清解益肺苗方顆粒薄層鑒別方法研究

晏 琴 李 江* 劉 煒 劉頂鼎

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

肺癌的發(fā)病率逐年增高，據(jù)世界腫瘤的首位。在已確診的肺癌種類中非小細(xì)胞肺癌占據(jù)了80%～85%的比例[1]。此類肺癌早期可控，5年存活率低于15%。現(xiàn)階段，肺癌的治療手段主要有手術(shù)切除、靶向治療、免疫治療等，但是均存在一定的毒副作用，且治療費(fèi)用高[2]。非小細(xì)胞肺癌患者若長期服用西藥，很容易產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重者會導(dǎo)致肝腎功能損傷，從而影響藥物的藥效。而中藥在治療腫瘤方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可通過抑制肺癌血管生成提高治療效果，具有緩解耐藥性、增效減毒等效應(yīng)[3]。中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，可多途徑抑制腫瘤生長，故對有效治療肺癌的藥物研發(fā)尤為重要。

清解益肺苗方是基于貴州中醫(yī)藥大學(xué)劉自平教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，清解益肺苗方顆粒是由黃芪、南沙參、魚腥草、白花蛇舌草、余甘子、法半夏、浙貝母、吉祥草、冬凌草、炒薏苡仁、半枝蓮、仙鶴草12味中藥組方制成的顆粒劑，具有益氣養(yǎng)陰、解毒散結(jié)的功效；適用于氣陰兩虛型非小細(xì)胞肺癌患者。方中黃芪歸肺脾二經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾利水之功，寓“培土生金”之義；南沙參性微寒，歸肺、胃二經(jīng)，具有養(yǎng)陰生津、化痰益氣之功效，應(yīng)肺臟“喜潤惡燥”的生理特性，兩者合用為君藥；臣以余甘子清熱潤肺生津；白花蛇舌草和魚腥草配伍以清熱解毒、化痰散結(jié)。該制劑前期已通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可抑制小鼠Lewis肺癌生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤新血管生成，具有很好的抗肺癌作用[4]。清解益肺湯在長期的臨床應(yīng)用中取得了較好的療效，但湯劑存在服用量大，不易攜帶和運(yùn)輸，口感酸澀，難以下咽，易變質(zhì)等缺點(diǎn)。故從患者用藥、攜帶、運(yùn)輸和貯藏等角度考慮，將該方制備成顆粒劑。并且該制劑未進(jìn)行過相關(guān)質(zhì)量方面研究，缺乏有效指標(biāo)來確保制劑質(zhì)量可控性；故建立黃芪、南沙參、余甘子、魚腥草、白花蛇舌草的定性方法作為清解益肺苗方顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ZF-1型三用紫外線分析儀(上海金鵬分析儀器有限公司)、101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、DRHH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、SK5200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、METTLER電子分析天平。

1.2 材料 硅膠板(G板，青島海洋化工有限公司制造)；甲醇(批號20201127，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),乙醇(批號：20200921，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),丙酮(批號：20180821，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),乙酸乙酯(批號：2010131，四川西隴科學(xué)有限公司),氨水(批號：20200704，重慶江川化工(集團(tuán))有限公司)；試驗(yàn)用水為純化水；黃芪(批號：120974-201813)、南沙參(批號：121499-201605)、余甘子(批號：121289-201804)、魚腥草(批號：121046-201607)、白花蛇舌草(批號：121183-201605)等對照品及對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 清解益肺苗方顆粒的制備 清解益肺苗方顆粒的制備工藝為：按處方量稱取12味藥材，加12倍量水，煎煮1 h，濾過，合并濾液，濃縮，加適量可溶性淀粉制成顆粒，即得。為有效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按清解益肺苗方顆粒制備方法制備3個不同批次的樣品備用(編號為20210728、20210729、20210730)。

2.2 黃芪的薄層鑒別[5]分別取3批本品顆粒適量，研成細(xì)粉，稱取5 g置具塞錐形瓶中，加乙醇30 mL，加熱回流20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3%氫氧化鈉溶液15 mL使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，用乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪對照藥材2 g，同供試品溶液方法制成對照藥材溶液。按清解益肺苗方配比制備缺黃芪的陰性制劑，同供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020版四部附錄(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以0.5%羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上；以三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示3批供試品色譜中所呈現(xiàn)的熒光主斑點(diǎn)，在與對照藥材色譜熒光斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖1所示。

1～3.供試品(20210728、20210729、20210730)；4.陰性對照溶液；5.黃芪對照藥材

2.3 南沙參的薄層鑒別 分別取3批本品顆粒適量，研成細(xì)粉，稱取5 g置具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，于80 ℃下加熱回流1 h，用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即為供試品溶液。取南沙參對照藥材2 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按清解益肺苗方配比制備缺南沙參的陰性制劑，同供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020版四部附錄(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上；以三氯甲烷-甲醇-甲酸(9∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[6]。結(jié)果顯示3批供試品色譜中所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)，在與對照藥材色譜斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色，且陰性對照無干擾.結(jié)果如圖2所示。

1～3.供試品(20210728、20210729、20210730)；4.陰性對照溶液；5.南沙參對照藥材

2.4 余甘子的薄層鑒別 分別取3批清解益肺苗方顆粒適量，研成細(xì)粉，稱取5 g置具塞錐形瓶中，加乙醇20 mL，超聲處理30 min(功率250 W，頻率33 kHz)，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，即為供試品溶液。取余甘子對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按清解益肺苗方配比制備缺余甘子的陰性制劑，同供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020版四部附錄(通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上；以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5.5∶4.5∶0.25)為展開劑，展開約8 cm，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視[7]。結(jié)果顯示3批供試品色譜中所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)，在與對照藥材色譜斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖3所示。

1～3.供試品(20210728、20210729、20210730)；4.陰性對照溶液；5.余甘子對照藥材

2.5 魚腥草的薄層鑒別 分別取3批本品顆粒適量，研成細(xì)粉，稱取5 g置具塞錐形瓶中，加水20 mL，攪拌均勻，加入乙醚20 mL，超聲提取2次(功率250 W，頻率33 kHz)，每次15 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取乙醚層，將乙醚蒸干，殘渣加乙醚2 mL使溶解，即為供試品溶液。另取魚腥草對照藥材 1 g，加乙醚15 mL，靜置30 min，超聲提取 2 次，每次15 min，濾過，將乙醚液蒸干，殘渣加乙醚2 mL使溶解，即為對照藥材溶液。按清解益肺苗方配比制備缺魚腥草的陰性制劑，同供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020版四部附錄(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以0.5%羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上；以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.5) 為展開劑，展開， 取出，晾干，噴以 10% 硫酸乙醇溶液，置紫外燈下(365 nm) 下檢視[8]。結(jié)果顯示3批供試品色譜中所呈現(xiàn)的熒光主斑點(diǎn)，在與對照藥材色譜熒光斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖4所示。

1～3.供試品(20210728、20210729、20210730)；4.陰性對照溶液；5.魚腥草對照藥材

2.6 白花蛇舌草的薄層鑒別 分別取3批清解益肺苗方顆粒適量，研成細(xì)粉，稱取5 g置具塞錐形瓶中，加水10 mL，攪拌均勻，用乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即為供試品溶液。取白花蛇舌草對照藥材1 g，加入甲醇20 mL，超聲處理30 min(功率250 W，頻率33 kHz)，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即為對照藥材溶液。按清解益肺苗方配比制備缺白花蛇舌草的陰性制劑，同供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020版四部附錄(通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以0.5%羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上；以甲苯-丙酮-冰醋酸(8∶3∶0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁-乙醇溶液，在105 ℃加熱3 min，置紫外光燈(254 nm)下檢視[9]。結(jié)果顯示3批供試品色譜中所呈現(xiàn)的熒光主斑點(diǎn)，在與對照藥材色譜熒光斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖5所示。

1～3.供試品(20210728、20210729、20210730)；4.陰性對照溶液；5.白花蛇舌草對照藥材

3 討論

清解益肺苗方顆粒由12味藥組成，參照2020年版《中國藥典》相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)對處方中黃芪、南沙參、余甘子、魚腥草、白花蛇舌草五味藥材進(jìn)行薄層鑒別研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本文建立的方法專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好。

前期根據(jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)對五味藥材進(jìn)行薄層鑒別研究，只有黃芪斑點(diǎn)清晰且無陰性干擾外，其余4味藥材斑點(diǎn)顯色均不清晰；后期參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，進(jìn)一步對南沙參、余甘子、魚腥草和白花蛇舌草四味藥材進(jìn)行薄層鑒別研究，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，分離度好且無陰性干擾。余甘子在鑒別過程中，對硅膠板及展開劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示以硅膠GF254薄層板，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5.5∶4.5∶0.25)為展開劑，分離效果顯著提高，且斑點(diǎn)顯色清晰。白花蛇舌草考察了不同的顯色劑，結(jié)果用5%三氯化鋁-乙醇溶液作為顯色劑時，斑點(diǎn)顯色更為清晰。結(jié)果證明上述五味藥材的薄層鑒別研究可作為清解益肺苗方顆粒的質(zhì)量控制方法。但因?yàn)橹兴帍?fù)方制劑成分復(fù)雜，不同的中藥可能含有相同的成分，單憑化學(xué)物質(zhì)對照品難以辨別，故實(shí)驗(yàn)建立的薄層鑒別方法均采用對照藥材來鑒別。為建立清解益肺苗方顆粒的質(zhì)量控制方法提供了思路，也為其臨床用藥安全有效提供了參考價值。