低溫治療及在眼科中的應(yīng)用研究

孟 希 謝 平

低溫療法廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，特別是對(duì)于嚴(yán)重腦卒中、顱腦外傷以及一些重要器官缺血再灌注后的保護(hù)。冷凍療法也運(yùn)用于在皮膚科、器官移植以及生殖醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，在一定程度上可以降低手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、延長(zhǎng)器官的生存時(shí)間。對(duì)眼科而言，低溫常運(yùn)用于眼庫(kù)中移植物的保存；內(nèi)眼手術(shù)時(shí)局部降溫有助于保護(hù)角膜內(nèi)皮和視網(wǎng)膜組織；通過(guò)冷凝術(shù)治療難治性青光眼和視網(wǎng)膜裂孔等。本文將簡(jiǎn)述低溫治療的發(fā)展歷史、作用機(jī)制，并就低溫在眼科疾病中的應(yīng)用做一綜述。

一、低溫治療的發(fā)展簡(jiǎn)史

人類開(kāi)始應(yīng)用低溫治療疾病，最早可追溯到公元前3500年，據(jù)記載當(dāng)時(shí)的醫(yī)師Edwin Smith Papyrus已開(kāi)始運(yùn)用局部低溫修復(fù)傷口；公元前2000年，古埃及人發(fā)現(xiàn)冷敷可獲得良好的鎮(zhèn)痛效果；拿破侖時(shí)期為了減輕因戰(zhàn)傷截肢的痛苦，軍醫(yī)將傷者放在冰水中行手術(shù)操作。

20世紀(jì)以來(lái)，低溫在臨床中得到更廣泛的應(yīng)用：1950年美國(guó)杜克大學(xué)Sealy教授首先將低溫運(yùn)用于心臟灌注手術(shù)；Bigelow等研究發(fā)現(xiàn)，降低患者體表溫度可明顯改善心肺衰竭，低溫療法被迅速推廣及并用于心血管外科手術(shù)；1964年國(guó)際低溫生物學(xué)和低溫醫(yī)學(xué)會(huì)正式成立；20世紀(jì)90年代初期固體二氧化碳、液氮開(kāi)始應(yīng)用于臨床，冷凍醫(yī)療初見(jiàn)雛形；隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，低溫醫(yī)學(xué)日趨成熟。

二、低溫治療的作用機(jī)制

1.低溫對(duì)細(xì)胞代謝的影響：研究發(fā)現(xiàn)低溫通過(guò)降低細(xì)胞耗氧量、影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能等方面發(fā)揮對(duì)于器官的保護(hù)作用。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)通過(guò)與二磷酸腺苷相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)貯能和放能，為細(xì)胞生命活動(dòng)供能。線粒體作為合成ATP的重要場(chǎng)所，其正常功能需要一系列酶的參與，而細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性在低溫下降低。Simkhovich等[1]利用家兔模型研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)降低局部心肌溫度可以保護(hù)心肌免受持續(xù)缺血損傷，局部低溫的保護(hù)機(jī)制是通過(guò)維持臨界能量代謝來(lái)介導(dǎo)的。

低溫對(duì)線粒體也有一定保護(hù)作用，Pamenter等[2]通過(guò)小鼠大腦模型研究不同溫度對(duì)其線粒體功能的影響，結(jié)果表明低體溫可通過(guò)提高線粒體的呼吸效率從而提升缺氧大腦的能量保存和細(xì)胞活力。Huang等[3]研究發(fā)現(xiàn)低溫可減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，使線粒體細(xì)胞色素C還原酶活性提升，從而保護(hù)線粒體的完整性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)部的一種膜質(zhì)結(jié)構(gòu)，一些有害因素例如缺氧常誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而低溫可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)阻止神經(jīng)元的凋亡[4]。

2.低溫與冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白:冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA binding protein, CIRP)主要用于調(diào)控細(xì)胞的周期，通常在組織及細(xì)胞中廣泛低水平表達(dá)，低溫、紫外線、低氧等應(yīng)激和炎癥條件可誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)[5]。低溫療法已被證實(shí)對(duì)神經(jīng)損傷的患者具有神經(jīng)保護(hù)作用。CIRP和冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白基序3(cold inducible RNA-binding protein motif 3, RBM3)是兩種主要的用于神經(jīng)保護(hù)的冷誘導(dǎo)蛋白。Rey-Funes等[6]研究報(bào)道，8℃的低溫條件可保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜免受創(chuàng)傷性神經(jīng)病變的損害，緩解視功能損傷，他們推測(cè)起保護(hù)作用的分子機(jī)制包括兩種冷休克蛋白R(shí)BM3和CIRP的上調(diào)。

3.低溫與炎性反應(yīng)：許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，創(chuàng)傷和手術(shù)后，損傷組織激發(fā)固有免疫反應(yīng)，從而引起小膠質(zhì)細(xì)胞及白細(xì)胞激活，這類激活的免疫細(xì)胞通過(guò)釋放多種因子，進(jìn)一步激活炎性細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡及免疫激活的惡性循環(huán)。參與創(chuàng)傷反應(yīng)的細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子(TNF-α)，白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10等。Kimura等[7]研究證實(shí)低溫(33.5℃)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和促炎性細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β的表達(dá)，同時(shí)低溫通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化減輕神經(jīng)元損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞是炎癥致敏性缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain injury，HI)后炎性反應(yīng)的早期關(guān)鍵介質(zhì)，在HI發(fā)生24h后，小膠質(zhì)細(xì)胞極化成主要的促炎癥表型。臨床上Bilkhu等[8]研究發(fā)現(xiàn)冷敷聯(lián)合人工淚液或是鹽酸依匹斯汀治療急性季節(jié)性過(guò)敏性結(jié)膜炎，比其他治療更能減少結(jié)膜充血，增強(qiáng)了藥物單獨(dú)應(yīng)用的療效，可降低抗原升高的眼表溫度，是在抗原激發(fā)后1h內(nèi)將癥狀降至基線有效的治療方法。

三、低溫保存在眼庫(kù)中的應(yīng)用研究

目前，器官移植在臨床中通常用來(lái)有效根治終末期器官衰竭，眼科開(kāi)展移植手術(shù)革新了許多致盲眼病的治療。低溫保存是利用較低的溫度保存結(jié)構(gòu)完整的活細(xì)胞和組織，該技術(shù)目前仍作為器官移植保存方法的首選。低溫狀態(tài)下可降低離體器官的代謝，同時(shí)提升對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性，顯著提高了移植手術(shù)的成功率[9]。

1.低溫保存與角膜移植:角膜移植手術(shù)是治療角膜病最有效的方法，而開(kāi)展此類手術(shù)的基本條件就是眼庫(kù)及角膜保存技術(shù)。我國(guó)研究者曾對(duì)不同保存方法的大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行活性染色，發(fā)現(xiàn)深低溫保存后復(fù)溫的角膜植片具有良好的內(nèi)皮活性，深低溫抑制細(xì)胞能量代謝，使其長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài)，經(jīng)過(guò)復(fù)溫后的細(xì)胞可恢復(fù)其正常的生物學(xué)功能[10]。角膜排斥反應(yīng)是角膜移植手術(shù)失敗的主因，如何降低其發(fā)生率一直是研究的熱點(diǎn)。牛曉霞等[11]通過(guò)觀察大鼠穿透性角膜移植術(shù)后的角膜排斥反應(yīng)指數(shù)、植片存活時(shí)間和植片的病理變化，發(fā)現(xiàn)深低溫保存組植片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，并且術(shù)后10天時(shí)HE染色顯示深低溫組炎性反應(yīng)較其他組明顯減輕。

以上提及的深低溫保存對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞密度影響的研究主要是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，目前臨床研究數(shù)據(jù)較少。原因是雖然深低溫保存法可明顯延長(zhǎng)角膜保存時(shí)間、杜絕微生物對(duì)角膜的污染、同時(shí)避免自身代謝產(chǎn)物的毒性反應(yīng)，但該方法存在設(shè)備昂貴、過(guò)程復(fù)雜、技術(shù)要求較高等情況，所以在國(guó)內(nèi)尚未普及。相信隨著冷凍保護(hù)劑的開(kāi)發(fā)和利用,該技術(shù)將會(huì)普遍應(yīng)用于國(guó)內(nèi)的醫(yī)療環(huán)境中。

姜濤等[12]用深低溫保存的角膜材料行板層角膜移植術(shù)治療邊緣性角膜變性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病例術(shù)后角膜邊緣病變均未發(fā)展，術(shù)后視力基本不受影響，尤其是術(shù)前未發(fā)生角膜穿孔的病例，術(shù)后幾乎沒(méi)有眼壓升高、瞳孔粘連、前房反應(yīng)等并發(fā)癥。深低溫保存的角膜材料彌補(bǔ)了新鮮角膜的來(lái)源限制與時(shí)效限制，是治療邊緣性角膜變性的理想材料。

2.低溫保存與眼科其他移植手術(shù)：角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSC)的缺乏導(dǎo)致進(jìn)行性視力喪失，通過(guò)自體LSC移植可治療多種眼表疾病，如復(fù)發(fā)性翼狀胬肉、眼表化學(xué)損傷、角膜緣潰瘍等。鄭穗聯(lián)等[13]采用“簡(jiǎn)化二步法”凍貯LSC，光鏡、電鏡、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明深低溫保存LSC結(jié)構(gòu)完整、功能良好。他們以二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑，更好地保護(hù)角膜內(nèi)皮；液氮具有的超低溫性抑制細(xì)胞代謝；控速降溫避免嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而快速?gòu)?fù)溫可提高細(xì)胞成活率，加快其功能恢復(fù)。Osei-Bempong等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)凍存保護(hù)劑的濃度超過(guò)5%時(shí)，細(xì)胞膜的完整性、代謝和集落形成效率降低，而保護(hù)劑的種類對(duì)這些特性沒(méi)有顯著影響，這對(duì)眼庫(kù)低溫保存劑的選擇有一定指導(dǎo)意義。

羊膜間質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)分泌損傷部位的治療因子減輕角膜損傷[15]。如今保存羊膜已廣泛應(yīng)用于眼科，臨床觀察其重建眼表的作用、療效及預(yù)后也與新鮮羊膜無(wú)明顯差異。魯靜等[16]曾通過(guò)觀察組織形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，研究了4種常用的羊膜保存方法，結(jié)論是以DMEM/甘油深低溫保存法效果最好，因?yàn)樯畹蜏乩鋬霰４鏈p緩了反應(yīng)和細(xì)胞死亡，并且培養(yǎng)基中所含的葡萄糖具有維持細(xì)胞滲透壓、抑制細(xì)胞水腫的作用。

Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低溫保存的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜色素上皮(human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium，hESC-RPE)細(xì)胞不僅保留了誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的特異性基因表達(dá)譜、形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，還具有極化單層、緊密連接和縫隙連接結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)顯示，即使經(jīng)過(guò)低溫保存和解凍的hESC-RPE細(xì)胞仍然可以作為治療視網(wǎng)膜變性疾病的供體細(xì)胞來(lái)源。

四、低溫治療在眼科手術(shù)中的應(yīng)用研究

1.低溫與眼瞼手術(shù)：瞼緣色素痣的切除手術(shù)時(shí)常導(dǎo)致的并發(fā)癥有倒睫、眼瞼內(nèi)外翻甚至眼瞼畸形等，嚴(yán)重影響美觀。低溫冷凍治療色素痣通過(guò)破壞黑色素細(xì)胞，使其中斷輸送到表皮細(xì)胞，從而使色素痣脫色素。冷凍治療操作簡(jiǎn)單、不易造成明顯眼瞼畸形及瘢痕殘留，恢復(fù)后外觀較為自然，值得推廣應(yīng)用[18]。

2.低溫與角膜屈光手術(shù)：機(jī)械法-準(zhǔn)分子激光上角膜皮瓣下磨鑲術(shù)(epipolis laser in situ keratomileusis, Epi-LASIK)是在準(zhǔn)分子激光上皮下角膜磨鑲術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)嶄新的屈光手術(shù)技術(shù)，依舊存在術(shù)后角膜上皮下霧狀混濁(haze)等并發(fā)癥。預(yù)防角膜haze常見(jiàn)的方法有應(yīng)用絲裂霉素(mitomycin，MMC)浸潤(rùn)角膜基質(zhì)切削面、低溫平衡鹽溶液(chilled balanced salt solution，CBSS)沖洗等。沈政偉等[19]選擇Epi-LASIK作為研究術(shù)式，在術(shù)中分別應(yīng)用0.2%MMC及4℃ CBSS處理基質(zhì)表面，發(fā)現(xiàn)兩組患者術(shù)后裸眼視力、殘余等效球鏡度以及上皮并發(fā)癥方面，CBSS組均稍優(yōu)于MMC組，原因可能與低溫抑制細(xì)胞凋亡、MMC的角膜上皮毒性有關(guān)，CBSS抑制Epi-LASIK術(shù)后角膜haze更有效和安全。

經(jīng)上皮準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)(trans-Epithelial photorefractive keratectomy，TPRK)存在角膜表層手術(shù)固有的術(shù)后疼痛、炎性反應(yīng)明顯等問(wèn)題，術(shù)中激光可使基質(zhì)床溫度升高，引起燒灼感和刺痛感，臨床上主要使用鎮(zhèn)痛藥物來(lái)抑制疼痛，這可能會(huì)延遲角膜上皮的愈合，甚至造成嚴(yán)重的角膜毒性。周友惠等[20]在術(shù)中采用4℃ CBSS沖洗結(jié)膜囊加上術(shù)后即刻冷敷術(shù)眼1h，發(fā)現(xiàn)患者手術(shù)當(dāng)天疼痛評(píng)分、術(shù)后5天角膜上皮愈合及結(jié)膜充血明顯優(yōu)于常溫組，局部冷療可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的感知能力，降低神經(jīng)末梢敏感度，可明顯減輕患者術(shù)后早期疼痛，減少止痛藥的使用。

3.低溫與白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)：白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)(phacoemulsification，Phaco)術(shù)中超聲探頭高頻振動(dòng)產(chǎn)生的能量及乳化顆粒的機(jī)械損傷難免會(huì)引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、數(shù)量和功能的破壞。Alzner等[21]曾監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)Phaco術(shù)中能量的釋放使房水溫度升高12℃以上，房水實(shí)時(shí)溫度高達(dá)36℃，遠(yuǎn)超角膜所能耐受的最高溫度32℃，可直接造成角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷。因此，通過(guò)各種手段降低Phaco術(shù)后角膜水腫及角膜內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)，長(zhǎng)期成為研究的熱點(diǎn)。

低溫灌注能夠降低Phaco產(chǎn)生的熱效應(yīng)，Wan等[22]對(duì)硬核白內(nèi)障的兔眼行Phaco手術(shù)，分別在術(shù)中行低溫(4℃)和常溫(24℃)灌注，術(shù)后測(cè)量角膜中央厚度和切緣厚度，檢測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)和觀察前房(anterior chamber，AC)炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)，證實(shí)了低溫灌注能有效保護(hù)角膜內(nèi)皮，減輕術(shù)后角膜水腫和AC炎癥。Jiang等[23]觀察葡萄膜炎相關(guān)性白內(nèi)障患者行Phaco手術(shù)，發(fā)現(xiàn)低溫灌注組的患者術(shù)后第1天前房閃輝、房水細(xì)胞評(píng)分及角膜切口平均厚度均低于常溫組，顯示低溫灌注應(yīng)用于特殊類型的白內(nèi)障同樣安全有效。證實(shí)瞬態(tài)低溫可有效預(yù)處理刺激，相關(guān)組織的代謝率降低，以此誘導(dǎo)機(jī)體耐受缺血性或低氧性損傷[22]。

4.低溫與抗青光眼手術(shù)：睫狀體冷凝術(shù)通過(guò)冷凍破壞睫狀體上皮和血管系統(tǒng)，同時(shí)可破壞角膜緣處神經(jīng)組織，達(dá)到減少房水生成、緩解疼痛的效果，目前主要應(yīng)用于難治性青光眼的治療。曲建梅等[24]對(duì)青光眼濾過(guò)術(shù)后眼壓未被控制的患者進(jìn)行睫狀體冷凝術(shù)，術(shù)后眼壓明顯下降，患者需用降眼壓藥物的數(shù)量明顯減少;術(shù)后3個(gè)月無(wú)炎性反應(yīng)或疼痛。需要注意的是，睫狀體冷凝術(shù)一次手術(shù)過(guò)量可導(dǎo)致低眼壓及眼球萎縮，且沒(méi)有任何恢復(fù)眼壓的措施，因此選擇患者要慎重，只有在其他治療失敗或不能進(jìn)行時(shí)作為一項(xiàng)補(bǔ)救措施，不能一味追求過(guò)度降低眼壓。

5.低溫與玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)：Tamai等[25]曾研究不同溫度對(duì)家兔玻璃體切除術(shù)的影響，將眼內(nèi)灌注液分別維持在9、22、37℃，術(shù)后灌洗玻璃體腔60min，分別于術(shù)前和術(shù)中監(jiān)測(cè)兔眼的溫度和葡萄膜血流，術(shù)后第1、7、14天檢測(cè)房水蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)局部低溫可以減少術(shù)中脈絡(luò)膜出血及術(shù)后早期的炎性反應(yīng)。我國(guó)研究者也做過(guò)類似研究，證實(shí)局部低溫對(duì)家兔術(shù)眼血-房水屏障及血-視網(wǎng)膜屏障均有一定的保護(hù)作用。

冷凝可導(dǎo)致細(xì)胞死亡、組織無(wú)菌性壞死，由于這種機(jī)制，視網(wǎng)膜冷凝術(shù)可形成局部炎性反應(yīng)，導(dǎo)致脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的瘢痕黏連，從而達(dá)到封閉視網(wǎng)膜裂孔、預(yù)防視網(wǎng)膜脫離的作用[26]。視網(wǎng)膜冷凝術(shù)也可抑制因缺血缺氧而產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，從而消除視網(wǎng)膜新生血管。隨著玻璃體腔注射抗VEGF藥物的普及，抗VEGF聯(lián)合視網(wǎng)膜冷凝術(shù)可更加有效地治療如3期Coats病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)等疾病，達(dá)到消除異常血管和滲出、減輕視網(wǎng)膜脫離和預(yù)防NVG等并發(fā)癥的目的。然而，過(guò)度冷凝會(huì)造成RPE破壞以及血-視網(wǎng)膜屏障破裂，導(dǎo)致色素細(xì)胞較多游離、炎癥和血管生成介質(zhì)的釋放增加，易引起增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的發(fā)生，因此應(yīng)避免過(guò)度大面積冷凝。如今視網(wǎng)膜手術(shù)中多使用冷凝與激光相結(jié)合的方法，以減輕對(duì)RPE細(xì)胞的損害，阻止或減輕PVR的進(jìn)展。

五、展 望

目前低溫在眼科的運(yùn)用相對(duì)集中于眼庫(kù)、炎癥的控制和一些眼科手術(shù)的輔助治療。未來(lái)應(yīng)更深入地探究例如低溫對(duì)神經(jīng)保護(hù)的具體治療方案、如何解決低溫可能存在的不良反應(yīng)、低溫對(duì)人視網(wǎng)膜缺血或光損傷病理改變的影響等問(wèn)題，需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持以及進(jìn)一步的臨床觀察。