石榴籽粗提物的提取工藝優(yōu)化及其對(duì)變異鏈球菌的抑菌作用研究

高 潔， 趙瑋欽，李玨丹，程 政

(1.陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué) 口腔醫(yī)院綜合科， 陜西 西安 710004；3.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710054； 4.國土資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710054)

齲病是由附著在牙齒上的特定細(xì)菌、唾液等多種因素共同作用下形成的慢性感染類疾病[1]。作為公認(rèn)的致齲菌，變異鏈球菌與齲病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)。多年來，學(xué)者們致力于尋找安全有效的抑制變異鏈球菌、同時(shí)又不破壞口腔正常菌群的防齲藥物，如氟化物、氯己定和免疫制劑等，但上述藥物因存在副作用、毒性、制作工藝復(fù)雜以及生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)，在實(shí)際推廣應(yīng)用中均受到一定的限制[2]。研究發(fā)現(xiàn)，天然植物提取物具有抑制微生物的作用[3]，一些天然植物提取物可以減少細(xì)菌在牙齒表面的黏附，從而達(dá)到防齲的目的[4]。石榴是一種常見的天然植物，約50%的質(zhì)量是由石榴皮和石榴籽組成的，其中，石榴皮提取物不僅對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用[5]，還對(duì)變異鏈球菌等口腔病原菌具有抑制作用[6]，但目前對(duì)石榴籽提取物的研究相對(duì)較少。鑒于此，作者采用超聲輔助法提取石榴籽粗提物，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究石榴籽粗提物對(duì)變異鏈球菌的抑制作用,為天然植物提取物用于齲病防治研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

石榴籽,陜西臨潼；變異鏈球菌UA159，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院；腦心浸液肉湯(BHI)，青島海博生物科技有限公司。

正己烷、無水乙醇,天津富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯,廣東光華科技股份有限公司；硫酸亞鐵、氯化鈉,鄭州派尼化學(xué)試劑廠；水楊酸，天津天力化學(xué)試劑有限公司；30%過氧化氫，天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)，山東齊都藥業(yè)有限公司；瓊脂粉、酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氨芐青霉素，北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

高速多功能粉碎機(jī)，永康鉑歐五金制品有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉豪城實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，金壇金祥龍電子有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；單人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱，中美美菱低溫科技股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，無錫遠(yuǎn)路貿(mào)易有限公司；電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.2 石榴籽粗提物的提取

1.2.1 石榴籽的預(yù)處理

將石榴籽用蒸餾水洗凈，置于70 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，置于干燥的錐形瓶中密封保存，備用。

1.2.2 提取方法的選擇

超聲波輔助提取法：稱取5.0 g石榴籽粉末于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶20(g∶mL，下同)加入100 mL無水乙醇，瓶口用棉塞塞緊，在30 ℃、超聲波功率100 W下超聲提取30 min；抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑；置于70 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，得粉末狀粗提物，稱重，按下式計(jì)算石榴籽粗提物得率：

式中：m1為燒杯和石榴籽粗提物的質(zhì)量，g;m2為燒杯的質(zhì)量，g;m為石榴籽粉末的質(zhì)量，g。

浸提法：稱取5.0 g石榴籽粉末于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶20加入100 mL無水乙醇，瓶口用棉塞塞緊，充分混勻后，在30 ℃全溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩30 min，取出置于棕色瓶避光靜置18 h；抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑；置于70 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，得粉末狀粗提物，稱重，計(jì)算石榴籽粗提物得率。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化石榴籽粗提物的提取工藝，考察提取溶劑(無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g∶mL)、提取時(shí)間(30 min、60 min、90 min、120 min)、提取溫度(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃)、超聲波功率(10 W、40 W、70 W、100 W)對(duì)石榴籽粗提物得率的影響。

1.3 石榴籽粗提物的抑菌活性

1.3.1 菌懸液的制備

變異鏈球菌UA159凍干株在厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)(10%CO2、10%H2、80%N2)復(fù)蘇48 h，革蘭氏染色鏡檢菌落生長形態(tài)，確認(rèn)無污染后，將單個(gè)菌落接種到BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，采用紫外可見分光光度計(jì)將菌液濃度調(diào)至OD600=0.1，備用。將5 mL生理鹽水注入滅菌的150 mL錐形瓶中，再用滅菌的接種環(huán)刮取少量健康單菌落置于錐形瓶中，打散、搖勻，制成菌懸液。

1.3.2 菌體培養(yǎng)基的制備

BHI培養(yǎng)基的制備:稱取3.7 g BHI、1.8 g瓊脂，加入150 mL蒸餾水加熱溶解，高壓、121 ℃滅菌15 min，冷卻至約50 ℃，加入1 mL氯化血紅素、維生素K1溶液。

將上述BHI培養(yǎng)基從滅菌鍋中取出，往每個(gè)無菌培養(yǎng)皿中趁熱倒入約20 mL，靜置，冷卻凝固。將約50 ℃、45 mL的BHI培養(yǎng)基倒入菌懸液中，充分混合均勻，用移液槍移取約6 mL(含200 μL 變異鏈球菌UA159菌液)于每個(gè)培養(yǎng)皿中(將表面覆蓋均勻即可)，制成菌體培養(yǎng)基。

1.3.3 石榴籽提取液的制備

將石榴籽粗提物用蒸餾水配制成120 mg·mL-1的母液，按二倍稀釋法溶于菌體培養(yǎng)基中，然后稀釋成5個(gè)濃度梯度(30 mg·mL-1、15 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、3.75 mg·mL-1、1.875 mg·mL-1)的石榴籽提取液，121 ℃滅菌20 min。用含1 μg·mL-1氨芐青霉素的BHI培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照，不含石榴籽提取液的BHI培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.4 抑菌圈直徑的測定

采用牛津杯法測定抑菌圈直徑。在超凈工作臺(tái)上，各組試液各0.2 mL吸入牛津杯中，輕輕放入菌體培養(yǎng)基中，牛津杯放置一定要平穩(wěn)到位，以確保牛津杯內(nèi)物質(zhì)均勻擴(kuò)散，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置3～4個(gè)牛津杯。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，每組測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 最低抑菌濃度(MIC)的測定

取200 μL變異鏈球菌UA159菌液接種于BHI培養(yǎng)基上，37 ℃下于厭氧盒中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長。在深色背景下，肉眼觀察無細(xì)菌生長，即試管內(nèi)液體清亮無混濁或沉淀的最低藥物濃度為最低抑菌濃度。平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴籽粗提物的工藝優(yōu)化

與浸提法相比，超聲波輔助提取法的石榴籽粗提物得率較高、所耗時(shí)間較短。因此，選用超聲波輔助提取法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.1 提取溶劑對(duì)石榴籽粗提物得率的影響(表1)

表1 提取溶劑對(duì)石榴籽粗提物得率的影響Tab.1 Effect of extraction solvent on yield of crude extract from pomegranate seeds

由表1可知，以無水乙醇為提取溶劑時(shí)，石榴籽粗提物得率最高；以正己烷和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，石榴籽粗提物得率相差不大。因此，選擇無水乙醇為提取溶劑。

2.1.2 料液比對(duì)石榴籽粗提物得率的影響(圖1)

注：無水乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間40 min，提取溫度30 ℃，超聲波功率100 W圖1 料液比對(duì)石榴籽粗提物得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of crude extract from pomegranate seeds

由圖1可知，當(dāng)料液比從1∶10減小到1∶20時(shí)，石榴籽粗提物得率上升較快，從37.6%提高到41.2%；但當(dāng)料液比從1∶20減小到1∶25時(shí)，石榴籽粗提物得率下降到40.9%，呈緩慢下降趨勢。因此，選擇料液比為1∶20。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)石榴籽粗提物得率的影響(圖2)

注：無水乙醇為提取溶劑，料液比1∶20，提取溫度30 ℃，超聲波功率100 W圖2 提取時(shí)間對(duì)石榴籽粗提物得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of crude extract from pomegranate seeds

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間從30 min延長到90 min時(shí)，石榴籽粗提物得率上升較快，從39.2%提高到42.2%；但當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長到120 min時(shí)，石榴籽粗提物得率下降到42.0%，呈緩慢下降趨勢。因此，選擇提取時(shí)間為90 min。

2.1.4 提取溫度對(duì)石榴籽粗提物得率的影響(圖3)

注：無水乙醇為提取溶劑，料液比1∶20，提取時(shí)間90 min，超聲波功率100 W圖3 提取溫度對(duì)石榴籽粗提物得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of crude extract from pomegranate seeds

由圖3可知，當(dāng)提取溫度從35 ℃升高到45 ℃時(shí)，石榴籽粗提物得率從41.2%提高到44.6%，呈明顯上升趨勢；但當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高到65 ℃時(shí)，石榴籽粗提物得率下降到43.6%，呈緩慢下降趨勢。因此，選擇提取溫度為45 ℃。

2.1.5 超聲波功率對(duì)石榴籽粗提物得率的影響(圖4)

注：無水乙醇為提取溶劑，料液比1∶20，提取時(shí)間90 min，提取溫度45 ℃圖4 超聲波功率對(duì)石榴籽粗提物得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of crude extract from pomegranate seeds

由圖4可知，當(dāng)超聲波功率從10 W提高到40 W時(shí)，石榴籽粗提物得率從35.0%緩慢提高到36.2%；當(dāng)超聲波功率繼續(xù)提高到100 W時(shí)，石榴籽粗提物得率提高到44.6%，呈快速上升趨勢。因此，選擇超聲波功率為100 W。

2.2 石榴籽粗提物的抑菌活性(圖5)

由圖5可知，30 mg·mL-1、15 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1石榴籽粗提物組抑菌圈直徑分別為(13.0±1.4) mm、(11.0±1.2) mm、(10.0±2.1) mm；加入1 μg·mL-1氨芐青霉素的陽性對(duì)照組抑菌圈直徑為(21.0±2.1) mm；3.75 mg·mL-1、1.875 mg·mL-1石榴籽粗提物組、空白對(duì)照組均未見抑菌圈形成。與空白對(duì)照組相比，高濃度石榴籽粗提物組和各氨芐青霉素組均有極明顯的抑菌圈(P<0.01)，其中30 mg·L-1石榴籽粗提物組具有明顯的抑菌作用。石榴籽粗提物對(duì)變異鏈球菌UA159的最低抑菌濃度為7.5 mg·mL-1。

1～5:石榴籽粗提物濃度(mg·mL-1)分別為30、15、7.5、3.75、1.8751a～5a:1～5中加入1 μg·mL-1氨芐青霉素圖5 石榴籽粗提物的抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Experimental results of antibacterial activity of crude extract from pomegranate seeds

2.3 討論

有效抑制致齲菌的生長一直是齲病防治研究的重點(diǎn)，天然植物因具有來源豐富、抑菌作用良好且毒副作用小等優(yōu)勢逐漸成為研究熱點(diǎn)。石榴作為常見的天然植物，獲取便利，富含鞣質(zhì)類、黃酮類、生物堿及有機(jī)酸類化合物[7]，其中，酚類和黃酮類化合物具有抗菌、抗炎和抗氧化特性[8-10]，可降低氧化應(yīng)激，抑制脂質(zhì)過氧化和泡沫細(xì)胞生成，減少巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)攝取[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮中原花青素可以抑制變異鏈球菌生物膜的形成，并對(duì)其相關(guān)毒力基因的表達(dá)也有抑制作用。

3 結(jié)論

以石榴籽為原料，采用超聲輔助法提取石榴籽粗提物，確定最優(yōu)提取工藝條件為：以無水乙醇為提取溶劑、料液比1∶20(g∶mL)、提取時(shí)間90 min、提取溫度45 ℃、超聲波功率100 W，在此條件下，石榴籽粗提物得率為44.6%。石榴籽粗提物對(duì)變異鏈球菌UA159具有抑制作用，推測可能與石榴籽粗提物中多酚等活性成分有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究和探討。