

圖3 大鼠下丘腦中各神經(jīng)遞質(zhì)受體的mRNA表達(dá)情況Fig.3 mRNA expression of neurotransmitter receptors in rat hypothalamus注：與對(duì)照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01.

表5 生地黃水提物對(duì)大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量的影響Table 5 Effects of Rehmanniae Radix water extract on the contents of TNF- α,IL-1β and IL-10 in rat

2.7 生地黃水提物對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)

為了評(píng)估生地黃水提物的安全性，對(duì)生地黃水提物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)期間雄(M)、雌性(F)小鼠體重情況如圖4所示。與對(duì)照組的健康小鼠相比，急性毒性低劑量組(AT-L-M組和AT-L-F組)和高劑量組(AT-H-M組和AT-H-F)小鼠在同一時(shí)間段體重差異不顯著(P>0.05)，并且試驗(yàn)組中各小鼠均未出現(xiàn)驚厥不安、腹瀉或者便秘、豎毛等急性不良反應(yīng)，無(wú)動(dòng)物死亡，各劑量組小鼠心、肝、脾、腎等臟器均未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)的異常情況。

3 討論與結(jié)論

目前改善睡眠的實(shí)驗(yàn)研究大多從動(dòng)物行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)等方面開(kāi)展工作。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物行為的藥理學(xué)研究，探討了生地黃對(duì)大鼠直接睡眠、戊巴比妥鈉及閾下劑量所致大鼠睡眠發(fā)生率和時(shí)間、巴比妥鈉所致大鼠睡眠潛伏期的影響。由于藥物對(duì)中樞系統(tǒng)的興奮或抑制可通過(guò)大鼠的行為進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)大鼠的自主活動(dòng)證明了生地黃能夠顯著減少大鼠活動(dòng)，具有明確的改善睡眠效果。此外，生地黃水提物高劑量組的大鼠對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量所致的大鼠睡眠發(fā)生率顯著提高也說(shuō)明生地黃在改善睡眠方面與肝酶的代謝無(wú)關(guān)。小鼠急性毒性試驗(yàn)研究表明當(dāng)生地黃水提物為30 000 mg/kg·BW(折合人體生藥劑量為150 g/d)時(shí)，小鼠各特征指標(biāo)均無(wú)明顯變化，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的藥物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)LD50>15 000 mg/kg劑量時(shí)，即認(rèn)為該物質(zhì)屬于無(wú)毒級(jí)[6]，本試驗(yàn)中最大劑量組已超過(guò)15 000 mg/kg，所以可認(rèn)定生地黃水提物屬于無(wú)毒級(jí)別，具有良好的安全性，機(jī)體能夠長(zhǎng)期服用。

圖4 小鼠的體重變化圖Fig.4 The change of body weight in mice

5-HT、NA和DA是一類(lèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，其中5-HT可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)穩(wěn)態(tài)并參與睡眠過(guò)程的發(fā)生[12]，國(guó)際上廣泛應(yīng)用的PCPA誘導(dǎo)動(dòng)物失眠模型就是根據(jù)PCPA抑制5-HT合成的方法使動(dòng)物出現(xiàn)相應(yīng)失眠癥狀。NA通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元興奮達(dá)到維持覺(jué)醒的目的[15]，DA在睡眠的覺(jué)醒中發(fā)揮重要作用[16]。本研究中這三種神經(jīng)遞質(zhì)在生地黃水提物作用于大鼠時(shí)下丘腦中相關(guān)含量變化如表4所示，與模型組相比，其中給藥組NA含量略有降低，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能受多種因素的共同作用，結(jié)果有待于進(jìn)一步分析。5-HT和DA的含量均有變化，特別是生地黃水提物中、高劑量組有顯著性變化。由于5-HT發(fā)揮作用必須與相應(yīng)受體相結(jié)合，在已知的受體中，與抗失眠研究相關(guān)性最高的是5-HT1α和5-HT2α受體，主要參與睡眠的覺(jué)醒活動(dòng)，其含量多少與他們覺(jué)醒周期的長(zhǎng)短密切相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)給藥組的下丘腦中5-HT1α和5-HT2α受體mRNA表達(dá)量顯著增加，結(jié)合5-HT含量變化，提示生地黃水提物改善睡眠的途徑和5-HT的含量增加，使其受體介導(dǎo)的生理作用發(fā)生變化相關(guān)。由于多巴胺受體D2是維持覺(jué)醒的重要的受體[18]，通過(guò)檢測(cè)給藥之后大鼠多巴胺受體D2的mRNA表達(dá)水平顯著下降，說(shuō)明生地黃水提物能夠從調(diào)節(jié)多巴胺及其受體方面改善大鼠睡眠。

炎癥因子的調(diào)控也能夠影響睡眠-覺(jué)醒過(guò)程的發(fā)生。正常睡眠時(shí)細(xì)胞炎癥因子的分泌具有規(guī)律性，而睡眠障礙會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)的異常。例如長(zhǎng)期慢性睡眠限制導(dǎo)致腦內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β含量的升高，但是過(guò)度的升高也會(huì)損害睡眠，抗炎性細(xì)胞因子IL-10含量顯著降低[19]，而夜間睡眠總時(shí)間減少也可導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)的改變[20]。Porkka等[21]也揭示了睡眠節(jié)律和免疫活動(dòng)之間的關(guān)系，睡眠不足會(huì)導(dǎo)致與免疫相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，并增加促炎因子的產(chǎn)生和釋放。因此炎癥因子的紊亂也是失眠的重要影響因素。本研究中生地黃水提物在改善大鼠睡眠的同時(shí)，細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10均發(fā)生了變化，推測(cè)生地黃水提物改善睡眠的與細(xì)胞炎癥因子的調(diào)節(jié)也密切相關(guān)。Sun等[22]研究雙夏湯的催眠鎮(zhèn)靜作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α和IL-1在失眠大鼠中含量顯著降低，此外5-HT及其代謝物HIAA、受體5-HT1A和5-HT2A在失眠大鼠中含量增加，說(shuō)明5-HT系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)參與其中，并且認(rèn)為PCPA誘導(dǎo)的失眠大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸興奮，這可能是由于5-HT阻滯劑降低了5-HT水平，導(dǎo)致TNF-α大量升高，從而促進(jìn)5-HT的再合成。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量及受體的變化，說(shuō)明生地黃水提物可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞炎癥因子共同改善大鼠睡眠。

綜上所述，本研究在初步判斷生地黃水提物能夠改善大鼠睡眠和安全性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用PCPA失眠大鼠模型探討了生地黃水提物改善睡眠的作用機(jī)制。結(jié)果表明生地黃水提物能顯著改善失眠大鼠下丘腦中GABA、5-HT、Glu和DA神經(jīng)遞質(zhì)的水平和相應(yīng)受體mRNA的表達(dá)，此外細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量也相應(yīng)發(fā)生變化，說(shuō)明生地黃水提物可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞炎癥因子改善大鼠睡眠。關(guān)于生地黃水提物中主要成分的生理功能，以及如何進(jìn)一步改善睡眠的途徑和作用機(jī)制需要未來(lái)開(kāi)展更加深入的研究。