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    基于指紋圖譜結(jié)合多成分定量分析的蟾酥藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

    2022-11-26 02:27:22周成美胡晶紅閆慶康楊東杰張永清
    關(guān)鍵詞:蟾酥蟾蜍指紋

    周成美,胡晶紅,2*,任 鑫,閆慶康,楊東杰,張永清,2

    1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2山東省質(zhì)量控制與中藥全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心,濟(jì)南 250355; 3山東康源堂中藥飲片股份有限公司,濟(jì)寧 277600

    蟾酥作為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥,主要包含生物堿、蟾毒內(nèi)酯類等多種化學(xué)成分[1],發(fā)揮抗腫瘤、抗心肌缺血等藥理活性,但其也有一定毒性,需要嚴(yán)格控制用量[2]。山東作為蟾酥藥材的道地產(chǎn)區(qū),在市場(chǎng)上價(jià)格昂貴,質(zhì)量差異較大,甚至部分藥材具有摻入蟾皮、腺體的現(xiàn)象,且對(duì)蟾酥的采集和初加工環(huán)節(jié)監(jiān)管不夠,缺乏對(duì)源頭藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。近年來(lái),HPLC指紋圖譜和多成分含量測(cè)定多用于中藥質(zhì)量研究,2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈三種成分的總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)不少于7.0%。然而,現(xiàn)存的研究缺乏多指標(biāo)成分和多分析手段系統(tǒng)性評(píng)價(jià)研究,且至今為止文獻(xiàn)報(bào)道蟾酥質(zhì)量評(píng)價(jià)成分不夠全面。本研究在此基礎(chǔ)上新增8種成分,以沙蟾毒精、蟾毒靈等11種主要成分作為評(píng)價(jià)蟾酥質(zhì)量的綜合指標(biāo),通過(guò)指紋圖譜對(duì)40批次蟾酥樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)合相似性分析、聚類分析、主成分分析和偏最小二乘法判別分析結(jié)果對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)[3-9]。

    1 儀器與材料

    Aglient 1260 HPLC色譜儀(美國(guó)Agilent公司);KQ-500DE型超聲儀(昆山市儀器有限公司);萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

    甲醇、乙酸和乙腈為色譜級(jí)(美國(guó)賽默飛公司);純凈水(杭州娃哈哈有限公司)。

    偽異沙蟾毒精(批號(hào)Y18O9Y72597)、日蟾毒它靈(批號(hào)P17O9F72594)、沙蟾毒精(批號(hào)Y03D9Y76566)、蟾蜍它里定(批號(hào)P14J11S118458)、遠(yuǎn)華蟾蜍精(批號(hào)Y13A9Y67875)、華蟾酥毒基(批號(hào)W27M10Z84297)、蟾毒靈(批號(hào)P27F10F81703)、脂蟾毒配基(批號(hào)C30S8G45143)、蟾毒它靈(批號(hào)P28M10F84299)、脂蟾毒精(批號(hào)P14J11S118459)、南美蟾毒精(批號(hào)C25F10G81502),純度均大于98.0%,均購(gòu)于上海源葉生物有限公司。

    40批次蟾酥藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張永清教授鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor和黑框蟾蜍BufomelanostictusSchneider的干燥分泌物,藥材具體信息見(jiàn)表1。

    表1 蟾酥樣品的基本信息Table 1 Sample information of Bufonis Venenum

    續(xù)表1(Continued Tab.1)

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    安捷倫 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3 mm,2.7 μm)色譜柱;流動(dòng)相為0.1%乙酸水(A)-乙腈(B)進(jìn)行梯度洗脫(0~15 min,85%→72% A;15~35 min,72%→71% A;35~40 min,71%→65% A;40~50 min,65%→60% A),柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量5 μL,自動(dòng)進(jìn)樣。

    2.2 供試品溶液的制備

    取40批蟾酥藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.1 g,精密稱定,置于具塞離心管中,加入甲醇10 mL密封,稱重后超聲(40 kHz,100 W,60 ℃)提取60 min,放至室溫后補(bǔ)足失重,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

    2.3 對(duì)照品溶液的制備

    分別精密稱取偽異沙蟾毒精、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、華蟾酥毒基、遠(yuǎn)華蟾蜍精、脂蟾毒配基、蟾毒它靈、脂蟾毒精、日蟾毒它靈、南美蟾毒精、蟾毒靈11種對(duì)照品適量,加甲醇溶解得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液,搖勻即得。

    2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

    2.4.1 精密度試驗(yàn)

    取蟾酥供試液(S4),按“2.1”項(xiàng)確立的色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次,以華蟾酥毒基為參照峰,分別記錄其色譜結(jié)果。結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)峰面積RSD為0.910%~2.230%,相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.002%~0.143%,均小于5%。表明儀器精密度良好。

    2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取蟾酥供試液(S4),按“2.1”項(xiàng)確立的色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣,分別記錄結(jié)果,得到各共有峰相對(duì)峰面積RSD為0.890%~3.905%,相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.014%~0.714%,均小于5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

    取蟾酥樣品6份(S4),分別按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,根據(jù)“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明各共有峰相對(duì)峰面積RSD為1.060%~4.780%,相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.002%~0.174%,均小于5%。表明方法的重復(fù)性良好。

    2.5 指紋圖譜的建立

    2.5.1 樣品指紋圖譜及共有峰指認(rèn)

    取供試液(S1~S40)進(jìn)樣,分別測(cè)得其色譜圖,將結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》,設(shè)置S1為參考圖譜,采用平均數(shù)法以及時(shí)間寬度為0.1進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配分析,得到40批蟾酥指紋圖譜共有模式及對(duì)照譜圖譜(見(jiàn)圖1)。在40批次蟾酥藥材的對(duì)照指紋圖譜中共標(biāo)記21個(gè)共有峰,通過(guò)與混合對(duì)照品圖譜比對(duì)、查閱文獻(xiàn)資料共指認(rèn)出 11個(gè)色譜峰(見(jiàn)圖2)。

    圖1 40批次蟾酥樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig.1 Overlapping HPLC fingerprints of 40 batches of Bufonis Venenum samples

    2.5.2 相似性分析

    采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 版),通過(guò)參照對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)蟾酥指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算,對(duì)樣本的相似性和差異性進(jìn)行分類,用相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)相似度[10,11]。將蟾酥的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)比,相似度在0.779~0.991之間(見(jiàn)表2),表示不同批次蟾酥存在品質(zhì)差異。

    圖2 蟾酥的HPLC對(duì)照指紋圖譜(A)和混合對(duì)照品溶液的HPLC圖(B)Fig.2 HPLC comparison fingerprint (A) and mixed reference substances (B) of Bufonis Venenum注:1-偽異沙蟾毒精;2-日蟾毒它靈;7-沙蟾毒精;8-蟾蜍它里定;14-遠(yuǎn)華蟾蜍精;16-蟾毒它靈;17-脂蟾毒精;18-南美蟾毒精;19-蟾毒靈;20-脂蟾毒配基;21-華蟾酥毒基。Note:1-Bufarenogin;2-Gamabufotalin;7-Arenobufagin;8-Bufotalidin;14-Telocinobufagin;16-Bufotalin;17-Resibufagin;18-Marinobufagin;19-Bufalin;20-Resibufogenin;21-Cinobufagin.

    表2 40批次蟾酥樣品的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 2 Similarity evaluation of 40 batches of Bufonis Venenum samples

    2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

    2.6.1 聚類分析(HCA)

    聚類分析是為了消除藥材數(shù)據(jù)中的不對(duì)稱信息,以劃分重要性為前提,將關(guān)系更接近的研究對(duì)象整合為一類[12],實(shí)質(zhì)是將多維空間中不同位置的樣本,用多種方法測(cè)量樣本之間的距離,建立分類[13,14]。本研究運(yùn)用SIMCA 13.0軟件,以40批藥材的共有峰峰面積為變量進(jìn)行聚類。聚類分析可以將不同批次蟾酥藥材進(jìn)行區(qū)分,結(jié)果如圖3所示,一類包括S35~S40,一類包括S29~S34,其余28批藥材為一類。

    2.6.2 主成分分析(PCA)

    利用SPSS 22.0軟件以蟾酥共有峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo),對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析,以特征值大于1和貢獻(xiàn)率大于85%為標(biāo)準(zhǔn),提取出4個(gè)主成分,其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.122%,表明這4個(gè)主成分包含了21個(gè)共有成分的91.122%的信息,符合主成分分析條件(見(jiàn)表3)。結(jié)果顯示蟾酥主成分1特征值為13.012,方差貢獻(xiàn)率為61.961%,對(duì)應(yīng)的載荷量較大成分有8號(hào)、7號(hào)和5號(hào)色譜峰,表明主成分1受這幾種成分影響較大,為蟾酥藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù);主成分2的特征值為2.921,方差貢獻(xiàn)率為13.912%,15、12和18號(hào)色譜峰載荷量較大,說(shuō)明主成分2受這3個(gè)成分影響較大;主成分3和主成分4的特征值分別為1.662和1.540,方差貢獻(xiàn)率為7.915%和7.334%,說(shuō)明4個(gè)主成分代表了原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息,碎石圖顯示排名前4的成分直線較陡峭(見(jiàn)圖4),有助于解釋變量,能夠綜合蟾酥成分的大部分信息。通過(guò)分析得到40批次蟾酥樣品中21種成分的得分圖(見(jiàn)圖4)和載荷圖(見(jiàn)圖5)。結(jié)合圖4、5來(lái)看可以將40批藥材分為3類,與聚類分析結(jié)果一致。

    圖3 蟾酥樣品的聚類樹(shù)狀圖Fig.3 Custer analysis of Bufonis Venenum samples

    圖4 主成分分析碎石圖Fig.4 PCA scree plot of Bufonis Venenum

    圖5 主成分分析 (PCA) 得分圖Fig.5 PCA score plot of Bufonis Venenum

    表3 蟾酥藥材主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Bufonis Venenum

    2.6.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

    為進(jìn)一步區(qū)分不同采集時(shí)期樣品,本研究采用偏最小二乘法判別分析建立數(shù)據(jù)模型。運(yùn)用SIMCA 13.0軟件對(duì)40批蟾酥21種共有成分含量進(jìn)行模式識(shí)別,將標(biāo)準(zhǔn)化的共有峰峰面積導(dǎo)入系統(tǒng)進(jìn)行PLS-DA。模型驗(yàn)證參數(shù)結(jié)果顯示,解釋率參數(shù)為R2X=0.752,模型區(qū)分參數(shù)為R2Y=0.999,模型預(yù)測(cè)參數(shù)為Q2=0.999,表明建立的模型合理并能做出較好的預(yù)測(cè)。分析得到PLS-DA分析得分圖(見(jiàn)圖6),結(jié)果顯示與主成分分析和聚類分析結(jié)果一致。為確定貢獻(xiàn)程度最大的成分,變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)體現(xiàn)成分對(duì)數(shù)據(jù)模型的整體貢獻(xiàn)程度,值越大表明成分的貢獻(xiàn)越大,一般認(rèn)為VIP>1的化合物發(fā)揮了重要作用[15],通過(guò)VIP圖(見(jiàn)圖7)分析篩選出12個(gè)變量,影響大小依次為峰7、8、5、11、10、6、3、12、20、21、2和16,以上成分也是區(qū)分蟾酥藥材質(zhì)量的重要成分。

    2.7 多成分含量測(cè)定

    2.7.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

    分別取混合對(duì)照品和供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,偽異沙蟾毒精等11種成分與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,拖尾因子在0.95~1.05(見(jiàn)圖1和2)。

    圖6 40批蟾酥藥材偏最小二乘判別分析得分圖Fig.6 PLS-DA score plot for 40 batches of Bufonis Venenum

    圖7 40批蟾酥PLS-DA 模型中11個(gè)色譜峰的VIP圖Fig.7 VIP of 21 chromatographic peaks in PLS-DA model of Bufonis Venenum

    2.7.2 線性關(guān)系考察

    分別精密取適量的“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,按照倍數(shù)稀釋法最終得出11種成分的線性回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear equation and correlation coefficient

    2.7.3 精密度考察

    取蟾酥供試液(S4),按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6 次,計(jì)算11 種成分的峰面積的RSD。結(jié)果偽異沙蟾毒精等11種成分峰面積RSD 分別為0.30%、0.23%、0.22%、0.12%、0.31%、1.28%、0.29%、0.45%、0.24%、0.28%、0.82%,表明儀器精密度良好。

    2.7.4 穩(wěn)定性考察

    取蟾酥供試液(S4),按“2.1”項(xiàng)下方法分別在0、2、4、8、12、24h,計(jì)算11種成分的峰面積的RSD。結(jié)果偽異沙蟾毒精等11種成分峰面積RSD分別為0.58%、0.31%、0.25%、0.12%、0.41%、1.46%、3.34%、0.85%、0.48%、0.30%、0.81%,表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.7.5 重復(fù)性考察

    取蟾酥樣品(S4)6 份,分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,計(jì)算11 種成分含量 RSD。結(jié)果偽異沙蟾毒精等11種成分含量RSD 分別為2.26%、1.32%、1.33%、1.33%、1.43%、1.48%、1.96%、1.78%、1.57%、1.38%、1.10%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.7.6 加樣回收率考察

    取蟾酥樣品(S4)6份,約0.1g,分別按精密加入適量對(duì)照品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表5,結(jié)果表明該方法的回收率良好。

    表5 蟾酥回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 6)Table 5 The results of recovery test of Bufonis Venenum (n = 6)

    續(xù)表5(Continued Tab.5)

    續(xù)表5(Continued Tab.5)

    2.7.7 含量測(cè)定

    精密稱定40批次不同采收期的蟾酥藥材粉末約0.1 g,按“2.2”項(xiàng)下樣品處理方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)中的條件進(jìn)行檢測(cè),采用外標(biāo)法計(jì)算各批次樣品中 11 種化合物的含量百分?jǐn)?shù)(見(jiàn)表6)。對(duì)比不同批次蟾酥各成分的含量百分?jǐn)?shù)結(jié)果可知,11種成分中相差較大的是偽異沙蟾毒精,平均含量百分?jǐn)?shù)為0.063%,且該成分的RSD值大于50%,作者推測(cè)是因?yàn)樵摮煞址迕娣e較小(檢測(cè)限和定量限分別為1.399和2.138 μg/mL),S5批次中該成分濃度低于定量限濃度,不同批次之間含量誤差較大。此外,山東省內(nèi)蟾毒靈等3種藥典規(guī)定成分總含量在7.100%~11.000%之間,均大于規(guī)定的7.0%,符合2020版《中國(guó)藥典》要求。

    表6 40批次蟾酥藥材多成分含量測(cè)定 Table 6 Contend determination results of 40 batches of Bufonis Venenum

    3 討論與結(jié)論

    山東省為蟾酥的道地產(chǎn)區(qū),據(jù)調(diào)查山東省內(nèi)蟾蜍養(yǎng)殖戶總數(shù)多達(dá)127戶,除東營(yíng)市以外各市均有分布。因養(yǎng)殖規(guī)模差異,蟾酥質(zhì)量參差不齊,指紋圖譜與多成分定量分析相結(jié)合能準(zhǔn)確判別出蟾酥樣品之間的質(zhì)量差異,可初步作為考察商品藥材優(yōu)劣的判斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于蟾酥樣品中11種化學(xué)成分建立HPLC指紋圖譜,主要針對(duì)蟾酥藥材中的強(qiáng)心苷蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類成分,現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明這些成分具有抗腫瘤,免疫調(diào)節(jié)活性和衰減癌癥衍生疼痛的功效。

    此外,對(duì)色譜峰進(jìn)行相似性分析,結(jié)果顯示山東省內(nèi)不同批次的蟾酥相似度大于0.900,表明山東省內(nèi)不同批次的蟾酥特征成分相似度良好,但省外6批樣品相似度與其他批次相比差距較大,尤其是湖南和江蘇6批樣品相似度在0.779~0.802之間。

    為進(jìn)一步分析不同批次蟾酥藥材中共有峰的差異,對(duì)40批次蟾酥進(jìn)行聚類、主成分和偏最小二乘法判別分析分析并對(duì)樣本進(jìn)行有效區(qū)分,40批樣品可以分為3類,分類結(jié)果一致,不同批次之間蟾酥的質(zhì)量存在差異,且偏最小二乘法判別分析的VIP分析得到貢獻(xiàn)程度最大的12個(gè)成分包含沙蟾毒精、蟾蜍它里定、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈和蟾毒它靈這6種成分。

    通過(guò)含量測(cè)定不同批次的40批蟾酥藥材,發(fā)現(xiàn)藥典規(guī)定的蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基含量最高的是濟(jì)寧微山的蟾酥,此外所有成分總含量排名最高的樣品為日照莒縣的蟾酥。山東省內(nèi)的蟾酥樣品在藥典規(guī)定三種成分含量之和以及所有測(cè)量成分含量之和兩方面均高于省外蟾酥樣品,且湖南和江蘇的蟾酥樣品不符合藥典規(guī)定,由此結(jié)果可以表明山東蟾酥在質(zhì)量方面有一定的優(yōu)勢(shì)。山東省內(nèi)蟾酥含量分析結(jié)果顯示,濟(jì)寧微山和日照莒縣的蟾酥不僅在主成分分析中得分較高,藥典規(guī)定的蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基含量較高的樣品,且此樣本所含成分總量在全部批次中也是較高的,因此作者認(rèn)為這批樣品蟾酥的綜合質(zhì)量最佳,造成這一結(jié)果可能與這兩地氣候條件和地理位置有關(guān),為該地大力發(fā)展蟾蜍養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

    綜上,本研究不僅建立同時(shí)測(cè)定蟾酥中11種成分指紋圖譜,還與蟾酥質(zhì)量鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)有一定的相關(guān)性,綜合評(píng)價(jià)蟾酥的質(zhì)量,為蟾酥生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在對(duì)蟾蜍的養(yǎng)殖過(guò)程中,應(yīng)充分考慮蟾蜍的生存條件,采用科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制指標(biāo),建立更為合理科學(xué)的馴養(yǎng)基地,提高產(chǎn)地經(jīng)濟(jì)效益。

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