響應(yīng)面法優(yōu)化淫羊藿總黃酮的提取工藝

孫國艷，李 華，楊長花，甘軍委，陶桂松，王啟明，楊 丹

(1.咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

淫羊藿為小槃科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉[1]，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效。淫羊藿含有黃酮類、多糖類、木質(zhì)素、揮發(fā)油、生物堿[2-3]等化學(xué)成分，其中黃酮類化合物是淫羊藿的主要活性成分，其對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等方面均有一定的作用[4]。淫羊藿總黃酮的提取方法有熱水提取法、醇加熱回流提取法、超聲輔助提取法、酸堿沉淀法、微波輔助提取法、超高壓提取法等[5]。通常采用正交實驗法[6-8]、響應(yīng)面法[9]優(yōu)化淫羊藿總黃酮的提取工藝，其中正交實驗法應(yīng)用較多。研究人員[10-12]以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇或甲醇為溶劑提取淫羊藿總黃酮，但在提取前未對淫羊藿中影響總黃酮測定結(jié)果的葉綠素成分進(jìn)行處理。鑒于此，作者先采用溶劑法除去淫羊藿中的葉綠素，再以淫羊藿總黃酮提取率為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化淫羊藿總黃酮的提取工藝。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；水楊酸鈉，三(羥甲基)氨基甲烷，焦性沒食子酸，乙醇，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁。

TU-1810型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP225D型電子天平，德國Sartorius。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取減壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.10 mg，置于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，得濃度為0.102 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；然后加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；再加入4 mL 4%NaOH溶液，靜置15 min，用70%乙醇定容至刻度[6]；以相同體積的70%乙醇替代蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，同法操作，測定505 nm處吸光度。以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程：A=10.578c+0.0043，R2=0.9991。表明，蘆丁濃度在0.010 2～0.051 0 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3 淫羊藿總黃酮提取率的測定

將淫羊藿藥材干燥，粉碎，過20目篩，備用。精密稱取淫羊藿粉末2 g，用濾紙包裹，置于索氏提取器中，加入乙醚150 mL，提取至提取液為無色；將濾紙連同藥渣揮干乙醚，置于圓底燒瓶中，按一定料液比加入提取溶劑，在一定溫度下提取一定時間，提取液過濾，濾液定容至100 mL，即得供試溶液。取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到總黃酮濃度，計算淫羊藿總黃酮提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取方法的選擇

取除去色素的淫羊藿粉末3份，加入70%乙醇25 mL，分別以水浴回流法、超聲提取法、超聲萃取法提取1次，提取時間60 min，過濾，濾液定容至100 mL，取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，結(jié)果見表1。

表1 提取方法對淫羊藿總黃酮提取率的影響Tab.1 Effect of extraction method on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

由表1可知，采用水浴回流法時，淫羊藿總黃酮提取率最高。故提取方法以水浴回流法為宜。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

取除去色素的淫羊藿粉末5份，分別加入25 mL 30%、40%、50%、60%、70%乙醇，水浴回流提取1次，提取時間60 min，過濾，濾液定容至100 mL，取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，結(jié)果見表2。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對淫羊藿總黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

由表2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，淫羊藿總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，總黃酮提取率最高。故乙醇體積分?jǐn)?shù)以50%為宜。

2.1.3 料液比的選擇

取除去色素的淫羊藿粉末5份，分別按料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16(g∶mL，下同)加入50%乙醇，水浴回流提取1次，提取時間60 min，過濾，濾液定容至100 mL，取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，結(jié)果見表3。

表3 料液比對淫羊藿總黃酮提取率的影響Tab.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

由表3可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，淫羊藿總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶14時，總黃酮提取率最高。故料液比以1∶14為宜。

2.1.4 提取次數(shù)的選擇

取除去色素的淫羊藿粉末3份，加入28 mL 50%乙醇，水浴回流分別提取1、2、3次，每次提取時間60 min，過濾，合并濾液，濾液定容至100 mL，取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，結(jié)果見表4。

表4 提取次數(shù)對淫羊藿總黃酮提取率的影響Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

由表4可知，隨著提取次數(shù)的增加，淫羊藿總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)提取2次時，總黃酮提取率最高。故提取次數(shù)以2次為宜。

2.1.5 提取溫度的選擇

取除去色素的淫羊藿粉末5份，加入28 mL 50%乙醇，提取溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，提取時間60 min，水浴回流提取2次，過濾，合并濾液，濾液定容至100 mL，取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，結(jié)果見表5。

表5 提取溫度對淫羊藿總黃酮提取率的影響Tab.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

由表5可知，當(dāng)提取溫度為80 ℃時，淫羊藿總黃酮提取率最高。故提取溫度以80 ℃為宜。

2.1.6 提取時間的選擇

取除去色素的淫羊藿粉末5份，加入28 mL 50%乙醇，提取溫度80 ℃，分別提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，水浴回流提取2次，過濾，合并濾液，濾液定容至100 mL，取供試溶液1 mL，按1.2方法測定505 nm處吸光度，結(jié)果見表6。

表6 提取時間對淫羊藿總黃酮提取率的影響Tab.6 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

由表6可知，隨著提取時間的延長，淫羊藿總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)提取時間為30 min時，總黃酮提取率最高。故提取時間以30 min為宜。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)為考察因素，以總黃酮提取率為評價指標(biāo)，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面實驗，響應(yīng)面實驗的因素與水平見表7，設(shè)計與結(jié)果見表8。

表7 響應(yīng)面實驗的因素與水平Tab.7 Factors and levels of response surface methodologies

表8 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.8 Design and results of response surface methodologies

使用Design-Expert 8.0.6 Tria軟件對表8數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次回歸模型方程：Y=2.02-0.017A+0.048B+0.036C+0.042D-0.016AB+0.034AC+0.00425AD-0.013BC+0.057BD+0.12CD-0.13A2-0.16B2-0.21C2-0.19D2。

回歸模型的方差分析見表9。

表9 方差分析Tab.9 Analysis of variance

2.2.2 各因素交互作用對淫羊藿總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖(圖1)

圖1 各因素交互作用對淫羊藿總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on extraction rate of total flavonoids from Epimedii Folium

響應(yīng)曲面越陡峭，說明該因素對淫羊藿總黃酮提取率的影響越顯著；響應(yīng)曲面平緩，則說明該因素對總黃酮提取率的影響不顯著[13]。由圖1可知，料液比與提取時間的交互作用對總黃酮提取的影響顯著；提取溫度與提取時間的交互作用對總黃酮提取率的影響高度顯著。

2.3 最優(yōu)工藝的確定及驗證

軟件優(yōu)化出淫羊藿總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)49.93%、料液比1∶14.35、提取溫度81.13 ℃、提取時間31.79 min，淫羊藿總黃酮提取率的預(yù)測值為1.974%。根據(jù)實際可操作性，將最優(yōu)提取工藝調(diào)整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶15、提取溫度82 ℃、提取時間32 min、水浴回流提取、提取2次。在最優(yōu)提取條件下進(jìn)行3次驗證實驗，得到總黃酮提取率分別為1.949%、1.974%、1.961%，平均值為1.961%，RSD值為 0.638%，與預(yù)測值相差不大。說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的淫羊藿總黃酮提取工藝準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

先采用溶劑法除去淫羊藿中的葉綠素，再以淫羊藿總黃酮提取率為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化淫羊藿總黃酮的提取工藝。確定最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶15(g∶mL)、提取溫度82 ℃、提取時間32 min、水浴回流提取、提取2次，在此條件下，淫羊藿總黃酮提取率為1.961%。該研究為淫羊藿的開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。