環(huán)境銅離子對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能、脂代謝、肝胰臟和脾臟組織的影響

顏?zhàn)訙Y 鄧真德 張 競(jìng) 梁振業(yè) 徐 暢

(海南大學(xué)海洋學(xué)院, 海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心, 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?570228)

近年來(lái), 我國(guó)由于近岸工廠大量排放未經(jīng)處理的尾水, 導(dǎo)致地表水生態(tài)系統(tǒng)的重金屬污染日益嚴(yán)重[1], 銅已經(jīng)成為我國(guó)湖泊富集重金屬的主要元素之一[2]。有報(bào)道稱, 珠江口海域銅濃度已處于污染水平, 且具有潛在的生物毒性[3]。Jiang等[4]對(duì)太湖水體、間隙水和表層沉積物中的重金屬含量進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查, 研究表明, 太湖間隙水水體銅濃度為2.29—135.78 μg/L, 在珠山灣濃度最高。Kshetriya等[5]對(duì)印度梅加拉亞邦天然水體中重金屬污染進(jìn)行評(píng)估,季風(fēng)期的西杰因蒂亞丘陵(West Jaintia Hills)銅污染嚴(yán)重, 銅濃度為416 μg/L。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中, 硫酸銅通常用于預(yù)防刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)感染, 并能夠有效地清除有害藻類。在池塘管理中過量使用硫酸銅, 可能會(huì)因?yàn)殂~在池塘底泥中的積累而危及水環(huán)境的安全[6]。池塘養(yǎng)殖魚類投喂飼料中帶來(lái)的銅也會(huì)沉到底泥并富集, 通過食物鏈最終進(jìn)入魚體[7]。銅是魚類生命生長(zhǎng)過程中必需的一種微量元素, 是構(gòu)成酶的活性基團(tuán)及組成部分,但當(dāng)其濃度超過生態(tài)閾值時(shí), 必然會(huì)對(duì)魚體造成一定的影響[8,9]。銅對(duì)魚類的毒性作用是多方面的,如食欲降低[10]、肝細(xì)胞損傷[11]、血細(xì)胞減少[12]、誘導(dǎo)組織抗氧化損傷和應(yīng)激反應(yīng)[13]、影響魚類的生長(zhǎng)[14]、代謝酶活性[15]、胚胎發(fā)育[16]和生殖[17]等。銅對(duì)水生生物的毒理作用主要是通過Haber/Weiss反應(yīng)催化自由基的產(chǎn)生[18], 過量的自由基會(huì)導(dǎo)致DNA的斷裂和脂質(zhì)過氧化等[19], 從而增加機(jī)體氧化脅迫, 誘發(fā)多種損傷[20], 甚至引起死亡[21]。有研究表明, 不同種的魚類會(huì)對(duì)銅具有不同的生理響應(yīng)機(jī)制[22]?？梢? 研究環(huán)境銅對(duì)魚類生長(zhǎng)、健康和脂代謝的影響對(duì)其生產(chǎn)具有重要的意義。

目前, 有關(guān)水環(huán)境重金屬對(duì)魚類健康和脂代謝的影響已有諸多報(bào)道。Huang等[23]研究發(fā)現(xiàn)水體銅暴露影響矛尾復(fù)鰕虎魚(Symechogobius hasta)的肝臟脂質(zhì)沉積和代謝。Mazandarani等[24]報(bào)道稱, 在高濃度水體硫酸銅暴露下, 鯉(Cyprinus carpio)血漿甘油三酯和膽固醇含量顯著升高。Liu等[15]研究表明矛尾復(fù)鰕虎魚暴露于亞急性銅后, 其肝臟中脂肪含量顯著升高, 且脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性顯著下降。Chen等[25]發(fā)現(xiàn), 黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)在不同濃度梯度的水體銅(2、24、71和198 μg/L)暴露6周后, 高濃度銅降低其肝臟脂肪合成酶活性和基因的表達(dá)水平, 但脂蛋白水解酶的活性及其mRNA表達(dá)水平顯著提高。Tulasi等[26]發(fā)現(xiàn), 攀鱸(Anabas testudineus)在暴露于濃度為5 mg/L的水體鉛環(huán)境中30d后, 其肝臟總脂肪含量降低, 而游離脂肪酸含量升高。Zheng等[27]報(bào)道稱, 黃顙魚在低濃度鋅水體中(0.05、0.35和0.86 mg/L)暴露8周后, 鋅離子會(huì)通過抑制脂解代謝和促進(jìn)脂肪生成反應(yīng)而誘導(dǎo)脂質(zhì)的蓄積。Yang等[28]研究發(fā)現(xiàn), 河南華溪蟹(Sinopotamon honanense)在水環(huán)境鎘暴露后, 肝胰腺中的脂蛋白脂酶活性顯著下降, 其組織中的脂質(zhì)水平也明顯降低。盡管已有很多關(guān)于環(huán)境重金屬對(duì)魚類脂代謝影響的研究, 但有關(guān)羅非魚在銅脅迫下脂代謝的報(bào)道卻非常有限。

羅非魚是世界上最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和養(yǎng)殖價(jià)值的淡水養(yǎng)殖物種之一[29]。其中, 吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)因生存能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、凈出肉率高而在我國(guó)大面積推廣[30]。近年來(lái)由于高密度精養(yǎng)模式發(fā)展, 長(zhǎng)期投喂高脂肪、高能量的飼料, 使實(shí)際生產(chǎn)出的羅非魚出現(xiàn)肝臟及腹腔脂肪蓄積現(xiàn)象[31,32]。同時(shí), 羅非魚清晰的基因和生物學(xué)基礎(chǔ), 也是研究水體環(huán)境對(duì)硬骨魚類生理和健康影響的優(yōu)質(zhì)模式物種。目前有關(guān)水體銅暴露對(duì)羅非魚的影響已有許多報(bào)道, 但主要聚焦于對(duì)其生長(zhǎng)表現(xiàn)[14]、抗氧化系統(tǒng)[33]、免疫能力[34]、滲透調(diào)節(jié)[35]和離子平衡[36]等方面, 對(duì)脂代謝影響的相關(guān)研究較少。因此,本研究以羅非魚為對(duì)象, 研究不同濃度銅暴露對(duì)羅非魚的肝胰臟脂代謝及血清脂代謝的影響, 為進(jìn)一步研究水體銅對(duì)羅非魚毒理作用提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為幼體吉富羅非魚(GIFT tilapia,Oreochromis niloticus), 魚苗購(gòu)置于海南省文昌市某羅非魚繁育公司。實(shí)驗(yàn)開始前將魚苗在室內(nèi)養(yǎng)殖缸環(huán)境中暫養(yǎng)1周, 暫養(yǎng)過程中采用商用飼料定時(shí)飽食投喂, 在暫養(yǎng)結(jié)束后, 將平均體重為(0.45±0.02) g的健康羅非魚苗隨機(jī)分配至養(yǎng)殖水箱中, 開始正式的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)管理

根據(jù)前人的研究發(fā)現(xiàn), 羅非魚在水中硫酸銅暴露96h的半致死濃度為7.98 mg/L[37], 選擇半致死濃度的1/10作為安全濃度(0.8 mg/L)。故養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)設(shè)置水體銅暴露濃度分別為0、0.2 、0.4 和0.8 mg/L,未添加硫酸銅的水體作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。每個(gè)養(yǎng)殖水箱(60 cm×30 cm×35 cm)隨機(jī)分配幼魚15尾。以硫酸銅(CuSO4·5H2O,分析純)作為銅源, 將其溶解在去離子水中配制成母液, 通過移液槍加入固定體積的母液至已知體積的水體中, 保持水體的銅濃度。在養(yǎng)殖過程中, 每日投喂3次, 投喂時(shí)間分別為7:00、12:00和20:00,飽食投喂, 且根據(jù)羅非魚攝食情況進(jìn)行調(diào)整。每日每缸更換1/2充分曝氣的養(yǎng)殖用水, 并補(bǔ)充相應(yīng)體積的銅溶液, 每隔4天更換全部養(yǎng)殖水體, 以確保水體中銅濃度的穩(wěn)定。養(yǎng)殖期間水溫控制在27—30℃, pH 7.5—8.0, 持續(xù)充氣保證溶解氧不低于5 mg/L, 實(shí)驗(yàn)周期為4周。

1.3 樣品采集

采樣前, 羅非魚禁食24h。將魚麻醉后, 計(jì)算存活率, 并稱量每條魚體的重量, 計(jì)算增重率和特定生長(zhǎng)率。每缸中隨機(jī)取8尾魚, 進(jìn)行尾靜脈取血, 血樣在室溫靜置4h后, 轉(zhuǎn)移至4℃冰箱過夜, 次日將血樣在低溫離心機(jī)中以4℃, 3000 r/min離心10min(3-18KS, Sigma,德國(guó)), 取上層血清分裝于200 μL離心管中, 轉(zhuǎn)至?80℃保存待測(cè)。在冰上快速分離羅非魚的肝胰臟和脾臟, 肝胰臟稱重以計(jì)算肝體指數(shù),切取肝胰臟和脾臟的固定部位組織塊固定于4%多聚甲醛, 用于制備組織石蠟切片(HE染色)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定:

羅非魚的存活率、增重率、特定生長(zhǎng)率和肝體比采用下列公式進(jìn)行計(jì)算:

存活率(Survival rate, %)=最終魚數(shù)量/初始魚數(shù)量×100

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=(最終重量?初始重量)/初始重量×100

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,SGR, %/d)=(ln最終重量?ln初始重量)/實(shí)驗(yàn)天數(shù)×100

肝體比(Hepatosomatic index,HSI, %)=肝胰腺重量/體重×100

肝胰臟生化指標(biāo)測(cè)定: 在肝胰臟解凍后, 準(zhǔn)確稱取組織重量, 按照重量(g)﹕體積(mL)=1﹕9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水, 在冰水浴的條件下, 制備成10%的組織勻漿, 在4℃, 3000 r/min離心10min(3-18KS, Sigma,德國(guó)), 取上清液分裝至200 μL的離心管中, 甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、總可溶性蛋白含量和HMG-CoA還原酶活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定, 測(cè)定的過程按照試劑盒中的說明書要求進(jìn)行操作。

血清脂質(zhì)成分測(cè)定: 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(T-CHO)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定, 具體測(cè)定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

血清免疫指標(biāo)測(cè)定: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定, 具體測(cè)定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

組織學(xué)觀察: 肝胰臟和脾臟組織用鋒利的解剖刀切取固定部位后, 在4%多聚甲醛中固定24h后,經(jīng)不同濃度的乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水、經(jīng)過二甲苯清潔透明后用石蠟包埋固定于包埋盒中, 進(jìn)行組織切片, 石蠟切片厚度為5 μm。用蘇木精和伊紅對(duì)載玻片上的石蠟組織進(jìn)行染色, 清洗掉多余染料烤干,再用樹脂進(jìn)行封片保存。將封好的石蠟切片于光學(xué)顯微鏡(Eclipse 200, Nikon, 日本)下觀察, 并用圖像分析軟件(SBI image 2.0, 賽寶, 中國(guó))進(jìn)行拍攝記錄。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)中的全部數(shù)據(jù)均采用SPSS statistics 23(IBM, Armonk, 美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。對(duì)照組、0.2、0.4和0.8 mg/L 實(shí)驗(yàn)處理組之間的差異使用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示為顯著差異,P<0.01表示為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能

0.2 mg/L處理組羅非魚的存活率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于0.4和0.8 mg/L處理組(P<0.05), 但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 1A和1C)。由圖 1B可知, 水體銅處理實(shí)驗(yàn)組羅非魚的增重率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。0.4和0.8 mg/L組羅非魚肝體比顯著高于0.2 mg/L組和對(duì)照組(P<0.05), 0.4和0.8 mg/L實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異(P>0.05), 0.2 mg/L組羅非魚肝體比與對(duì)照組相比雖有下降, 但無(wú)顯著差異(P>0.05;圖 1D)。

圖1 水體中不同濃度銅對(duì)羅非魚存活率(A)、增重率(B)、特定生長(zhǎng)率(C)和肝體比(D)的影響Fig. 1 Effects of different waterborne Cu concentrations on the survival rate (A), weight gain rate (B), specific growth rate (C) and hepatosomatic index (D) of tilapia柱狀圖中不同字母上標(biāo)表示組間具有顯著性差異(P<0.05), 且d>c>b>a, 下同Different letters mean significant difference (P<0.05), and d>c>b>a, the same applies below

2.2 肝胰臟脂質(zhì)代謝

隨著水體銅濃度升高, 肝胰臟中的甘油三酯含量在0.4和0.8 mg/L組中顯著升高(P<0.05), 0.2 mg/L組羅非魚肝胰臟甘油三酯含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 2A)。0.2 mg/L組羅非魚肝胰臟可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于其他各組(P<0.05), 其他各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 2C)。各實(shí)驗(yàn)組羅非魚肝胰臟總膽固醇含量和HMG-CoA還原酶活力與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 2B和2D)。

圖2 水體中不同濃度銅對(duì)羅非魚肝胰臟中甘油三酯(A)、總膽固醇(B)、蛋白質(zhì)(C)和HMG-CoA還原酶(D)的影響Fig. 2 Effects of different waterborne Cu concentrations on the contents of triglycerides (A), total cholesterol (B), protein (C) and HMGCoA reductase (D) activity in hepatopancreas of tilapia

2.3 血清脂質(zhì)代謝

各實(shí)驗(yàn)組羅非魚血清中HDL-C與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 3A)。0.4和0.8 mg/L組魚體血清中LDL-C顯著高于0.2 mg/L組和對(duì)照組(P<0.05),0.4和0.8 mg/L組之間、0.2 mg/L和對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 3B)。0.8 mg/L組魚體血清中甘油三酯含量顯著高于0.2 mg/L組(P<0.05), 對(duì)照組、0.2和0.4 mg/L組之間, 對(duì)照組、0.4和0.8 mg/L組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 3C)。0.4和0.8 mg/L組魚體血清中T-CHO的含量均顯著高于0.2 mg/L組和對(duì)照組(P<0.05), 0.4和0.8 mg/L組之間、0.2 mg/L組和對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 3D)。0.8 mg/L組血清中GPT顯著高于0.2和0.4 mg/L組(P<0.05),與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05), 對(duì)照組、0.2和0.4 mg/L組無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 3E)。0.8 mg/L組魚體血清GOT顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 但0.2、0.4 mg/L組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 3F)。

圖3 水體中不同濃度銅對(duì)羅非魚血清中高密度脂蛋白膽固醇(A)、低密度脂蛋白膽固醇(B)、甘油三酯(C)、總膽固醇(D)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(E)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(F)的影響Fig. 3 Effects of different waterborne Cu concentrations on the contents of high-density lipoprotein cholesterol (A), low-density lipoprotein cholesterol (B), triglycerides (C), total cholesterol (D), alanine aminotransferase (E) and aspartate aminotransferase (F) activity in serum of tilapia

2.4 肝胰臟組織學(xué)

水環(huán)境銅暴露后, 羅非魚肝胰臟組織學(xué)發(fā)生了明顯的變化(圖版Ⅰ)。與對(duì)照組相比, 0.2 mg/L組魚體的肝胰臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示正常, 空泡數(shù)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(圖版Ⅰ-1, 2)。在0.4和0.8 mg/L組, 羅非魚肝胰臟組織空泡數(shù)量顯著增加, 肝胰臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)(圖版Ⅰ-3, 4)。

2.5 脾臟組織學(xué)

脾臟組織學(xué)切片結(jié)果顯示, 當(dāng)羅非魚暴露于0.2 mg/L銅水體后, 脾臟中開始出現(xiàn)小面積的巨噬細(xì)胞中心(MMCs), 脂褐素的積累也明顯多于對(duì)照組(圖版Ⅱ-1, 2)。在0.4和0.8 mg/L 銅處理組中, 羅非魚MMCs面積明顯增大, 脂褐素的蓄積也隨著環(huán)境銅離子濃度升高而增加(圖版Ⅱ-3, 4)。

圖版Ⅱ 水體中不同濃度銅暴露后羅非魚脾臟HE染色切片PlateⅡ Spleen histology of tilapia exposed to different waterborne Cu concentrations

3 討論

3.1 水體中不同濃度銅離子暴露對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

大量研究表明, 魚類通過水體或食物攝入過多的銅離子均會(huì)抑制其生長(zhǎng)性能。在本實(shí)驗(yàn)中, 隨著銅離子濃度的升高, 羅非魚的增重率、特定生長(zhǎng)率和存活率均受到顯著的抑制。這與Ali等[14]研究結(jié)果一致, 在銅離子濃度為0.15、0.3和0.5 mg/L的水體中, 尼羅羅非魚的增重率和特定生長(zhǎng)率相比于對(duì)照組顯著下降, 且與水體中銅離子濃度增加呈線性正相關(guān)。王春秀[38]研究表明, 當(dāng)水體中銅離子濃度大于0.3 mg/L時(shí), 黃河鯉(Cyprinus carpio)的增重率顯著降低。同時(shí), Liu等[15]對(duì)矛尾復(fù)鰕虎魚的研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)水體中銅離子濃度為0.15和0.3 mg/L時(shí), 矛尾復(fù)鰕虎魚的增重率、特定生長(zhǎng)率以及存活率顯著下降。已有研究表明, 水體銅暴露使魚體生長(zhǎng)性能的下降可能有兩個(gè)原因, 首先是銅暴露使魚體用于解毒和維持體內(nèi)平衡的代謝支出增加[39], 其次是銅暴露使其攝食量減少, 從而導(dǎo)致其生長(zhǎng)減慢[10,14]。羅非魚作為重要的淡水魚之一, 能耐受各種環(huán)境因素和應(yīng)激條件[40], 在本研究中, 高濃度銅使羅非魚生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制, 可能由于羅非魚是熱帶魚類, 環(huán)境中較高的水溫增加了組織中銅的積累[41]。

3.2 水體中不同濃度銅離子暴露對(duì)羅非魚肝胰臟脂代謝的影響

肝臟在脂質(zhì)代謝中起著重要的作用[27], 水體中重金屬暴露能夠使魚類脂代謝功能失調(diào)[42]。甘油三酯是脂肪的主要成分, 甘油三酯含量升高表明肝臟中脂肪的分解代謝較低[43]。在本實(shí)驗(yàn)中, 0.4和0.8 mg/L實(shí)驗(yàn)組羅非魚肝胰臟中甘油三酯的含量與對(duì)照組相比顯著升高, 而0.2 mg/L組甘油三酯含量稍微下降, 血清中甘油三酯含量的變化趨勢(shì)相同,這可能是脂肪合成分解相關(guān)基因受到環(huán)境重金屬的影響的原因[9,44]。黃超[45]的報(bào)道稱, 經(jīng)30d水體銅暴露后, 蝦虎魚肝臟脂肪含量顯著增加, 但是水體銅暴露60d后, 魚體肝臟脂肪的含量下降。相反,Levesque等[46]研究表明環(huán)境銅暴露降低黃金鱸(Perca flavescens)肝臟中甘油三酯的含量。綜合可知, 銅對(duì)脂肪的含量的影響可能與魚的種類以及水體中銅暴露濃度和時(shí)間有關(guān)。肝胰臟脂肪含量的變化通過組織學(xué)(HE染色)可以得到很好的證實(shí), 同時(shí)肝體比也匹配上了肝胰臟脂肪含量的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 暴露于高濃度銅環(huán)境后, 羅非魚肝體比顯著增加, 表明肝胰臟代謝明顯受到銅的影響, 這與單丹等[33]研究結(jié)果一致。Liu等[15]、Huang等[23]也報(bào)道稱, 不同濃度銅離子暴露15d和30d均會(huì)使矛尾復(fù)鰕虎魚肝體比顯著增加。Grosell等[47]指出, 通常情況下海水魚對(duì)水體銅離子的敏感度低于淡水魚,通過上述研究與本實(shí)驗(yàn)的對(duì)比, 驗(yàn)證了這一結(jié)果。已有研究表明, 肝臟新陳代謝與肝體比成正相關(guān)[48]。

3.3 水體中不同濃度銅離子暴露對(duì)羅非魚膽固醇代謝的影響

膽固醇是維持生命活動(dòng)的重要保障, 而肝臟是膽固醇合成的主要場(chǎng)所[49]。HMG-CoA還原酶是膽固醇合成的主要限速酶, 且細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量通過HMG-CoA還原酶實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)[50]。已有研究表明, 用5 mg/L硝酸鉛水體暴露攀鱸30d后肝臟中膽固醇含量降低[26]。在本實(shí)驗(yàn)中, 肝胰臟總膽固醇含量和HMG-CoA還原酶雖無(wú)顯著差異, 但卻存在一定變化趨勢(shì)?？偰懝檀己侩S著環(huán)境銅離子濃度升高呈現(xiàn)增加的趨勢(shì), 而HMG-CoA還原酶正好相反, 證實(shí)了膽固醇的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

魚類血液生化指標(biāo)與其機(jī)體的代謝、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和疾病密切相關(guān)[51]。膽固醇是許多類固醇激素的前體, 在體內(nèi)有著廣泛的生理作用, 但當(dāng)其過量時(shí)便會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝和脂蛋白代謝紊亂, 對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響[52,53]。章龍珍等[54]研究發(fā)現(xiàn), 中華鱘(Acipenser sinensis)在不同濃度的銅離子(0.40、0.89和2.00 μg/L)水體中暴露60d后, 血液中膽固醇含量隨銅離子濃度的增加而升高。本研究中暴露于0.4和0.8 mg/L銅離子的羅非魚血清總膽固醇含量顯著高于對(duì)照組, 說明水體銅離子對(duì)膽固醇代謝產(chǎn)生顯著影響, 與上述研究一致。低密度脂蛋白(LDL)是向組織轉(zhuǎn)運(yùn)肝臟合成的內(nèi)源性膽固醇的主要形式; 高密度脂蛋白(HDL)則與其相反, 它是膽固醇的“清掃機(jī)”, 負(fù)責(zé)把膽固醇運(yùn)回肝臟代謝[55], 兩者在血液中分別以LDL-C和HDL-C結(jié)合膽固醇[56]。一般認(rèn)為, HDL-C有預(yù)防動(dòng)脈硬化效果, 而LDL-C易引起動(dòng)脈硬化[57]。血清中總膽固醇是HDL-C和LDL-C二者綜合作用的結(jié)果[56], 本研究中HDL-C和LDL-C含量均有升高的趨勢(shì), 且LDL-C含量產(chǎn)生顯著差異, 符合血清總膽固醇變化趨勢(shì), 也進(jìn)一步說明水體中銅離子可以誘導(dǎo)羅非魚血脂異常, 從而促進(jìn)處理組羅非魚肝胰臟膽固醇向血液中轉(zhuǎn)運(yùn), 增加了膽固醇在外周血管中的蓄積。

3.4 水體中不同濃度銅離子暴露對(duì)羅非魚肝功能的影響

GPT和GOT是肝臟特異性酶, 能反映肝臟的組織病變[58]。脊椎動(dòng)物在正常情況下, 組織細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶只有少數(shù)釋放到血漿中, 當(dāng)組織病變細(xì)胞通透性增加時(shí), 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)大量釋放進(jìn)入血漿[59]。王書鳳等[40]發(fā)現(xiàn), 在環(huán)境重金屬鉛、鎘、銅和鋅的條件下羅非魚血漿GPT和GOT酶活力顯著提高。潘魯青等[60]研究表明在銅(0.1、0.2、0.5和1 mg/L)作用下, 96h凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus Vannamei)血液中GPT和GOT均有升高的趨勢(shì), 且血液中2種轉(zhuǎn)氨酶活力的激活率為GPT

圖版Ⅰ 水體中不同濃度銅暴露后羅非魚肝胰臟HE染色切片PlateⅠ Hepatopancreas histology of tilapia exposed to different waterborne Cu concentrations1. 對(duì)照組; 2. 0.2 mg /L; 3. 0.4 mg/L; 4. 0.8 mg/L(×400, 下同)1. Control; 2. 0.2 mg/L Cu treatment; 3. 0.4 mg/L Cu treatment; 4. 0.8 mg/L Cu treatment (×400, the same applies below)

在正常情況下, 魚類肝臟組織中脂滴數(shù)量較少,然而在病理情況下, 魚類肝臟中脂滴會(huì)大量增多[42]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在水體中銅離子暴露下羅非魚的肝胰臟均出現(xiàn)空泡化, 且隨著處理濃度的升高, 肝胰臟空泡化比例升高, 脂滴數(shù)量也隨之增加, 表明外界水體銅濃度過高導(dǎo)致羅非魚肝胰臟產(chǎn)生了病理?yè)p傷。黃超[45]研究表明經(jīng)30d水體慢性銅(2、18、38和55 μg/L)暴露后, 蝦虎魚肝臟空泡比例隨著水體銅濃度增加而增大, 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, 且蝦虎魚是一種受刺激后易敏感的物種, 與羅非魚相比,在水體銅暴露下其機(jī)體更容易受到損傷。

3.5 水體中不同濃度銅離子暴露對(duì)羅非魚脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

MMCs在魚類中通常位于脾和腎等造血組織中, 在一些魚類肝臟中也有發(fā)現(xiàn)[61]。MMCs的變化不僅可以作為魚體本身健康狀況的良好指標(biāo), 也可以作為水環(huán)境應(yīng)激條件的敏感指標(biāo)[61,62]。對(duì)新熱帶鯰(Rhamdia quelen)[63]的研究表明, 在11 μg/L銅離子暴露96h下, 肝臟中MMCs數(shù)量顯著增加, 與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果類似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與對(duì)照組的脾臟相比, 處理組MMCs數(shù)量明顯增加, 可以認(rèn)為是銅暴露后的標(biāo)志性變化, 反映了組織遭到破壞的情況。

已有研究表明脂褐素沉積可在大量的不同病理情況下出現(xiàn)[64]。陳其晨等[65]發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期生活在遭受污染的水環(huán)境中, 大齡的白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和草魚(Ctenopharyngodon idella)的肝、腎、脾等組織器官都發(fā)生了不同程度的病變。這些組織器官存在數(shù)量較多的巨噬細(xì)胞, 能吞噬大量的脂褐素, 形成脂褐素細(xì)胞團(tuán)。在本實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比, 0.2、0.4和0.8 mg/L處理組脾臟出現(xiàn)了較多的脂褐素, 表明銅離子暴露后組織和細(xì)胞受損傷導(dǎo)致了脾臟MMCs的脂褐素增多。

綜上所述, 水體銅暴露顯著抑制了羅非魚的生長(zhǎng)性能, 導(dǎo)致羅非魚脂代謝紊亂以及肝胰臟脂肪大量蓄積, 且對(duì)脾臟免疫及機(jī)體健康造成了一定的損傷。