MicroRNA在肺小結(jié)節(jié)鑒別診斷中的研究進(jìn)展

侯雅超，陳昌國，韓瑞

2022年全球最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌發(fā)病率雖不是首位，但致死率高達(dá)21%，仍居第一[1]。我國最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌發(fā)病率及致死率仍為首位，2016年我國新肺癌82.8萬例，約占總發(fā)病人數(shù)的20%[2]。

組織學(xué)上，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（smallcell lung cancer,SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-smallcell lung cancer,NSCLC），NSCLC占肺癌總病例數(shù)的80%以上[3]。肺癌起病隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，早期無明顯臨床癥狀，主要表現(xiàn)是影像學(xué)提示的肺部小結(jié)節(jié)。肺癌致死率較高重要原因之一是缺乏早期特異性臨床癥狀，多數(shù)肺癌患者首次診斷時已處于晚期，預(yù)后相對不好[4-5]。研究表明，IA期肺癌患者5年生存率約77%～92%，而IVA期肺癌患者5年生存率僅為10%[6]。因此，尋找有效、準(zhǔn)確的手段來提升肺癌早期診斷率，對于改善肺癌患者預(yù)后、延長生存期尤為必要。

低劑量計算機(jī)斷層掃描(low-dose computed tomography,LDCT)是目前肺癌早期篩查的主要手段。隨著人們健康意識的提升及診斷儀器分辨率的增高，肺部影像學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)不明原因小結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增多。肺部小結(jié)節(jié)在普通人群中檢出率最高可達(dá)8%，高危人群甚至可達(dá)50%[4]。LDCT篩查雖在臨床廣泛應(yīng)用，但較高的假陽性率易導(dǎo)致過度治療[7]。此外，LDCT對于惡性肺小結(jié)節(jié)診斷的準(zhǔn)確率與影像醫(yī)生及胸外科醫(yī)生讀片水平密切相關(guān)，對其自身積累的臨床經(jīng)驗(yàn)有較高的依賴性[8]。那么，提高肺小結(jié)節(jié)檢出率的同時，如何合理判斷肺小結(jié)節(jié)良惡性成為肺癌早期篩查和診斷的關(guān)鍵問題之一。肺結(jié)節(jié)（特別是＜10 mm的肺小結(jié)節(jié)）進(jìn)行組織活檢有一定難度，如何有效利用非有創(chuàng)診斷手段提升LDCT篩查的準(zhǔn)確率是亟需解決的問題。液態(tài)活檢作為體外診斷的一個分支，以非侵入式獲取血液及體液中相關(guān)標(biāo)志物檢測信息，是腫瘤早期診斷、輔助治療的突破性技術(shù)[9]。隨著液體活檢技術(shù)的興起及部分microRNA用于結(jié)直腸癌、肝癌早期診斷臨床產(chǎn)品的應(yīng)用，microRNA用于腫瘤早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后評估等又成為腫瘤標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。microRNA是一類小的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，是液體活檢的重要成員[10]。microRNA通過調(diào)控細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤相關(guān)血管生成、腫瘤細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡等過程,從而可促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展[11]。microRNA在肺癌早期診斷方面的應(yīng)用亦有較多研究，可用于肺癌液體活檢的標(biāo)本有外周血、痰液和支氣管肺泡灌洗液等[4]，這些標(biāo)本具有相對易于獲得、可重復(fù)采樣和非侵入性的優(yōu)勢。本文就近年來microRNA在肺小結(jié)節(jié)鑒別診斷方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述如下。

1 MicroRNA

microRNA是一類18～22個核苷酸長的內(nèi)源性非編碼RNA。大多數(shù)動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的microRNA可與目的基因mRNA 3'UTR形成完全或不完全堿基配對，從而促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯[12-13]。研究表明，microRNA可在細(xì)胞凋亡、分化和增殖等多個階段參與靶基因表達(dá)調(diào)控，且microRNA異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成等生物學(xué)過程密切相關(guān)[14]。microRNA以下幾個特點(diǎn)使其具備成為腫瘤標(biāo)志物的“潛質(zhì)”：（1）在進(jìn)化過程中高度保守；（2）在生理或病理?xiàng)l件下可由正常細(xì)胞分泌到體液中，也可由凋亡或壞死細(xì)胞釋放到體液中，從而進(jìn)入體液循環(huán)；（3）在血清、血漿、尿液、乳汁和胸水等體液中均可檢測到特異性microRNA；（4）腫瘤細(xì)胞和相應(yīng)正常組織中均有特異性microRNA表達(dá)譜，且特異性microRNA表達(dá)譜與腫瘤進(jìn)展階段高度一致[15]；（5）不同體液中microRNA相對穩(wěn)定，與其能和蛋白結(jié)合形成復(fù)合物有效抵抗RNase降解有關(guān)；（6）體液中游離microRNA可耐受煮沸、高/低pH、RNase等處理，甚至在反復(fù)凍融多次、室溫放置24 h等嚴(yán)苛情況下其含量仍保持相對穩(wěn)定[16]。

2 MicroRNA與肺癌

肺癌早篩是一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問題。為改善肺癌“兩低一高”（早期檢出率低，5年生存率低，病死率高）現(xiàn)狀，完善和落實(shí)肺癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療策略，除努力提高LDCT診斷效率外，一些出現(xiàn)的新技術(shù)可作為實(shí)驗(yàn)室檢測的手段[17]。液態(tài)活檢技術(shù)就是一種較好的補(bǔ)充，利用液體活檢技術(shù)可檢測到不同進(jìn)展階段及不同腫瘤部位釋放的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測腫瘤細(xì)胞相關(guān)分子變化的目的，較為全面反映惡性腫瘤不同分子表達(dá)譜變化，可較好解決腫瘤異質(zhì)性給腫瘤早期診斷帶來的挑戰(zhàn)[18]。microRNA作為液體活檢的重要成員，越來越多的研究團(tuán)隊(duì)將microRNA應(yīng)用于肺癌早期篩查及診斷，作為LDCT的補(bǔ)充輔助診斷方法，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用以提高肺癌早期診斷準(zhǔn)確率。

2.1 MicroRNA在肺癌早期診斷中的價值在過去幾年中，基于循環(huán)中microRNA檢測用于肺癌早期診斷的研究較為廣泛，研究結(jié)果均提示microRNA可作為肺癌早期診斷，且具有良好的敏感性和特異性[19]。Monika等[20]對NSCLC組織和癌旁組織中差異microRNA檢測發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中miR-17表達(dá)顯著低于癌旁對照組（P=0.0178），隨后，他們通過ROC曲線分析進(jìn)一步明確miR-17在早期診斷NSCLC方面具有較大價值，認(rèn)為miR-17可用于區(qū)分腫瘤組織與手術(shù)切緣，且miR-17表達(dá)水平與NSCLC組織型分化程度呈一定相關(guān)性。Ernest等[21]對70例肺癌患者和22名非癌癥受試者(non-cancer subjects,NC)血清樣本microRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-193b、miR-301、miR-141和miR-200b這4個microRNAs可有效區(qū)分肺癌患者與NC患者，認(rèn)為這組microRNAs有較大潛力作為LDCT前實(shí)驗(yàn)室輔助篩查的生物診斷標(biāo)志物。此外，有關(guān)microRNA對于NSCLC診斷價值的Meta分析亦有較多報道。Cheng等[22]分析發(fā)現(xiàn)，miR-148/152家族對于診斷NSCLC具有良好的敏感性和特異性，可作為NSCLC診斷的新型無創(chuàng)診斷生物標(biāo)志物。microRNA SNP與肺癌易感性亦有少量報道，Zou等[23]發(fā)現(xiàn)miR-155和MIR155HG rs767649多態(tài)性是NSCLC易感性的潛在因素，但缺乏較為嚴(yán)謹(jǐn)、確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

此外，不同組織來源腫瘤細(xì)胞和對應(yīng)組織均有各自特征性microRNA表達(dá)譜。Pavel等[24]通過NGS技術(shù)對肺癌患者和良性對照組主支氣管上皮細(xì)胞microRNA表達(dá)譜測序發(fā)現(xiàn)，肺癌患者支氣管上皮細(xì)胞中miR-146a-5p、miR-324-5p、miR-223-3p、miR-223-5p下調(diào)；進(jìn)而將miR-146a-5p與現(xiàn)有肺癌腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合用于肺癌早期診斷，證實(shí)可顯著提高診斷效能。有學(xué)者嘗試將痰液中microRNA檢測作為肺部結(jié)節(jié)的診斷標(biāo)志物。Roa等[25]對NSCLC患者痰液中miR-21、miR-145、miR-155、miR-205、miR-210、miR-92、miR-17-5p、miR-143、miR-182、miR-372和let-7a進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-143、miR-155、miR-210、miR372可有效區(qū)分NSCLC患者，將這組microRNAs前瞻性應(yīng)用于24例NSCLC病例和6例陰性對照病例，結(jié)果提示這組microRNAs用于NSCLC診斷，其靈敏度為83.3%，特異度為100%。

2.2 MicroRNA與肺癌預(yù)后microRNA不僅可用作肺癌輔助診斷，還可用于肺癌治療效果評價及預(yù)后評估。Xu等[26]通過檢測43例NSCLC患者1個周期鉑類藥物化療前后血漿中miR-32表達(dá)量，結(jié)果表明血漿miR-32表達(dá)水平與患者鉑類藥物化療效果及患者生存期有一定相關(guān)性，認(rèn)為miR-32檢測可用于預(yù)測NSCLC患者鉑類化療療效和預(yù)后評估。Yang等[27]檢測73例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織中miR-421表達(dá)量，運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行分析表明，miR-421表達(dá)水平較高的肺腺癌患者總生存期(overall survival,OS)較miR-421表達(dá)水平低的microRNA患者要低，miR-421高表達(dá)是肺腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

3 MicroRNA與肺結(jié)節(jié)鑒別診斷

目前，組織活檢是肺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但這類活檢手術(shù)有引起嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險，如氣胸、肺實(shí)質(zhì)出血、肺部感染等[28]。臨床操作中，當(dāng)肺小結(jié)節(jié)直徑＜10 mm，進(jìn)行組織活檢難度較大，造成漏診、誤診的機(jī)率大幅增加。LDCT是現(xiàn)階段肺癌篩查和早期診斷的有效方法之一，但隨著假陽性結(jié)節(jié)大量檢出，需要其它篩查手段加以補(bǔ)充以提高肺癌早期診斷準(zhǔn)確率。

目前，眾多研究均認(rèn)為microRNA在肺結(jié)節(jié)中早期診斷中有較大價值，且可作為鑒別良惡性小結(jié)節(jié)的腫瘤標(biāo)志物[29-30]。He等[8]聯(lián)合檢測血清miR-199a-3p、miR-148a-3p、miR-210-3p、miR-378d和miR-138-5p發(fā)現(xiàn)microRNAs檢測有助于降低CT掃描診斷的假陽性率，提高LDCT鑒別肺良惡性結(jié)節(jié)的診斷效能。Xi等[31]對57例接受手術(shù)的肺結(jié)節(jié)患者（15例良性肺結(jié)節(jié)患者和42例惡性肺結(jié)節(jié)患者）血漿中12種microRNAs表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿中miR-17、miR-146a、miR-200b、miR-182、miR-221、miR-205、miR-7、miR-21、miR-145和miR-210表達(dá)水平顯著高于良性肺結(jié)節(jié)患者，且這些microRNAs均有較高靈敏度（54.8%～83.3%）和特異度（60.0%～86.7%）；該團(tuán)隊(duì)繼而從這 組microRNAs中 選 取miR-146a、miR-200b和miR-7與LDCT聯(lián)合建立診斷模型并對該模型診斷肺結(jié)節(jié)的性能進(jìn)行評估，結(jié)果表明該診斷模型在訓(xùn)練集中對NSCLC診斷的靈敏度和特異度分別為92.9%和83.3%；驗(yàn)證集中對NSCLC診斷的靈敏度為71.8%，特異度為69.2%，顯示出良好的診斷效能，可有效輔助辨識肺結(jié)節(jié)性質(zhì)[32]。

盡管有研究認(rèn)為凝血過程可能影響血清中microRNAs水平，但較多研究亦采用血清作為檢測microRNA的介質(zhì)[4]。除直接進(jìn)行檢測外，有學(xué)者嘗試?yán)胢icroRNA檢測值比率用于肺小結(jié)節(jié)的鑒別診斷。Fan等[33]對正常對照組和NSCLC組miR-15b-5p/miR-146b-3p、miR-20a-5p/miR-146b-3p、miR-19a-3p/miR-146b-3p、miR-92a-3p/miR-146b-3p和miR-16-5p/miR-146b-3p比值進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC組microRNA組合比值顯著高于良性肺結(jié)節(jié)組，認(rèn)為這五種血清microRNAs組合比值是鑒別良性肺結(jié)節(jié)和NSCLC的獨(dú)立診斷因素。

外泌體是一種微型載體，可用于microRNA動員、保護(hù)和運(yùn)輸microRNA，并通過將其內(nèi)容物運(yùn)輸?shù)侥[瘤微環(huán)境中的靶細(xì)胞來影響細(xì)胞間通訊。因此，外泌體來源microRNA被認(rèn)為是理想的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物之一[17]。腫瘤來源的外泌體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療中發(fā)揮重要作用[34]。有研究表明，外泌體microRNA可以有效區(qū)分不同亞型的NSCLC，如腺癌和鱗癌[35]，因此有研究提出外泌體來源microRNA可作為NSCLC的潛在診斷生物標(biāo)志物[36]。Gao等[17]利用NGS測序技 術(shù)分析 了254例早期肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）患者、76例良性肺結(jié)節(jié)（benign pulmonary nodules,BPNs）患者和130名健康對照患者（healthy control patients,HCs）血漿樣本中外泌體microRNA表達(dá)譜，建立診斷特征模型并進(jìn)行多中心驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-106b-3p、miR-125a-5p、miR-3615和miR-450b-5p組成的診斷特征組合可用于LUAD的早期檢測。Zhang等[36]同樣利用血漿外泌體來源microRNA構(gòu)建SVM(support vector machine)診斷模型并驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)SVM模型可準(zhǔn)確區(qū)分肺良性結(jié)節(jié)和肺惡性磨玻璃結(jié)節(jié)。Yang等[37]使用血清外泌體提取試劑盒從外周血血清中提取外泌體，然后通過RT-PCR檢測了miR-21和Let-7a水平，結(jié)果表明miR-21/Let-7a在NSCLC患者的AUC曲線下面積為0.7539；靈敏度和特異度分別為56.00%和82.61%，具有較好的鑒別診斷效能。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，LDCT在準(zhǔn)確鑒別診斷肺部結(jié)節(jié)良惡性方面存在較大挑戰(zhàn)，尤其是直徑＜10mm的肺小結(jié)節(jié)。液體活檢技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為肺小結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷提供了一種新的無創(chuàng)方法。microRNA作為液體活檢的重要成員，可作為LDCT聯(lián)合診斷的實(shí)驗(yàn)室手段來提高LDCT診斷效能。然而，目前microRNA相關(guān)研究尚存在一定的局限性，如：（1）大多數(shù)為樣本量較小的回顧性研究對結(jié)論的推論有一定影響；（2）手術(shù)的良性肺結(jié)節(jié)患者比例相對較低，會降低診斷效率[32]。（3）大多數(shù)研究為單中心驗(yàn)證診斷模型，需要多中心及更大樣本量的驗(yàn)證。隨著，用于結(jié)直腸癌早期篩查miR-92a檢測試劑盒及肝癌microRNAs檢測組合試劑盒的上市，特征性microRNA作為不同癌種早期篩查的臨床前景也越來越被看好。相信，隨著microRNA在區(qū)分良惡性肺小結(jié)節(jié)方面研究的不斷積累，未來microRNA有望與LDCT聯(lián)合用于肺部結(jié)節(jié)的良惡性鑒別診斷，以期提高肺小結(jié)節(jié)的鑒別診斷效率。