去線性泛素化酶OTULIN通過NF-κB通路調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞死亡的研究進展

范俊梅，張雪洛，陳艷花，張俊坤，畢星宇，王 軍，武學(xué)清

1 山西省婦幼保健院，山西太原 030013；2 太鋼總醫(yī)院，山西太原 030000

泛素化是指泛素蛋白或泛素鏈通過共價鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，是真核生物蛋白翻譯后修飾的重要方式。一種或幾種泛素蛋白與底物結(jié)合后可以發(fā)揮多種細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，如蛋白酶降解、細(xì)胞膜運輸、DNA修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，表現(xiàn)為細(xì)胞存活和分化、炎癥、免疫反應(yīng)等多種生理活動。線性泛素化修飾是近年新發(fā)現(xiàn)的一種特殊類型的泛素化修飾方式。OTULIN是目前發(fā)現(xiàn)的可特異性降解線性泛素鏈的去泛素化酶，可通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞死亡[1]。本文就OTULIN基于NF-κB通路調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞死亡的研究進展做一綜述。

1 泛素和線性泛素化修飾

泛素由76個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為8.5 kU，包含7個高度保守的賴氨酸(Lysine K)。泛素本身可以自泛素化，從而產(chǎn)生多聚泛素(Poly-Ub)鏈，特異性識別不同的底物蛋白[2]。泛素鏈內(nèi)部賴氨酸殘基與泛素分子C末端的甘氨酸G連接，根據(jù)連接方式不同，分為 K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63，產(chǎn)生不同的生理作用，其中K48和K63在NF-κB通路的激活中起重要作用[3]。泛素甲硫氨酸Met1的氨基與另一泛素甘氨酸的羧基相連，形成線性泛素鏈(linear ubiquitin/Met1-linked ubiquitin chains/Met1-Ub)，是一種特殊類型的泛素化修飾方式，在先天性免疫和抑制炎癥反應(yīng)等多種過程中發(fā)揮重要作用[4]。泛素化是泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3催化的酶級聯(lián)反應(yīng)。

2 OTULIN的分子結(jié)構(gòu)

目前已知的特異性去線性泛素化酶包括OTULIN和CYLD。OTULIN，也稱為Gumby/FAM105B，是脫泛素酶家族(deubiquitinases，DUBs)卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶亞族(ovarian tumor related proteases，OTUs)的成員，僅作用于Met1-Ub內(nèi)部的連接點，對線性泛素化修飾蛋白的泛素化水平進行調(diào)節(jié)，而對未泛素化的蛋白無直接作用[3]。人類OTULIN編碼基因位于染色體5p15.2，OTULIN蛋白由352個氨基酸組成，包含3個重要結(jié)構(gòu)域：1)Met1-Ub結(jié)合域，是OTULIN和Met1-Ub鏈的連接區(qū)域，此結(jié)構(gòu)突變會導(dǎo)致OTULIN對Met1-Ub的親和力降低，從而降低OTULIN活性；2)Cys-His-Asn催化中心，該結(jié)構(gòu)位于OTULIN蛋白的OTU結(jié)構(gòu)域，由Asn341、His339和Cys129構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)催化中心，且與OTULIN的活性構(gòu)象密切相關(guān)，OTULIN催化結(jié)構(gòu)域在物種間高度保守；3)N-末端類PIM結(jié)構(gòu)，OTULIN可與HOIP的N-末端PUB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，故稱為PIM(PUB-interaction motif)，該結(jié)構(gòu)與HOIP的PUB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合具有特異性和高親和力[1]。

3 OTULIN通過LUBAC和NF-κB通路調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞死亡

線性泛素鏈組裝復(fù)合體(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)于2006年由Kazuhiro等首次提出，認(rèn)為LUBAC由HOIL-1L和HOIP組成(也分別稱為 RBCK1和RNF31)，2011年Tokunaga發(fā)現(xiàn)Sharpin也是LUBAC的組成部分之一，最終LUBAC被定義為包含Sharpin、HOIL-1L和HOIP的復(fù)合體。LUBAC是目前已知的唯一產(chǎn)生Met1-Ub的E3泛素連接酶，研究發(fā)現(xiàn)HOIP具有自抑制的功能，但與Sharpin、HOIL-1L結(jié)合，可以釋放 HOIP 自抑制的活性[5]。

Met1-Ub通過NF-κB通路引起免疫反應(yīng)或?qū)е录?xì)胞死亡[1,6]，故LUBAC在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和抗細(xì)胞死亡方面發(fā)揮作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Sharpin基因無義突變致小鼠出現(xiàn)慢性增生性皮炎，HOIL-1突變導(dǎo)致人類機體產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥，表明LUBAC在控制感染和炎癥的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。HOIP是LUBAC的催化中心，敲除HOIP基因的小鼠胚胎因血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡，出現(xiàn)血管生成缺陷，成為導(dǎo)致胚胎死亡的主要原因，但腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)的消融可防止這種現(xiàn)象發(fā)生，提示LUBAC及其線性泛素鏈?zhǔn)峭ㄟ^防止TNFR1介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞死亡維持胚胎發(fā)育過程中血管的完整性[9]。LUBAC和其線性泛素鏈缺陷，可以使TNFR1信號將從促炎激活信號轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)細(xì)胞死亡信號[8-9]。LUBAC可以通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子κB關(guān)鍵調(diào)節(jié)器(NF-κB essential modulator，NEMO)和受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIPK1；NF-κB通路的關(guān)鍵調(diào)控因子)等的線性泛素化，參與NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)[10]。OTULIN可以通過保守的PIM結(jié)構(gòu)域與HOIP的PUB結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，進而參與對NF-κB通路的調(diào)節(jié)[3,11]。LUBAC的過度表達會增強NF-κB的活性，LUBAC組分的敲除導(dǎo)致NF-κB活性降低[9]。OTULIN通過限制LUBAC介導(dǎo)的NEMO和RIPK1等的線性泛素化，抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，被認(rèn)為是NF-κB通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[12]。若HOIP-OTULIN相互作用喪失，會導(dǎo)致限制LUBAC誘導(dǎo)的NF-κB通路激活失敗，提示OTULIN對LUBAC誘導(dǎo)的NF-κB通路的活性調(diào)節(jié)需要HOIP與OTULIN結(jié)合才能實現(xiàn)[8]。單獨用TNF對OTULIN耗竭的角質(zhì)細(xì)胞進行刺激，出現(xiàn)細(xì)胞的LUBAC活性受到抑制，表現(xiàn)為NEMO和RIPK1的Met1-Ub降低，NF-κB通路活性降低，細(xì)胞死亡增加。同時，OTULIN失活，增加LUBAC的自動泛素化程度，從而破壞NF-κB激活所需的TNFR1相關(guān)復(fù)合物Ⅰ(TNFR1-associated complex Ⅰ)即復(fù)合體Ⅰ的穩(wěn)定性，促進細(xì)胞死亡引發(fā)信號復(fù)合體(death initiating signaling complex，DISC)即復(fù)合體Ⅱa的形成，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此認(rèn)為OTULIN主要是通過抑制LUBAC的自動泛素化維持LUBAC的功能，而非抑制LUBAC的活性[7,13-14]。調(diào)控過程見圖1。

圖 1 OTULIN對NF-κB信號通路的調(diào)控示意圖Fig.1 Diagram of OTULIN regulating NF-κB pathway

4 OTULIN調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路參與炎癥、免疫反應(yīng)

4.1 TNF-α可誘導(dǎo)NF-κB通路的激活 NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，由二聚體組成，可被多種刺激激活。活化NF-κB參與調(diào)節(jié)天然免疫和適應(yīng)性免疫的過程，且與胚胎著床、早期胚胎發(fā)育等過程密切相關(guān)[15]。TNF-α是一種多效性細(xì)胞因子，參與一系列生理過程，特別是炎癥、細(xì)胞生存和細(xì)胞死亡。TNF-α是NF-κB的強烈誘導(dǎo)劑，可以使巨噬細(xì)胞和組織中的NF-κB活性增強。NF-κB的活化可引起具有κB結(jié)合位點基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因大多數(shù)參與炎癥、免疫應(yīng)答和細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)。NF-κB信號通路的過度活化參與人類妊娠丟失、感染性休克、腫瘤、哮喘、炎癥性腸病、腎小球腎炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生。TNF-α激活其受體TNFR1后，形成跨細(xì)胞膜的多聚蛋白復(fù)合物TNFR1-SC，即TNFR1相關(guān)復(fù)合物Ⅰ，該復(fù)合物由TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TNFR1 associated death domain，Tradd)、TNFR相 關(guān) 因 子2(TNFR associated factor 2，TRAF2)、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1/2(cell inhibitor of apoptosis protein 1/2，cIAP1/2)和RIPK1組成，進而招募LUBAC。LUBAC產(chǎn)生的 Met1-Ub修飾RIPK1和NEMO形成NEMORIPK1復(fù)合物，使得IkB激酶復(fù)合體(IkB kinase，IKK)被激活，激 活的IKK可以磷酸 化IκBα蛋白，使其被泛素化，被蛋白酶體降解，從而釋放出NF-κB，游離NF-κB二聚體(最常見的是p50/p65異二聚體)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，啟動相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]。

4.2 OTULIN突變影響NF-κB信號通路發(fā)揮調(diào)控作用 OTULIN通過阻斷LUBAC形成的Met1-Ub抑制NF-κB信號通路的激活[12]。OTULIN不同的點突變可能對細(xì)胞中TNF信號和NF-κB通路產(chǎn)生不同的反應(yīng)。OTULIN相關(guān)自身炎癥反應(yīng)綜合征(OTULIN-related autoinflammatory syndrome，ORAS)，主要由脫泛素酶OTU結(jié)構(gòu)域的純合錯義突變(p.L272P和p.Y244C)和移碼突變(p.G174Dfs*2)所致[11]，主要表現(xiàn)為嬰兒出生后的全身炎癥反應(yīng)，最后均進展為復(fù)發(fā)性結(jié)節(jié)性脂膜炎，并伴不同程度的中性粒細(xì)胞浸潤、復(fù)發(fā)性發(fā)熱、生長發(fā)育不良、關(guān)節(jié)疼痛腫脹、血清免疫球蛋白和自身抗體水平升高等。p.Y244C和p.G174Dfs*2突變的ORAS患者NF-κB信號通路明顯激活，且激活程度與患者癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，OTULIN含量與體內(nèi)NF-κB信號激活程度呈負(fù)相關(guān)[11]。此外，OTULIN基因突變患者細(xì)胞內(nèi)Met1-Ub水平明顯上升，抗TNF治療可以逆轉(zhuǎn)ORAS患者的炎癥狀態(tài)[11,14]。對于OTULIN Gly281Arg突變所致的ORAS患者來說，成纖維細(xì)胞中OTULIN的丟失導(dǎo)致LUBAC水平降低和對TNF反應(yīng)減弱，與OTULIN缺乏的單核細(xì)胞中TNF信號和NF-κB激活增加相反。C129A突變的OTULIN仍可導(dǎo)致NF-κB活化程度降低，推測突變的OTULIN催化活性并未完全喪失，結(jié)合泛素鏈發(fā)揮NF-κB信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)[16]。但OTULIN缺乏的成纖維細(xì)胞和OTULIN缺乏的單核細(xì)胞都對TNF誘導(dǎo)的死亡敏感，ORAS患者損傷皮膚中細(xì)胞凋亡明顯存在，移植造血干細(xì)胞可以完全消除機體的炎癥反應(yīng)，故認(rèn)為ORAS的發(fā)病機制涉及高炎性免疫細(xì)胞和TNF誘導(dǎo)的相關(guān)細(xì)胞死亡[14]。

4.3 OTULIN和LUBAC缺乏引起細(xì)胞死亡8周齡OTULIN缺乏的小鼠，肝病理可以逐漸經(jīng)過脂肪變性-脂肪性肝炎-纖維化-癌前病變，到7 ～ 12月齡時發(fā)展為肝細(xì)胞癌， 提示OTULIN可以防止小鼠肝細(xì)胞的死亡、炎癥和代謝紊亂，類似于ORAS患者[17]。有研究顯示，OTULIN缺陷引起小鼠肝細(xì)胞中Met1-Ub累積，使得TNF對NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制，肝細(xì)胞對Caspase依賴的外源性凋亡敏感，進而導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡，因此OTULIN在保護肝細(xì)胞免于死亡、防止慢性肝炎進展為肝癌方面發(fā)揮重要作用[4]。但OTULIN缺乏的肝病理結(jié)果與TNFR1信號無關(guān)，這與ORAS患者不同[17]。OTULIN缺乏的人和小鼠炎癥的主要驅(qū)動力是TNF[9,11]，但OTULIN缺乏的細(xì)胞反應(yīng)存在明顯的細(xì)胞特異性，如在髓系細(xì)胞中，OTULIN缺乏導(dǎo)致LUBAC高表達和NF-κB激活[11,14]。而在成纖維細(xì)胞，OTULIN缺失致LUBAC降解和TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[7,14]。關(guān)于T細(xì)胞和B細(xì)胞中OTULIN是否參與了Met1-Ub募集化過程仍存在爭議[1,5,11,18]。

5 OTULIN和LUBAC功能喪失與細(xì)胞死亡

人和小鼠LUBAC的功能喪失和亞型突變會導(dǎo)致一種潛在且致命的早發(fā)性炎癥性疾病，并伴有免疫缺陷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，發(fā)展為類似于LUBAC受損患者的自體炎癥綜合征[11,14]。在妊娠小鼠中，OTULIN的功能異常導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡，血管生成受損，最終導(dǎo)致胚胎死亡，其表型與LUBAC功能缺陷相似[7]。OTULIN缺陷的成年小鼠在24 h內(nèi)即死亡[11]，考慮OTULIN和LUBAC通過不同的信號通路影響細(xì)胞的炎癥免疫反應(yīng)和細(xì)胞死亡[14]，而且OTULIN和LUBAC具有廣泛的相互作用蛋白，遠遠超過目前研究的認(rèn)知[18]。

在TNF-α刺激的OTULIN缺乏細(xì)胞中，RIPK1線性泛素化水平升高的同時，也導(dǎo)致RIPK1賴氨酸(Lys)63連接的泛素化增加，而使用小分子HOIP抑制劑抑制Met1-Ub水平，會進一步促進OTULIN缺陷細(xì)胞的Lys63泛素化水平升高，促進細(xì)胞死亡，表明RIPK1線性泛素化促進細(xì)胞存活，而RIPK1的Lys63連接泛素化可促進細(xì)胞死亡[19]。ORAS患者角質(zhì)細(xì)胞中OTULIN的耗竭抑制了LUBAC在TNF信號中的活性，但RIPK1和Lys63-Ub水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。OTULIN過表達通過對Met1-Ub的影響抑制NEMO-RIPK1復(fù)合物的形成，從而使細(xì)胞對TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感[20]。OTULIN過表達也可激活JNK通路促進細(xì)胞死亡誘導(dǎo)過程中的兩個關(guān)鍵調(diào)控因子PARP和Caspase-3裂解，進一步促進細(xì)胞的死亡。另外，在OTULIN基因敲除細(xì)胞中，也會出現(xiàn)JNK和c-Jun磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故認(rèn)為OTULIN的過度表達和敲除都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而調(diào)節(jié)的關(guān)鍵在于線性泛素鏈在細(xì)胞中的表達水平[1]。同時OTULIN在Tyr-56處過磷酸化，損害HOIP-OTULIN結(jié)合，改變RIPK1的泛素化動態(tài)，產(chǎn)生由RIPK1、FADD和Caspase-8組成的TNFRⅡa而廣泛地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。

此外，有研究在缺血性腦卒中大鼠模型中證實電針治療可以通過調(diào)節(jié)OUTLIN表達控制NF-κB通路的活性，從而減輕腦卒中對神經(jīng)細(xì)胞功能和膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)從而發(fā)揮腦保護作用[21]，提示OUTLIN可作為一個潛在治療靶點。此外OUTLIN也有調(diào)控自噬和mTOR信號通路的作用[22-23]，但具體機制尚不清楚。

6 結(jié)語

OTULIN作為一種新發(fā)現(xiàn)的特異性線性泛素鏈去泛素化酶，參與細(xì)胞的炎癥免疫反應(yīng)和細(xì)胞死亡等過程，OTULIN如何通過對Met1-Ub水平的影響參與細(xì)胞死亡過程及其對不同細(xì)胞的作用機制仍需進一步研究。另外，磷酸化的OTULIN是否及如何影響OTULIN的生理作用，如何參與細(xì)胞死亡的過程仍不清楚。鑒于OTULIN負(fù)性調(diào)控NF-κB通路的功能，在不良妊娠結(jié)局的預(yù)防和治療中，有可能作為NF-κB通路相關(guān)炎性疾病的治療靶點，為獲得理想的妊娠結(jié)局提供一種新方法。