免疫膠體金技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

況兆忠

（天津市濱海新區(qū)塘沽婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300451）

免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICG）是以膠體金為示蹤標(biāo)志物的免疫標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)是將示蹤物放于硝酸纖維素膜載體中，借助濾膜微孔的濾過特性，促使被標(biāo)記抗原或抗體與特異性配體相結(jié)合，進(jìn)而獲得相應(yīng)的陽性信號(hào)[1]。目前，免疫膠體金技術(shù)已從傳統(tǒng)的定性檢測(cè)發(fā)展至定量、半定量檢測(cè)，其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)顯著，適用范圍廣，可有效提高部分病原體的檢出效率，為臨床疾病的診治提供更為便捷、有效的參考依據(jù)[2，3]。自1971 年Faulk與Taytor 將膠體金引入免疫化學(xué)以來，免疫膠體金技術(shù)已逐漸成為繼熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射標(biāo)記之后的又一重要免疫標(biāo)記技術(shù)[4]。本文現(xiàn)就免疫膠體金技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究做如下綜述，旨在闡述該技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展進(jìn)程。

1 免疫膠體金技術(shù)的基本原理

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）還原析出的金顆粒，其還原劑包括白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，在靜電作用下可形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金[5]。膠體金標(biāo)記技術(shù)（immunogold labeling technique）則是利用其表面負(fù)電荷吸引蛋白質(zhì)正電荷基團(tuán)的吸附包被過程，該過程實(shí)質(zhì)為靜電結(jié)合，不影響蛋白質(zhì)的生物特性，且吸附能力強(qiáng)，可與葡萄球菌A蛋白、糖蛋白、免疫球蛋白、酶、抗生素、激素等多種非共價(jià)結(jié)合，在檢驗(yàn)檢疫及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均具有重要作用[6，7]。此外，免疫膠體金顆粒具有較高的電子密度，于顯微鏡下金標(biāo)蛋白結(jié)合處可見黑褐色顆粒，當(dāng)此類標(biāo)記物于配體處大量聚集，即可肉眼觀察到紅色或粉紅色斑點(diǎn)，用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)[8]。

2 免疫膠體金定性檢測(cè)

免疫膠體金定性檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，適用于臨床疾病的基層篩查，其檢測(cè)方式主要為斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）和膠體金免疫層析法（GICA）兩種。

2.1 DIGFA DIGFA 是于固相酶免疫測(cè)定技術(shù)（ELISA）基礎(chǔ)上發(fā)展而來的定性檢測(cè)技術(shù)，其原理是以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，通過滲濾過膜形式，促使抗原抗體反應(yīng)的快速完成，樣本中抗原被膜上抗體捕獲，而其余無關(guān)蛋白則可濾出膜片[9，10]。DIGFA 以膠體金為標(biāo)記物，通過其在滲濾中與膜上抗原的結(jié)合，進(jìn)行定性檢測(cè)。膠體金本身呈紅色，陽性則顯示膜上呈紅色斑點(diǎn)，全過程可于數(shù)分鐘內(nèi)完成，快速便捷[11，12]。ELISA 與DIGFA 進(jìn)行了包蟲病檢測(cè)，結(jié)果顯示DIGFA 法與ELISA 法在包蟲病臨床診斷中的敏感度與特異性均較高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但DIGFA 對(duì)檢測(cè)時(shí)間、操作技能及設(shè)備的要求相對(duì)較低。由此可知，DIGFA 在當(dāng)前醫(yī)學(xué)檢測(cè)中具有較高的敏感度與特異性，且操作簡(jiǎn)單、快速便捷，適合于現(xiàn)場(chǎng)流調(diào)等應(yīng)用。

2.2 GICA GICA 是膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)與層析分析技術(shù)等結(jié)合形成的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)[14]；其原理是將特異性抗原或抗體以條帶狀固定于膜上，并采用膠體金標(biāo)記試劑吸附于結(jié)合墊上，樣品在層析作用下往前移動(dòng)，當(dāng)樣本中存在特異性病毒抗原時(shí)，可與結(jié)合墊處金標(biāo)抗體相結(jié)合，并聚集于檢測(cè)帶上，大量積聚后可肉眼觀察到顯色結(jié)果，具有方便、快捷等應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[15-17]。彭孝斌等[18]研究顯示，在新型冠狀病毒IgM 及IgG 的檢測(cè)結(jié)果中，ELISA 未表現(xiàn)出優(yōu)于GICA 的性能，而GICA 較ELISA 操作更為簡(jiǎn)便快捷，是基層實(shí)驗(yàn)室的良好選擇?？梢奊ICA 具有積極的篩查檢測(cè)價(jià)值，其操作便捷，應(yīng)用范圍廣泛，在疫情篩查及外科手術(shù)應(yīng)用中均具有積極作用。

3 膠體金半定量、定量檢測(cè)

基于膠體金本身的顏色屬性，可通過光學(xué)傳感器對(duì)檢測(cè)線顏色深淺的判定，進(jìn)行定量或半定量分析，并以此作為檢測(cè)依據(jù)。

3.1 半定量檢測(cè) 研究指出[19]，硝酸纖維素膜上顯色面積與其抗體濃度呈正相關(guān)，可建立相應(yīng)的半定量測(cè)定方式，通過定量質(zhì)控點(diǎn)的設(shè)定，獲取半定量檢測(cè)結(jié)果。近年來，已有多篇報(bào)道[20，21]證實(shí)，膠體金半定量快速檢測(cè)在科學(xué)實(shí)驗(yàn)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域據(jù)具有重要價(jià)值。

3.2 定量檢測(cè) 膠體金免疫定量檢測(cè)的應(yīng)用原理主要為硝酸纖維素膜上檢測(cè)線色彩深淺程度與待檢物濃度間的比例關(guān)系，通過光學(xué)傳感器掃描試劑條，隨后取標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以此獲取定量分析的檢測(cè)結(jié)果[22-24]。孫宇等[25]對(duì)膠體金免疫比色法定量檢測(cè)血清h-FABP 水平的應(yīng)用效果進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示h-FABP 膠體金免疫比色法與成熟的免疫比濁法檢測(cè)結(jié)果一致，可為臨床應(yīng)用提供有利依據(jù)。范妙璇等[26]研究指出，膠體金定量檢查可準(zhǔn)確、定量、快速檢測(cè)中藥飲片中黃曲霉毒素含量，并達(dá)到臨床檢驗(yàn)的基本要求。綜上所述，膠體金免疫定量檢測(cè)在臨床檢驗(yàn)中具有確切的應(yīng)用價(jià)值。

4 免疫膠體金在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 細(xì)菌 葡萄球菌、沙門菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌等為常見細(xì)菌病原體，而常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測(cè)大多費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于基層的大量推廣[27]。劉晶等[28]采用膠體金標(biāo)記雙特異性抗金黃色葡萄球菌腸毒素A（SEA）/金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）的單克隆抗體，建立GICA 用于SEA 與SEB 的快速檢測(cè)，結(jié)果顯示測(cè)試卡可在10 min 內(nèi)完成定性和半定量檢測(cè)，且靈敏度高、特異性較強(qiáng)，穩(wěn)定性及重復(fù)性良好，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查檢測(cè)。侯巧華等[29]建立了快速、靈敏檢測(cè)沙門菌的免疫層析試紙方法，其研究結(jié)果顯示該方式檢測(cè)沙門菌的最低濃度為102cfu/ml，而檢測(cè)除沙門菌外的其他7 種細(xì)菌時(shí)，均顯示陰性，可見該方案檢測(cè)沙門菌具有較高的靈敏度及特異性。此外，相關(guān)研究證實(shí)[30]，GICA 技術(shù)在大腸桿菌O157∶H7 的檢測(cè)中具有較高價(jià)值，其檢測(cè)限為500 個(gè)細(xì)菌，且特異性好、檢測(cè)快速、應(yīng)用方便。黃佳斯等[31]研究對(duì)3 種非侵襲性幽門螺桿菌檢測(cè)方法的臨床診斷應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了比較與評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示以13C 尿素呼氣試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，免疫膠體金法的檢測(cè)靈敏度及特異性低于血清抗幽門螺桿菌抗體與HpSA 免疫快檢卡檢測(cè)，但免疫膠體金法更為方便、快捷，且有利于臨床的規(guī)模性檢測(cè)?？梢娔z體金技術(shù)對(duì)細(xì)菌病原體具有較高的檢測(cè)價(jià)值。

4.2 病毒 免疫膠體金技術(shù)在乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）及禽流感病毒（AIV）的檢測(cè)中均具有一定價(jià)值。祁亞寧等[32]對(duì)酶聯(lián)免疫吸附法與膠體金法在乙肝表面抗原檢驗(yàn)中的作用及價(jià)值進(jìn)行了比較，其研究認(rèn)為二者對(duì)乙肝表面抗原均有較高的陽性檢測(cè)率，其中酶聯(lián)免疫法的敏感度及特異度更高，但膠體金法檢測(cè)方式更為簡(jiǎn)便、直觀，檢測(cè)過程更加快捷，且不需要特殊儀器設(shè)備，在感染者初篩及緊急狀態(tài)下更為適用。在HCV 篩查中，有研究證實(shí)，ELISA 法與GICA法檢測(cè)HCV 抗體均具有較高檢出率，其中GICA 法方便、快捷，可優(yōu)先作為臨床初次篩查方法。董莉[33]對(duì)ELISA 法與GICA 在疑似艾滋病血清HIV 檢測(cè)中的檢測(cè)效果進(jìn)行了分析，研究顯示，膠體金法在疑似艾滋病血清HIV 檢測(cè)中的敏感性及特異性更高，可為HIV 診斷結(jié)果提供更為真實(shí)有效的依據(jù)。李維等[34]研發(fā)并生產(chǎn)用于H9 亞型禽流感病毒早期感染現(xiàn)場(chǎng)診斷的膠體金檢測(cè)試劑卡，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)H9 亞型禽病毒的快速篩查工作，有利于H9 亞型禽流感綜合防控效果的提升。以上結(jié)果表明，免疫膠體金技術(shù)對(duì)病毒病原體的檢測(cè)具有重要意義。

4.3 其他 膠體金技術(shù)在梅毒螺旋體、衣原體、旋毛形線蟲等病原體的檢測(cè)中具有重要作用，據(jù)王縛鯤等[35]報(bào)道顯示，以梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，GICA 檢測(cè)梅毒螺旋體的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度顯著高于ELISA，可快速、準(zhǔn)確診斷梅毒螺旋體的感染。而何諾等[36]研究顯示，膠體金法對(duì)女性生殖道沙眼衣原體感染具有較高檢測(cè)價(jià)值。

5 總結(jié)與展望

近年來，免疫膠體金技術(shù)已成為發(fā)展較快的復(fù)合型免疫技術(shù)之一，其適用范圍廣，較傳統(tǒng)檢驗(yàn)方式具有更高效、快速的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，是急診標(biāo)本及疫情現(xiàn)場(chǎng)篩查的主要方式。但目前免疫膠體金技術(shù)在應(yīng)用中也存在一定不足，其試紙條結(jié)果判定易受到環(huán)境、標(biāo)本加樣量及觀察時(shí)間等因素的影響，此外，當(dāng)病原體檢測(cè)存在交叉反應(yīng)時(shí)，易導(dǎo)致假陽性和假陰性反應(yīng)的出現(xiàn)，在病原多項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)方面尚需提高與加強(qiáng)?；诖?，針對(duì)以上弊端，可從提高試劑盒質(zhì)量、拓寬新型標(biāo)記材料、實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)等方面進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步提高免疫膠體金檢測(cè)的敏感性、特異性，促使多元檢測(cè)及直接定量檢測(cè)的早日實(shí)現(xiàn)。