傅里葉變換中紅外光譜結(jié)合偏最小二乘法快速測(cè)定蕨菜總多糖含量

徐惠敏，郝經(jīng)文,3，陳乃富,3*，陳乃東,3*

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230031；2皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院； 3安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，六安 237012

蕨菜來(lái)自于蕨科蕨屬植物蕨Pteridiumaquilinum(L.) Kuhn var.latiusculum(Desv) Underw的幼嫩葉和莖，又名拳頭菜、如意菜、龍爪菜等[1]。因其生長(zhǎng)于山林野地，綠色天然無(wú)污染，加之食用鮮美，口感脆爽，深受人們喜愛[2,3]。蕨菜富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及萜類，黃酮和多糖等多種化學(xué)成分[4-6]。相關(guān)研究表明，多糖類成分具有獨(dú)特的藥理作用，有降血糖、抗氧化、提高機(jī)體免疫力等多種藥用保健功能[7-9]，具有很高的藥用價(jià)值[10,11]。蕨菜總多糖含量是蕨菜質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。傳統(tǒng)測(cè)定蕨菜總多糖含量的方法有蒽酮-硫酸法[12]和苯酚-硫酸法[13]。但該類方法需要消耗大量化學(xué)試劑，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)檢驗(yàn)人員技術(shù)要求高，已無(wú)法滿足蕨菜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中大量原料快速檢測(cè)的需求，因此亟需構(gòu)建一種快速、綠色、操作簡(jiǎn)便的蕨菜總多糖含量測(cè)定方法。

近年來(lái)，運(yùn)用傅里葉變換中紅外光譜(Fourier transform mid infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法構(gòu)建植物中化合物含量快速預(yù)測(cè)模型的方式，在相關(guān)成分無(wú)損定量分析方面已有應(yīng)用[14-20]。但尚未見通過(guò)該技術(shù)對(duì)蕨菜中總多糖進(jìn)行定量分析的報(bào)道。

有鑒于此，本研究采用傅里葉變換中紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，考察不同光譜預(yù)處理方式以及選擇不同的特征波段對(duì)其定量分析的影響，建立快速預(yù)測(cè)蕨菜總多糖含量模型，為蕨菜多糖含量的快速檢測(cè)提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蕨菜樣品采自2021年2月至2021年6月，分別從安徽霍山、金寨、岳西，共收集140份，經(jīng)皖西學(xué)院陳乃富教授鑒定為蕨(Pteridiumaquilinum(L.) Kuhn var.latiusculum(Desv) Underw)幼嫩葉和莖。將蕨菜樣品從S1到S140進(jìn)行編號(hào)。

將新鮮蕨菜60 ℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目藥篩(粒徑為0.2 mm)，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

傅里葉變換中紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific Nicolet iS50 FT-IR Spectrometer)配備金剛石單反射ATR附件的樣品池采集及分析軟件TQ-Analyst 9.0；YGH-500S/BS型遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；AE124型分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；HH-M6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；AQ-180E型多用途磨粉機(jī)(慈溪市耐歐電器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 ATR-FTIR光譜采集

傅里葉變換中紅外光譜儀開機(jī)預(yù)熱30 min，將蕨菜粉末樣品放置于光譜儀配備的金剛石單反射ATR附件的樣品池上，厚度約0.5 cm。將軟件設(shè)置為衰減全反射模式，傅里葉變換中紅外光譜儀的測(cè)定范圍4 000～600 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為4.0 cm-1，吸收光譜用log(1/R)表示，在每個(gè)樣品采集前，以空氣做參照，消除背景，每個(gè)樣品測(cè)試6次，獲得一份樣品6個(gè)中紅外原始光譜，并將該樣品6個(gè)原始光譜進(jìn)行計(jì)算獲得其平均光譜用于后面建模分析。

1.3.2 蕨菜總多糖含量的測(cè)定

精密稱取蕨菜干粉2.0 g，置于50 mL圓底燒瓶中，以30 mL蒸餾水(g∶mL，1∶15)90 ℃回流提取3 h，重復(fù)3次，過(guò)濾，合并濾液于100 mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，得蕨菜總多糖提取液，備用。每個(gè)樣品平行3份。

精密移取上述蕨菜總多糖提取液樣品1.0 mL，置10 mL具塞刻度試管中，冰水浴下緩慢精密加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，搖勻，冷卻加蓋試管塞后，置于沸水浴中加熱10 min ，取出后迅速冰水浴冷卻10 min，采用紫外分光光度法于621 nm下測(cè)其吸光度值(A)。

以葡萄糖為對(duì)照品制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取經(jīng)105 ℃干燥恒重的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水溶解使成0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密移取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于具塞刻度試管中，分別加蒸餾水至1.0 mL并搖勻，在冰水浴中緩慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，搖勻，放至室溫后蓋口加蓋，置沸水浴中加熱10 min后取出，迅速冰水浴中冷卻10 min，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL管為空白，于621 nm下測(cè)吸光度值，得回歸曲線：A=50.029C-0.003 5，R2=0.999(C為試管中葡萄糖濃度，mg/mL)。

1.3.3 定量模型的建立

對(duì)所述同一蕨菜樣品采集的6次中紅外光譜原始譜圖進(jìn)行基線校正和平均譜圖計(jì)算，獲得其平均譜消除因人工取樣誤差導(dǎo)致的譜圖，再將平均譜移動(dòng)平均15點(diǎn)平滑法消除檢測(cè)環(huán)境導(dǎo)致的光譜噪聲。使用TQ-Analyst 9.0軟件中紅外定量分析軟件包，選用偏最小二乘法(PLS)，構(gòu)建蕨菜總多糖含量原始定量分析模型。定量分析模型采用外部驗(yàn)證對(duì)模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證，使用TQ-Analyst 9.0軟件設(shè)定驗(yàn)證樣本數(shù)量為校正樣本數(shù)量的1/2，其中校正集樣品80份，檢驗(yàn)集樣品40份，其余20份樣品用于完全外部驗(yàn)證。

1.3.4 定量模型的優(yōu)化

1.3.4.1 光譜預(yù)處理方法的確定

在原始光譜數(shù)據(jù)信息中通常包括了因樣品粉碎的粒度、樣品的顏色、儀器狀態(tài)等帶來(lái)的基線漂移，噪音數(shù)據(jù)。在紅外建模分析中，常采用光譜預(yù)處理的方法，減少噪音波段對(duì)模型準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性影響，使所建立的模型更準(zhǔn)確、可靠。本實(shí)驗(yàn)采用多元散射校正法(multiplicative signal correction，MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法(standard normal variate，SNV)、一階導(dǎo)數(shù)法(first derivative，F(xiàn)D)、二階導(dǎo)數(shù)法(second derivative)、多元散射校正+一階導(dǎo)數(shù)法(MSC+FD)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換+一階導(dǎo)數(shù)法(SNV+FD)、多元散射校正+二階導(dǎo)數(shù)法(MSC+SD)以及標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換+二階導(dǎo)數(shù)法(SNV+SD)共8種光譜預(yù)處理方法，結(jié)合偏最小二乘算法(PLS)，以建立定量分析模型中R2值和校正集均方根誤差值(root mean square error calibration，RMSEC)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行預(yù)處理方法的篩選。

脫貧攻堅(jiān)是全面建成小康社會(huì)、實(shí)現(xiàn)第一個(gè)百年奮斗目標(biāo)最艱巨的任務(wù)。黨的十八大以來(lái)，以習(xí)近平同志為核心的黨中央把脫貧攻堅(jiān)擺在治國(guó)理政突出位置，作出一系列重大部署和安排，脫貧攻堅(jiān)力度之大、規(guī)模之廣、影響之深，前所未有，取得了決定性進(jìn)展，顯著改善了貧困地區(qū)和貧困群眾生產(chǎn)生活條件，譜寫了人類反貧困歷史新篇章。今年8月，中共中央黨史和文獻(xiàn)研究院會(huì)同國(guó)務(wù)院扶貧辦編寫的《習(xí)近平扶貧論述摘編》（以下簡(jiǎn)稱《摘編》）一書由中央文獻(xiàn)出版社出版，在全國(guó)發(fā)行。

1.3.4.2 波數(shù)的選擇

比較了全部波數(shù)、TQ Analyst-9中紅外定量分析軟件包推薦波數(shù)、多糖特征波數(shù)和多糖特征波數(shù)組合四種不同的波數(shù)選擇方法，選擇與蕨菜總多糖組分相關(guān)且建立的定量模型準(zhǔn)確度較高、穩(wěn)定性較好的最佳波數(shù)范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕨菜總多糖含量測(cè)定結(jié)果

采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定140份蕨菜樣本的總多糖含量。蕨菜總多糖含量范圍：4.110%～7.903%，其含量的分布范圍廣，有較強(qiáng)代表性，可滿足定量模型要求樣本含量分布要求，同時(shí)使用TQ-analyst 9.0軟件設(shè)定80份校正集樣品多糖含量范圍是4.110%～7.903%，40份檢驗(yàn)集樣品的多糖范圍是4.505%～7.634%，且檢驗(yàn)集樣品多糖含量在校正集樣品多糖含量范圍內(nèi)，該檢驗(yàn)集樣品可使用校正集模型進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品集中蕨菜總多糖含量Table 1 The total polysaccharide content of P.aquilinum samples used in the dataset

2.2 原始光譜分析

用傅里葉變換中紅外光譜儀采集了140份樣本原始光譜，如圖1所示，在4 000～800 cm-1譜區(qū)內(nèi)，蕨菜樣品中紅外全反射光譜較光滑，光譜曲線走向基本一致，但不同樣本的光譜曲線又略有不同，說(shuō)明各樣本化學(xué)成分有差異，為蕨菜總多糖含量的定量分析提供光譜信息基礎(chǔ)。

從原始光譜圖中分析，在4 000～800 cm-1波長(zhǎng)

范圍內(nèi)，蕨菜多糖中存在大量-CH(3 300～2 700、1 500～1 300 cm-1)、-OH(4 000～3 000 cm-1)、-C-C-和-C-O-(1 300～1 000 cm-1)的基團(tuán)，有強(qiáng)烈的光譜吸收，但該譜區(qū)包含環(huán)境空氣中CO2和水分的干擾，蕨菜樣品原始光譜圖有波動(dòng)，為提高所構(gòu)建定量模型性能，需選擇合適的光譜預(yù)處理方法，提高預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

圖1 蕨菜樣品的中紅外原始光譜Fig.1 The raw FTIR spectra of P.aquilinum samples

2.3 光譜預(yù)處理方法的選擇

通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，可減少噪音波段的影響，提高定量模型的準(zhǔn)確度。參考相關(guān)文獻(xiàn)做法[21-24]，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇8種光譜預(yù)處理方法：MSC、SNV、FD、SD、MSC+FD、SNV+FD、MSC+SD、SNV+SD。比較不同預(yù)處理方法PLS定量模型校正集的R2值和RMSEC，且R2值越接近于1，RMSEC值越小為最佳預(yù)處理方法，其結(jié)果見表2，采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法作為光譜預(yù)處理方法時(shí)，具有較高的R2值0.848 9、較小的RMSEC值為0.547，且采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法預(yù)處理后的蕨菜樣品近紅外光譜如圖2所示，其消除因樣品樣品粒度、樣品顏色、儀器狀態(tài)等引起的噪音，光譜較原始光譜更光滑，所構(gòu)建的定量分析模型更穩(wěn)定。

表2 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)模型的影響Table 2 Effect of different pretreatments on the parameter of model

圖2 蕨菜樣品的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法處理光譜圖Fig.2 The standard normal variate spectra of P.aquilinum samples

2.4 主因子數(shù)的選擇

主因子數(shù)的選擇對(duì)定量分析模型的預(yù)測(cè)效果有較大影響，主因子數(shù)選擇較少時(shí)，所檢測(cè)化合物的光譜信息難以完全表達(dá)，導(dǎo)致定量模型欠擬合，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度下降；但主因子數(shù)選擇過(guò)多，又會(huì)導(dǎo)致模型出現(xiàn)過(guò)度擬合，導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力下降，使用完全外部驗(yàn)證時(shí)，預(yù)測(cè)結(jié)果誤差較大。本研究考察不同主因子數(shù)，其范圍從1到20時(shí)對(duì)模型的影響，模型交互檢驗(yàn)值(root mean square error of cross-validation，RMSECV)結(jié)果如圖3所示，RMSECV值越小模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)，主因子數(shù)<5時(shí)，模型的預(yù)型能力在不斷增加，當(dāng)主因子數(shù)為5時(shí)，RMSECV值為0.549，隨著主因子數(shù)的繼續(xù)增加，RMSECV值雖降低，但其變化程度減少，模型的預(yù)測(cè)能力下降，故選擇最佳主因子數(shù)為5。

圖3 不同主因子數(shù)對(duì)模型的影響Fig.3 Number of PLS factors versus the parameter of model

2.5 建模波段的選擇

在中紅外光譜定量模型中，存在一些高信噪比但光譜強(qiáng)度較低，或與化學(xué)特征相關(guān)性較弱的光譜區(qū)域，對(duì)多糖含量預(yù)測(cè)模型沒有太大貢獻(xiàn)，需從全譜中剔除，以提高模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。結(jié)合模型內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)與多糖在FTIR中的吸收波段選擇建模區(qū)間。對(duì)蕨菜樣品的中紅外光譜信號(hào)(圖1)分為以下幾類：1 750～1 600 cm-1為羰基C=O的伸縮振動(dòng)，1 350～1 290 cm-1波段為C-O伸縮振動(dòng)；1 500～1 400 cm-1波段為烷烴C-H伸縮振動(dòng)；1 280～1 200 cm-1波段是-OH的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 060～970 cm-1波段為是-OH的伸縮振動(dòng)；1 160～1 070 cm-1波段為是C-O-C伸縮振動(dòng)；930～800 cm-1波段為C-H的面外振動(dòng)[25-27]。根據(jù)以上多糖特征FTIR特征吸收光譜，比較了10種建模波長(zhǎng)選擇方法，結(jié)果見表3。以R2和RMSEC為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比不同波長(zhǎng)范圍模型，確定適合蕨菜多糖含量預(yù)測(cè)模型的最佳波長(zhǎng)，結(jié)果表明，采用多糖類化合物6種特征波數(shù)組合：1 750～1 600、1 500～1 400、1 350～1 290、1 160～1 070、1 060～970、930～800 cm-1，獲得較高的R2值0.930 8，最小的RMSEC值0.374%，因此選擇此波段組合為預(yù)測(cè)蕨菜總多糖模型的最佳建模波段。

表3 光譜范圍對(duì)偏最小二乘法校正模型性能的影響Table 3 Effect of different pretreatments on the parameter of model

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.6 建立FTIR光譜蕨菜中總多糖含量預(yù)測(cè)模型

利用TQ-Analyst 9.0分析軟件，通過(guò)偏最小二乘方法建立80份校正集蕨菜樣品的光譜圖特征波長(zhǎng)與總多糖含量之間的定量模型，并利用該定量模型對(duì)40份檢驗(yàn)集蕨菜樣品的總多糖含量進(jìn)行驗(yàn)證，將蕨菜樣品的 FTIR 數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，選擇標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法對(duì)光譜預(yù)處理，選擇1 750～1 600、1 500～1 400、1 350～1 290、1 160～1 070、1 060～970、930～800 cm-1為最佳建模波段。蕨菜總多糖含量的FTIR預(yù)測(cè)值與真實(shí)值建模結(jié)果如圖4所示，獲得校正集的相關(guān)系數(shù)為0.930 8，均方根誤差0.374%，檢驗(yàn)集的相關(guān)系數(shù)為0.914 5，均方根誤差為0.418%，說(shuō)明該定量模型擬合度較好，且模型預(yù)測(cè)性能較好。

圖4 蕨菜總多糖含量的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的相關(guān)性 Fig.4 Relationship between actual and predictive values of the total polysaccharides content of P.aquilinum samples

2.7 模型的外部驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

為驗(yàn)證所建模型的預(yù)測(cè)精度用優(yōu)化后的模型對(duì)未參與建模的樣品進(jìn)行測(cè)定。故使用20份蕨菜樣品進(jìn)行完全外部檢驗(yàn)，結(jié)果見表4，其20份蕨菜樣品總多糖含量預(yù)測(cè)誤差僅為：-0.35%～0.31%，相對(duì)誤差值為：-0.83%～5.24%，以上數(shù)據(jù)可以說(shuō)明所建模型的預(yù)測(cè)能力較高。

表4 完全外部檢驗(yàn)集樣品真實(shí)值與FTIR預(yù)測(cè)值比較分析Table 4 Comparison between analytical and FTIR predictive values of validation samples

續(xù)表4(Continued Tab.4)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采集蕨菜粉末的傅里葉變換中紅外光譜，建立偏最小二乘法模型對(duì)蕨菜總多糖含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。完全外部樣品檢驗(yàn)時(shí)，蕨菜總多糖含量預(yù)測(cè)誤差僅為：-0.35%～0.31%。該模型預(yù)測(cè)效果良好，與傳統(tǒng)多糖含量測(cè)定方法相比，該方法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、操作快速便捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有較好的實(shí)用性，可用于蕨菜總多糖含量快速測(cè)定，能滿足蕨菜產(chǎn)業(yè)化需求有利于在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，同時(shí)可為其他植物中多糖含量測(cè)定方法提供參考。