高通量測序在乳腺癌及婦科惡性腫瘤篩查中的應(yīng)用進(jìn)展*

李 敏，豆小文 綜述,張秀明△ 審校

1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232000；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東深圳 518001

乳腺癌(BC)及婦科惡性腫瘤(如子宮頸癌、輸卵管腫瘤、子宮內(nèi)膜癌和絨毛膜癌等)是遺傳和獲得性突變、轉(zhuǎn)錄偏差和表觀遺傳因素影響的基因組改變的結(jié)果[1-6]。了解BC及婦科惡性腫瘤的基因組和分子基礎(chǔ)對發(fā)現(xiàn)用于篩查和預(yù)防的生物標(biāo)志物及開發(fā)更有效的藥物靶點治療策略至關(guān)重要。運(yùn)用傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)(即第一代測序技術(shù))分析實體腫瘤的遺傳表征僅涉及小且單一的DNA片段分析，對于同時進(jìn)行多個基因的測序是有限、耗時且昂貴的[7]。高通量測序技術(shù)(NGS)又稱“下一代”測序技術(shù)，允許在一次分析中同時對數(shù)千至數(shù)百萬個DNA片段進(jìn)行測序，從而擴(kuò)大了所獲取的遺傳信息數(shù)量，減少了分析的時間和成本[8]。在BC及婦科惡性腫瘤中，NGS的使用在高風(fēng)險遺傳基因的識別等方面產(chǎn)生了重要的作用[9]，本文就NGS對BC及婦科惡性腫瘤的早期篩查和預(yù)防、診斷和治療策略等方面的影響作一綜述。

1 NGS平臺

目前，瑞士羅氏公司的454 測序儀、美國Ⅰllumina公司的Solexa基因組分析儀和ABI公司的SOLiD 測序儀為NGS平臺的代表。

1.1454測序儀 454測序儀運(yùn)用焦磷酸測序方法即結(jié)合乳液聚合酶鏈反應(yīng)和皮升級焦磷酸為基礎(chǔ)方法，依靠生物發(fā)光進(jìn)行基因測序。其原理是在DNA聚合酶、熒光素酶、腺苷三磷酸(ATP)硫酸化酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將每一個脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的聚合與一次熒光信號偶聯(lián)起來，通過檢測熒光信號的有無和強(qiáng)弱，進(jìn)行實時檢測DNA序列[10-11]。454焦磷酸測序技術(shù)不需要進(jìn)行電泳，也不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，具有靈敏度高、分析速度快和自動化等優(yōu)點。

1.2Solexa基因組分析儀 Solexa基因組分析儀運(yùn)用單分子陣列，通過邊合成邊測序技術(shù)檢測DNA序列。其原理是將已加入接頭的DNA片段附著到含接頭測序芯片表面，經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在芯片上形成了數(shù)以億計的核苷酸片段，每組核苷酸片段是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。通過檢測帶熒光基團(tuán)的4種特殊dNTP加入到引物后釋放出的焦磷酸鹽信號來確定DNA序列[12-13]。邊合成邊測序技術(shù)可減少因二級結(jié)構(gòu)而造成的片段缺失，具有高通量、高靈敏度、自動化、操作簡單等優(yōu)點。

1.3SOLiD 測序儀 SOLiD測序儀運(yùn)用寡核苷酸連接測序技術(shù)進(jìn)行“雙堿基”DNA測序。其原理是在連接反應(yīng)體系中，將5′端帶有4種熒光染料(CY5、Texas Red、CY3、6-FAM)的8堿基探針混合物與目標(biāo)DNA模板按堿基互補(bǔ)配對原則配對連接，通過發(fā)出的熒光信號檢測DNA序列。另外，8堿基DNA探針的3′端第1、2位構(gòu)成的堿基對編碼表達(dá)熒光染料基因，第3～5位是隨機(jī)堿基，第6～8位為可以和任何堿基配對的特殊堿基[14-15]。在反應(yīng)過程中，SOLiD測序儀記錄第1、2位編碼區(qū)熒光顏色信息，并用化學(xué)法去掉第6～8位堿基及熒光基團(tuán)，依次循環(huán)組成原始顏色序列。SOLiD“雙堿基”DNA測序可用于判斷檢測位點是否為單核苷酸多態(tài)性，具有無可匹及的準(zhǔn)確性、高通量、系統(tǒng)靈活、操作簡單等優(yōu)點。

2 NGS篩查BC及婦科惡性腫瘤

目前，NGS在BC及婦科惡性腫瘤的臨床篩查方面應(yīng)用較少，但其在發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶點及耐藥的分子機(jī)制方面具有重大意義，是臨床研究的熱點之一。

2.1NGS在BC中的應(yīng)用 BC病理組織形態(tài)較為復(fù)雜，分型分類眾多。根據(jù)基因表達(dá)譜，BC可分為腔型A型、腔型B型、人表皮生長因子受體2(HER2)陽性型、基底細(xì)胞樣型、未能分類型[16-18]；按免疫組化結(jié)果可分為雌激素受體(ER)/孕激素受體(PR)陽性、HER2陽性和三陰性BC(ER、PR、HER2均陰性)，大致對應(yīng)的基因表達(dá)譜分型為：腔型A型和B型、HER2陽性型、基底細(xì)胞樣型。因此，可利用NGS對不同分型的BC患者進(jìn)行基因測序，協(xié)助臨床醫(yī)生實現(xiàn)疾病的早篩、及時調(diào)整治療方案。HAN等[19]研究結(jié)果表明，NGS可檢測包括乳腺癌1號基因(BRCA1)啟動子區(qū)域缺失以及單核苷酸變異和小的插入、缺失在內(nèi)的大多數(shù)基因重排，并通過仔細(xì)評估患者的病史、RNA測序和基因表達(dá)，證明了啟動子區(qū)域缺失的重要性。BRCA1啟動子區(qū)域的缺失顯著，可將其納入遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征患者的遺傳篩查。NASSAR等[20]利用NGS檢測BC體細(xì)胞基因突變，結(jié)果表明，除之前已報道的TP53、PIK3CA、PTEN等常見基因外，還發(fā)現(xiàn)了KRAS、STK11、APC、JAK3等其他基因的突變。可見，NGS是評估BC癌基因和抑癌基因突變狀態(tài)的一個非常有用的工具。

2.2NGS在宮頸癌中的應(yīng)用 宮頸癌是發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，其早期篩查以高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測聯(lián)合液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(TCT)為主[21-23]。攜帶高危型HPV但不罹患宮頸癌的女性也并非少數(shù)。對于宮頸癌患者來說，NGS可獲得其免疫治療標(biāo)志物信息；對于高危型HPV攜帶者來說，可預(yù)測病毒是否會持續(xù)感染、是否會進(jìn)一步發(fā)展為宮頸癌。FERTEY等[24]利用NGS檢測高危型HPV16 L1基因組中胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(CpG)5962的甲基化水平，證明該位點的甲基化可能是HPV持續(xù)感染的預(yù)測標(biāo)志物，且特異性CpG的甲基化與高危病毒載量之間存在相關(guān)性。有研究利用NGS觀察到顯著的APOBEC基因突變模式，并證實了SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A和TGFBR2是宮頸癌新的顯著突變基因[2]；在所有HPV18陽性患者和76%的HPV16陽性患者中發(fā)現(xiàn)HPV整合，可能與結(jié)構(gòu)畸變和靶基因表達(dá)水平增高有關(guān)。上述有關(guān)甲基化檢測以及HPV整合位點分析的研究有望對高危型HPV進(jìn)一步分型，并揭示了宮頸癌新的潛在治療靶點。

2.3NGS在卵巢癌中的應(yīng)用 卵巢癌是病死率極高的一種疾病，在疾病早期患者通常無明顯癥狀，在出現(xiàn)臨床癥狀時病情往往已處于晚期階段。約70%的卵巢癌為卵巢高級別漿液性腺癌，此類卵巢癌很少原發(fā)于卵巢，而大部分發(fā)源于輸卵管[25-27]。目前雖采用糖類抗原125檢測聯(lián)合盆腔超聲對散發(fā)的卵巢癌進(jìn)行篩查，但無法實現(xiàn)早期診斷。對于家族性的卵巢癌，通過基因檢測可使患者在尚未發(fā)病時就預(yù)防性切除卵巢[20]。此外，ZHENG等[28]運(yùn)用NGS在化療敏感和不敏感卵巢癌患者中鑒定出249個差異表達(dá)基因，這些與化療敏感性相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)水平可以作為預(yù)測治療結(jié)果和改善預(yù)后的靶點。

2.4NGS在子宮內(nèi)膜癌中的應(yīng)用 子宮內(nèi)膜癌的篩查及診斷方法有血清學(xué)檢測、影像學(xué)檢查、組織病理學(xué)檢測等，但高危子宮內(nèi)膜癌患者多合并有肥胖，增加了活檢的難度[29-31]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組織病理學(xué)檢測與基因檢測相結(jié)合的方式有望實現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的臨床早期篩查，并發(fā)現(xiàn)基因突變的子宮內(nèi)膜癌患者。WILSON等[32]研究發(fā)現(xiàn)ARID1A、PIK3CA兩種基因同時突變與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生直接相關(guān)。SANGTANI等[33]收集從子宮內(nèi)膜癌患者使用過的陰道衛(wèi)生棉條上脫落的DNA，采用低覆蓋全基因組測序評估拷貝數(shù)、焦磷酸測序測量啟動子甲基化水平，通過NGS確定了19個與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的基因突變，其靈敏度為92%，特異度為86%，為子宮內(nèi)膜癌非侵襲性且精確的檢測方法提供了依據(jù)。

2.5NGS在絨毛膜癌中的應(yīng)用 相較于上述3種常見的婦科惡性腫瘤，絨毛膜癌發(fā)病率雖較低，但其預(yù)后不良，易通過血行轉(zhuǎn)移至其他組織器官，導(dǎo)致患者死亡。并且其診斷方法僅為影像學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢測等，無法實現(xiàn)早期無創(chuàng)篩查，因此，針對絨毛膜癌的基于NGS的基因突變研究逐漸開展起來。高達(dá)20%的完全性葡萄胎可發(fā)展為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞癌，其中就包括絨毛膜癌。目前尚無成熟的生物標(biāo)志物能夠預(yù)測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞癌的發(fā)展，LIN等[34]運(yùn)用NGS檢測絨毛膜癌細(xì)胞系(JEG-3和JAR)和正常胎盤細(xì)胞系(3A-subE)的微小RNA(miRNA)，檢測結(jié)果顯示JEG-3和JAR中miR-181b-5p和miR-181d-5p均有明顯改變，并且均表達(dá)BCL2蛋白，提示miR-181家族成員和BCL2蛋白可能是預(yù)測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞癌變風(fēng)險的生物標(biāo)志物。

3 小 結(jié)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，女性惡性腫瘤的早期篩查成為臨床亟待解決的問題之一。相對于傳統(tǒng)的組織病理學(xué)檢測、血清學(xué)檢測、影像學(xué)檢查等手段，NGS有著較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。目前，NGS檢測的DNA標(biāo)本可以來自子宮腔脫落細(xì)胞、宮頸管細(xì)胞涂片甚至是外周血等，以循環(huán)腫瘤DNA和甲基化的檢測為發(fā)展方向，NGS可實現(xiàn)BC、宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等女性惡性腫瘤的無創(chuàng)早篩。