母胎界面外泌體的生理作用及其參與病理妊娠的研究進(jìn)展

方 正，董 杰，王曉紅

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 婦產(chǎn)科，陜西西安 710032

母胎界面是指蛻膜與胚胎外組織之間形成的結(jié)構(gòu)，是孕期介導(dǎo)母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫耐受的重要結(jié)構(gòu)。胎兒側(cè)以滋養(yǎng)細(xì)胞為中心，在胎兒與底蛻膜之間形成胎盤(pán)，是面對(duì)母體免疫細(xì)胞的“第一道防線”[1]。母體側(cè)主要是指底蛻膜，是子宮內(nèi)膜經(jīng)過(guò)一系列分子事件后蛻膜化形成的特殊類(lèi)型的組織。母胎界面細(xì)胞間的通訊交流在妊娠的建立與維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)我們更清楚地認(rèn)識(shí)到，外泌體作為一種新型的細(xì)胞間通訊工具，參與維持整個(gè)孕期的母胎界面穩(wěn)態(tài)，并且在病理妊娠中發(fā)生改變。本文對(duì)外泌體在母胎界面中生理作用與病理妊娠中改變的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的生物發(fā)生 外泌體是直徑30 ～ 150 nm(平均直徑100 nm)的具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)的“茶杯狀”囊泡，在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用[2-3]。幾乎所有的真核細(xì)胞都會(huì)通過(guò)向外“出芽”的方式分泌外泌體[4]。首先，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成杯狀結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程使得細(xì)胞膜外側(cè)的液體和一些“貨物”如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、代謝物、小分子、離子與細(xì)胞膜表面蛋白一同進(jìn)入細(xì)胞，形成早期胞內(nèi)體(early-sorting endosome，ESE)。ESE也可與細(xì)胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生融合，裝載細(xì)胞內(nèi)貨物。隨后，ESE形成晚期內(nèi)體、多泡小體和管腔內(nèi)囊泡，同時(shí)伴隨外泌體貨物的進(jìn)一步裝載和自身修飾。最后，管腔內(nèi)囊泡通過(guò)多泡小體錨定蛋白錨定于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，釋放出細(xì)胞，形成外泌體[5-6]。在外泌體發(fā)生過(guò)程中，需要多種蛋白協(xié)助，如內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體、多配體蛋白聚糖、凋亡連鎖基因產(chǎn)物2相互作用蛋白X和腫瘤易感基因101等[2,7]。同時(shí)，由于細(xì)胞膜的參與，CD9、CD63、CD81和CD37等四次跨膜蛋白也表達(dá)于外泌體膜，對(duì)于外泌體的鑒定具有重要意義。

1.2 外泌體的內(nèi)容物及其功能 外泌體的內(nèi)容物包括DNA、RNA、脂質(zhì)、代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)等[5,8]。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體可攜帶不同的“貨物”，可以用于鑒定其細(xì)胞或組織的起源，如胎盤(pán)來(lái)源的外泌體特異性表達(dá)胎盤(pán)堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)[9]。值 得 注意的是，外泌體攜帶的“貨物”與細(xì)胞本身內(nèi)容物的含量并不平行[10]，并且同一細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體也具有異質(zhì)性[11-12]，這從側(cè)面反映了外泌體是細(xì)胞經(jīng)過(guò)選擇后的產(chǎn)物。外泌體富集糖蛋白和跨膜蛋白，包括糖蛋白Ib、P選擇素和整合素等，這可能與外泌體與細(xì)胞間通訊的黏附事件相關(guān)。除此之外，外泌體攜帶的核酸也在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。外泌體攜帶長(zhǎng)度19 ～ 6 000 nt的至少10種類(lèi)型RNA。小RNA包括miRNA、tRNA、與PIWI蛋白作用RNA、核小RNA、核仁小RNA以及一些RNA碎片[13-14]。長(zhǎng)鏈RNA包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA、信使RNA、環(huán)狀RNA[15]，這三者與miRNA構(gòu)成內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 miRNA在外泌體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。

2 外泌體在母胎界面中的作用

2.1 胚胎來(lái)源外泌體促進(jìn)母胎界面建立免疫耐受和胚胎成功種植 胚胎來(lái)源的外泌體最早在牛、小鼠和豬的胚胎培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)[16-17]，之后Giacomini等[18]又在人胚胎培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)。胚胎來(lái)源的外泌體富含CD9、CD63和CD81外泌體標(biāo)志蛋白。除此之外，胎盤(pán)來(lái)源外泌體具有合體滋養(yǎng)細(xì)胞特異性蛋白PLAP和滋養(yǎng)細(xì)胞特異性蛋白人白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)[19-20]。在母體外周血中，通過(guò)上述兩種蛋白可特異性地鑒定分離出胎盤(pán)來(lái)源外泌體，并且胎盤(pán)外泌體的量可用來(lái)預(yù)測(cè)胎兒生長(zhǎng)情況，判斷妊娠結(jié)局[21]。

輔助生殖技術(shù)過(guò)程中，Giacomini等[18]在第3天和第5天的人胚胎培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了含膜結(jié)合型和可溶型HLA-G的外泌體，并且在清除培養(yǎng)基中的外泌體后，HLA-G的含量低于檢測(cè)下限。這一發(fā)現(xiàn)提示我們存在于培養(yǎng)基上清中的絕大多數(shù)HLA-G可能是以外泌體或囊泡形式與靶細(xì)胞互作的[18]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人胚胎來(lái)源的外泌體可以被蛻膜內(nèi)的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞攝取，重塑局部免疫環(huán)境。HLA-G誘導(dǎo)蛻膜髓系來(lái)源細(xì)胞向耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞分化后，樹(shù)突狀細(xì)胞將HLA-G呈遞給dNK和M?。在孕早期，dNK含量可由未孕期的20%增長(zhǎng)到40%，進(jìn)入分泌期后，dNK含量可達(dá)到70% ～ 80%。與外周血中NK細(xì)胞表現(xiàn)出的殺傷作用不同，dNK主要表現(xiàn)為分泌各種細(xì)胞因子，如干擾素-γ、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-8等。滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的HLA-C、HLA-E、HLAG與dNK表達(dá)的殺傷性免疫球蛋白樣受體(killing immunoglobulin receptors，KIR)結(jié) 合，促 進(jìn)dNK分泌促炎因子和血管生成因子，抑制dNK的細(xì)胞毒作用。HLA-G與dNK表面的KIR2DL4受體結(jié)合，促進(jìn)dNK分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)血管重塑和維持正常妊娠[22]。蛻膜巨噬細(xì)胞(decidual macrophages，dM?)占蛻膜免疫細(xì)胞的20% ～ 25%，是蛻膜內(nèi)主要的抗原提呈細(xì)胞。HLA-G與dM?表面的免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄子2作用，促進(jìn)dM?向M2型極化，分泌IL-10、趨化因子CC基元配體2(chemokine C-C motif ligand 2，CCL2)和CCL18，表現(xiàn)出調(diào)節(jié)免疫和抗炎作用。M?既可以促進(jìn)螺旋動(dòng)脈的重建和滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，又可以通過(guò)分泌VEGF和基質(zhì)金屬蛋白酶9促進(jìn)血管新生和蛻膜組織重構(gòu)，輔助胚胎成功種植。

研究表明，將胚胎來(lái)源的外泌體添加到胚胎培養(yǎng)基中，可以挽救囊胚形成率，提高胚胎質(zhì)量，促進(jìn)胚胎后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育；在小鼠實(shí)驗(yàn)中，胚胎來(lái)源外泌體處理過(guò)的胚胎可以提高植入率，增強(qiáng)植入能力[23]。

2.2 母體來(lái)源的外泌體促進(jìn)胚胎著床 母體在整個(gè)胚胎發(fā)育的過(guò)程都分泌外泌體促進(jìn)胚胎發(fā)育。在受精卵發(fā)育的第一站——輸卵管，外泌體就開(kāi)始了對(duì)胚胎的支持[24]。在牛和小鼠的實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)輸卵管來(lái)源的外泌體中存在多種與細(xì)胞代謝、免疫調(diào)控和細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白。更重要的是，在輸卵管液中存在胚胎營(yíng)養(yǎng)因子，這提示我們輸卵管參與早期胚胎發(fā)育。不僅如此，外泌體因其優(yōu)越的穿透性和靶向遞送功能，可成功穿越透明帶并被胚胎攝取。研究顯示，外泌體可影響小鼠胚胎卵裂率，促進(jìn)胚胎細(xì)胞增殖，提高胚胎質(zhì)量，并可延長(zhǎng)胚胎體外存活時(shí)間[25]。

植入時(shí)，胚胎與母體的交流是雙向的。除可溶性細(xì)胞因子外，母體蛻膜上皮細(xì)胞也分泌外泌體影響胚胎種植。在胚胎植入前，蛻膜上皮細(xì)胞外泌體可激活子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡途徑Bcl-2、Bax、Caspase-3和Tp53基因的表達(dá)；而胚胎植入后，外泌體主要上調(diào)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白如Vcam1的表達(dá)，輔助胚胎著床后的進(jìn)一步黏附[26]。除上皮細(xì)胞外，人蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的外泌體可以上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞鈣黏蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)侵襲功能[27]；并可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管，可能在血管生成中發(fā)揮重要作用。蛻膜來(lái)源外泌體的以上作用，體現(xiàn)了蛻膜的容受性和著床中的旁分泌作用。

3 外泌體與病理妊娠

胚胎來(lái)源外泌體在病理妊娠中起重要作用。已有研究表明，在妊娠過(guò)程中，孕婦外周血中外泌體會(huì)大量增加，并且在孕婦外周血中鑒定出了含HLA-G與PLAP的外泌體，這說(shuō)明孕婦外周血中含有胎盤(pán)來(lái)源外泌體[28]。在不同疾病中，孕婦外周血中外泌體攜帶的不同貨物的組學(xué)分析已經(jīng)證實(shí)其種類(lèi)和數(shù)量的變化可能直接影響靶細(xì)胞的功能，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[29-30]。

3.1 外泌體與子癇前期 子癇前期是妊娠期發(fā)病率和死亡率最高的疾病，發(fā)病率在所有孕婦為5% ～ 7%，每年可造成全世界7萬(wàn)孕婦和50萬(wàn)胎兒死亡，也是早產(chǎn)的重要病因之一[31]。但其發(fā)病原因尚不明確，有研究認(rèn)為是胎盤(pán)淺著床導(dǎo)致胎盤(pán)低灌注，進(jìn)而導(dǎo)致高血壓和蛋白尿[32]。子癇前期患者與健康患者胎盤(pán)外泌體的組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者外泌體中具有較高水平的磷脂酰絲氨酸和較低水平的磷脂酸、磷脂酰甘油、神經(jīng)節(jié)苷脂甘露糖苷；并且合胞素2蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9等功能蛋白表達(dá)量均下降[33-34]。上述蛋白的降低均可影響螺旋動(dòng)脈的重塑，影響胎兒生長(zhǎng)，導(dǎo)致胎盤(pán)淺著床和血流量下降，最終導(dǎo)致子癇的發(fā)生。在妊娠的前3個(gè)月，子癇前期患者血漿外泌體中特定的miRNA可能作為預(yù)測(cè)疾病的分子標(biāo)志物。子癇前期患者血漿外泌體中高表達(dá)miR-1269[35]，其下調(diào)叉頭盒子O1基因(forkhead box O1 gene，F(xiàn)OXO1)的表達(dá)，而FOXO1蛋白會(huì)影響胚胎著床，可能造成胎盤(pán)低灌注[36]；子癇前期患者外泌體中高表達(dá)的miR-525-5p[35]可抑制血管活性腸肽進(jìn)而降低機(jī)體抗炎作用，這可能與子癇前期全身小動(dòng)脈血管內(nèi)皮炎癥相關(guān)。除此之外，在孕晚期子癇前期患者血漿外泌體中，內(nèi)皮一氧化氮合酶活性降低[37]，導(dǎo)致患者血管調(diào)節(jié)能力減弱。

3.2 外泌體與妊娠期糖尿病 妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期首次發(fā)生糖耐量異常，發(fā)生率為13.0% ～ 20.9%，且呈逐年增高趨勢(shì)[38]。GDM會(huì)導(dǎo)致胎兒處于高糖、高胰島素和缺氧環(huán)境中，導(dǎo)致絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞釋放大量的外泌體[39-40]，并且這些外泌體表現(xiàn)為促炎作用[28]。有研究表明，GDM患者血漿中胎盤(pán)外泌體的濃度顯著高于孕周匹配的正常妊娠女性，并且可能與胎兒的體質(zhì)量呈正相關(guān)[41]；并且母胎界面局部外泌體的差異化miRNA表達(dá)也會(huì)體現(xiàn)在患者血漿外泌體中。GDM患者早孕期血漿外泌體差異化miRNA主要參與胰島素和葡萄糖調(diào)節(jié)通路，包 括miR-122、miR-132、miR-136、miR-182、miR-210、miR-29和miR-342等[42]；在GDM診斷時(shí)(22 ～ 28周)的血漿外泌體中，主要表現(xiàn)為與胰島素敏感度相關(guān)蛋白的差異表達(dá)，如鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)蛋白激酶2β和妊娠相關(guān)血漿蛋白A[43]。GDM患者與正常體質(zhì)量指數(shù)患者血漿外泌體相比，可增加內(nèi)皮細(xì)胞促炎因子的釋放；在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，血漿外泌體改變了骨骼肌miRNA表達(dá)譜和胰島素相關(guān)通路[44]，提示我們GDM患者血漿外泌體在調(diào)節(jié)妊娠期葡萄糖穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。但考慮到部分GDM患者體質(zhì)量指數(shù)較高，所以可能需要更多的縱向比較數(shù)據(jù)和母胎界面原位外泌體數(shù)據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

大量的研究結(jié)果證實(shí)了母胎界面外泌體可以輔助胚胎種植和維持妊娠，并在妊娠期特有疾病中發(fā)生顯著改變。前期的眾多研究數(shù)據(jù)來(lái)源于非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或細(xì)胞系，較少來(lái)源于人的原代組織。因此，如何提取可以更好反映細(xì)胞在體情況的外泌體，是我們需要解決的問(wèn)題。在妊娠期特有疾病中，已經(jīng)報(bào)道了孕婦外周血中胎盤(pán)來(lái)源外泌體的異常改變，但將其作為生物標(biāo)志物用于臨床檢測(cè)仍需要更多的樣本量來(lái)驗(yàn)證。同時(shí)，外泌體還可預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能，在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，使用外泌體作為標(biāo)志物進(jìn)行臨床檢驗(yàn)，將是一個(gè)前景廣闊的重要無(wú)創(chuàng)檢測(cè)手段。