羅 帥 劉真誠 王 粟 谷思雨 王雪艷 姜傳奇 鮑少攀 方 濤 繆 煒* 熊 杰*

(1. 大連海洋大學(xué), 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

保安湖(30°12′—30°18′N,114°39′—114°46′E)位于湖北省大冶市西北部, 屬梁子湖水系, 為長江中游南岸的一個中型淺水草型湖泊, 全湖面積約為39.3 km2, 由主湖區(qū)、肖四海、扁擔(dān)塘和橋墩湖等湖區(qū)組成。其水域面積大, 生物餌料資源豐富, 水域生態(tài)環(huán)境優(yōu)越, 有條件建設(shè)成為湖北省重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 并為地區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展, 做出積極的貢獻(xiàn)。從區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展的角度分析, 保安湖所在的區(qū)域, 為湖北省重要的工業(yè)基地, 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)則顯得薄弱, 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)比較后進(jìn), 與其眾多的水面, 豐富的湖泊資源很不對稱。迄今為止, 保安湖漁業(yè)生產(chǎn)主要可以分為如下幾個階段: (1) 20世紀(jì)50—60年代,漁業(yè)高產(chǎn)期; (2) 70年代, 生態(tài)失調(diào), 漁業(yè)嚴(yán)重下降期;(3) 80年代后, 開發(fā)期; (4) 2000s初, 保安鎮(zhèn)污水過量流入, 水體嚴(yán)重污染期; (5) 2000s末, 逐步弱化漁業(yè)功能; (6) 2010s, 全面退化漁業(yè), 加強(qiáng)生態(tài)恢復(fù)的保護(hù)期。盡管20世紀(jì)70年代以來, 眾多的水產(chǎn)科技工作者對一些富營養(yǎng)類型的水體, 主要是中、小型藻型湖泊, 進(jìn)行了漁業(yè)增產(chǎn)綜合實驗, 卓有成效。但是長期以來, 對大、中型草型湖泊的開發(fā)、利用仍處于落后狀態(tài), 不但對于這類生態(tài)系統(tǒng)基本規(guī)律掌握不夠, 漁業(yè)利用也處于盲目狀態(tài)。特別是在1972—2000年, 保安湖先后經(jīng)過了大規(guī)模的河蟹養(yǎng)殖及保安鎮(zhèn)污水的過量排入, 根據(jù)2006年中國科學(xué)院水生生物研究所的調(diào)查結(jié)果顯示, 保安湖深度由1993年的2.36 m降至1.87 m, 透明度由1993年的1.48 m降至0.58 m。2002年前, 保安湖東西兩港還可行船, 如今水道污泥淤積, 航行嚴(yán)重受阻。自2002年開始整治湖水后, 保安湖的污染仍在不斷加劇, 已呈地表水三類水質(zhì)。而從20世紀(jì)90年代至今,有關(guān)保安湖流域生物類群的研究較少, 且主要集中于大型底棲動物[1]、魚類[2,3]、浮游植物[4]和沉水植物等[5], 而罕有浮游動物類群的研究。

浮游動物作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的重要類群, 是物質(zhì)能量循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。不僅是湖泊漁業(yè)中各經(jīng)濟(jì)魚類優(yōu)秀的生物餌料, 而且能夠靈敏地響應(yīng)環(huán)境的變化情況, 同時其生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究對于評估、監(jiān)測湖泊等水體的承載力水平、生態(tài)系統(tǒng)健康狀況及其精細(xì)化管控意義重大[6,7]。但開展浮游動物的相關(guān)研究還存在著諸多困難, 如浮游動物體型較小, 在顯微鏡下只能分辨較大的類群,很難鑒定到種, 而有關(guān)浮游動物形態(tài)描述的系統(tǒng)性文獻(xiàn)比較少, 對鑒定人員的專業(yè)程度要求很高。

近十幾年來, 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展, 浮游動物中各類群的組學(xué)研究也逐步開展。但是, 由于大部分原生動物都難以培養(yǎng), 無法獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于組學(xué)測序分析, 使得組學(xué)研究在原生動物中難于開展[8]。而擴(kuò)增子測序又存在著擴(kuò)增偏好、擴(kuò)增錯誤的引入、獲得的分子標(biāo)記基因片段短等問題, 如18S V4和V9區(qū)域?qū)φ鎸嵢郝浣Y(jié)構(gòu)的分析可能不準(zhǔn)確。因此宏基因組測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[9]。通過宏基因組測序, 可以全面、真實地獲取湖泊浮游動物多樣性等信息, 同時, 還可以對浮游動物與環(huán)境之間的關(guān)系、物種功能基因組等進(jìn)行分析。迄今為止, 宏基因組測序已成為全面了解環(huán)境中生物群落特征, 挖掘生物遺傳資源的一種方法。隨著測序成本的逐漸下降, 宏基因組方法也越來越多地應(yīng)用于湖泊浮游動物的相關(guān)研究中[10—12]。

浮游動物生活在水體中, 水環(huán)境中各種理化因素和生物因素的變動, 都會影響浮游動物的群落結(jié)構(gòu)。因此, 浮游動物種類和豐度的變化一方面受著水生植物季節(jié)性變化的影響, 如水生植物凋謝死亡可為浮游動物提供營養(yǎng)物質(zhì); 另一方面其他環(huán)境因子, 如光照、溫度、pH和溶氧等, 也會同時影響浮游動物類群的季節(jié)變化。本研究通過在2019—2020年春、夏、秋、冬四季對保安湖浮游動物群落進(jìn)行定期定點的采樣調(diào)查, 采用宏基因組方法, 在優(yōu)化物種鑒定和豐度計算方法的基礎(chǔ)上, 分析了保安湖浮游動物種類、群落組成結(jié)構(gòu)及時空變化特征, 獲得了保安湖浮游動物多樣性的基礎(chǔ)資料并闡明了浮游動物的季節(jié)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 采樣點的設(shè)置

根據(jù)保安湖的自然條件和生態(tài)特點, 將全湖劃分為4個湖區(qū), 其中主體湖區(qū)面積為26.7 km2, 該區(qū)共設(shè)置10個采樣點; 橋墩湖面積為8.0 km2, 該區(qū)共設(shè)置4個采樣點; 扁擔(dān)塘面積為3.3 km2, 該區(qū)共設(shè)置3個采樣點; 肖四海面積為1.3 km2, 該區(qū)共設(shè)置3個采樣點; 全湖共設(shè)置20個采樣點 (圖1)。目前, 肖四海、扁擔(dān)塘與橋墩湖已先后被圍欄堤斷, 但仍有水道與主體湖相通保持水循環(huán)[13]。

圖1 保安湖采樣點分布Fig. 1 Sampling stations in Bao’an Lake

1.2 樣品采集與制備

在2019—2020年度春、夏、秋、冬四季, 每季度采1次樣, 分別在4月、7月、10月和1月中旬, 其中10月份秋季樣品設(shè)置了3次平行采樣。采用采水器, 采取1 m水深的水樣2 L, 并用200 μm濾網(wǎng)過濾掉大顆粒。于室溫下?lián)u晃混勻, 每個樣點取350 mL水樣并加入1000個嗜熱四膜蟲(SB210細(xì)胞株)后抽濾至0.22 μm PC膜上(Millipore, USA)保存于–80℃冰箱, 用于之后高通量測序。

采用CTAB法提取濾膜上的環(huán)境DNA。首先將濾膜上的微生物沖洗下來, 然后加入CTAB 分離緩沖液將DNA溶解出來, 再經(jīng)氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)后使用1%的瓊脂糖凝膠分析DNA的降解程度和潛在污染。DNA純度使用納米光度計(IMPLEN, CA, USA)測定, DNA濃度使用Qubit dsDNA Assay Kit在Qubit2.0熒光儀(Life Technologies, CA,USA)中測定, 濃度大于1 μg的合格DNA被用來構(gòu)建文庫。對于質(zhì)量合格的DNA, 經(jīng)Covaris破碎儀打斷為長度350 bp左右的片段, 補(bǔ)齊末端后向3′端加“A”尾, 使用T4連接酶將Illumina測序接頭連接至文庫DNA兩端, 檢驗文庫質(zhì)量合格后, 所有樣品均基于Illumina HiSeq 4000平臺進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析流程如圖 2所示, 先對測序所得的原始序列用fastQC (v0.11.9)進(jìn)行質(zhì)量評估, 然后使用Fastx_trimmer (v0.0.14)移除低質(zhì)量堿基, 將經(jīng)過質(zhì)控的序列轉(zhuǎn)換為Fasta格式后, 通過BLASTN比對至SILVA數(shù)據(jù)庫, 設(shè)置e值閾值為1e-5, 篩選出rDNA相關(guān)的讀段(Reads), 使用MEGAHIT (v1.1.3)對rDNA測序讀段進(jìn)行組裝, 得到全部樣本的rDNA疊連群(Contigs)?；?6S和18S的hmm profile, 利用nhmmer比對確定所有組裝得到的rDNA contigs中屬于16S和18S的區(qū)域, 并使用腳本進(jìn)行截取。經(jīng)97%相似度聚類后得到最終的16S或者18S rDNA參考序列并用于物種鑒定。通過使用bwa (0.7.17-r1188)將每個樣品的rDNA reads分別比對至參考序列, 使用featureCounts (v1.6.0)對比對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計, 并用RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到OTU(Operational Taxonomic Units)豐度表。

圖2 保安湖浮游動物多樣性分析流程Fig. 2 The pipeline of zooplankton diversity analysis in Bao’an Lake

1.4 注釋結(jié)果的選取標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)參細(xì)胞定量

考慮到宏基因組法在物種鑒定上的精度受制于參考數(shù)據(jù)庫, 于是我們將4192個OTUs的代表序列, 分別與SILVA NR99 (https://www.arb-silva.de/)、PR2(https://github.com/vaulot/pr2_database/)、nt (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對并對注釋結(jié)果進(jìn)行選取, 以此來提高注釋精度。篩選標(biāo)準(zhǔn)如下: (1)依據(jù)序列一致性和覆蓋度對結(jié)果進(jìn)行篩選, 優(yōu)先選取序列一致性較高的注釋結(jié)果, 其次比較覆蓋度。(2)如3個庫注釋結(jié)果不一致, 而序列一致性與覆蓋度均相近, 則選取多庫注釋支持的結(jié)果。(3)如比對SILVA庫的注釋結(jié)果只注釋到了較高的階元, 但未明確注釋到下一級階元的, 而與其他庫的比對結(jié)果在與其較高階元注釋結(jié)果相同時,選取注釋到最低階元的注釋結(jié)果。

由于RPKM等算法的準(zhǔn)確性受到樣本之間物種豐度差異以及數(shù)據(jù)批次效應(yīng)的影響, 為了提高浮游動物豐度計算的準(zhǔn)確性, 在每份樣品中加入1000個嗜熱四膜蟲SB210細(xì)胞(Tetrahymena thermophilaSB210)作為內(nèi)參細(xì)胞, 來提高豐度計算的準(zhǔn)確性。通過將reads比對至嗜熱四膜蟲大核基因組來計算不同樣品之間內(nèi)參細(xì)胞的豐度, 并以內(nèi)參細(xì)胞的豐度值為基準(zhǔn), 對不同樣品中各OTU的豐度進(jìn)行均一化(Normalization)。

1.5 測序結(jié)果

基于Illumina高通量測序技術(shù), 對117個湖泊水樣樣本的濾膜進(jìn)行了宏基因組測序, 共得到1.7T數(shù)據(jù), 樣本測序數(shù)據(jù)量從11—23 Gb不等, GC含量在44%—53%, 經(jīng)質(zhì)量控制移除低質(zhì)量堿基后, 通過比對SLIVA SSURef tax數(shù)據(jù)庫提取出rDNA reads, 經(jīng)組裝及97% 聚類后共得到4192個OTUs。

1.6 統(tǒng)計分析

根據(jù)已得到的OTU豐度表在OTU水平分析不同樣點的群落組成及季節(jié)變化。基于 Bray-Curtis距離算法計算Beta多樣性, 并通過主坐標(biāo)分析(PCoA)分析不同湖區(qū)浮游動物的多樣性差異[14]。使用R軟件“Vegan”包和“indicspecies”包計算保安湖浮游動物多樣性及指示物種。選取全部浮游動物的OTU進(jìn)行共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析, 使用R軟件“Hmisc”包, “psych” 包和“igraph”包計算Spearman秩相關(guān)性,并以秩相關(guān)性系數(shù)R值大于 0.6, 顯著性P值小于0.05 來作為確定物種間存在相互作用關(guān)系的閾值,使用“Gephi”軟件繪制無向網(wǎng)絡(luò)圖。所有圖表均使用 R 軟件“ggplot2”包和進(jìn)行繪圖[15]。

2 結(jié)果

2.1 注釋結(jié)果的優(yōu)化與內(nèi)參細(xì)胞輔助定量

只通過比對SLIVA數(shù)據(jù)庫對OTUs進(jìn)行物種注釋時, 其注釋結(jié)果會存在誤差, 如在保安湖水樣中,我們加入的內(nèi)參細(xì)胞為T. thermophilaSB210, 但在SLIVA庫的注釋結(jié)果中為T.farahensis, 而與PR2和nt數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果則為T. thermophila?？梢? 通過多庫比對檢索能提高物種注釋的精度。因此, 本研究所獲得的4192個OTUs分別與SILVA、PR2、nt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對, 依據(jù)序列一致性和覆蓋度對比對結(jié)果進(jìn)行篩選, 共優(yōu)化注釋結(jié)果549個, 其中矯正注釋錯誤419個, 優(yōu)化注釋精度130個, 占全部OTUs的13.1%(圖3A)。

為了評估內(nèi)參細(xì)胞對豐度計算的效果, 本研究對2019年秋季的20個樣品所采集的樣品設(shè)置了3次重復(fù)。由圖 3B可知, 對于同一個點的不同重復(fù)來說, 其內(nèi)參細(xì)胞的豐度值變異較小(標(biāo)準(zhǔn)差均比較小), 說明加入的內(nèi)參細(xì)胞具有較好的重復(fù)性, 可用于提高浮游動物豐度的計算結(jié)果。同時, 從圖 3B可知, 保安湖各湖區(qū)(扁擔(dān)塘、肖四海、橋墩湖和主體湖)樣點之間內(nèi)參細(xì)胞的豐度值差異較大, 說明了不同樣點所采集的水樣中浮游動物的豐度變化較大, 也間接說明了內(nèi)參細(xì)胞對豐度計算的重要性。

圖3 浮游動物種類注釋和豐度計算的優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization of species identification and abundance estimationA. 種類注釋優(yōu)化結(jié)果; B. 基于內(nèi)參細(xì)胞輔助的浮游動物豐度計算優(yōu)化結(jié)果A. The optimized result of species identification; B. The optimized result of the abundance of zooplankton based on reference cells

2.2 保安湖浮游動物多樣性分析

對保安湖全湖宏基因組分析所獲得的4192個OTUs進(jìn)行注釋后, 其中60%的OTUs為細(xì)菌(圖4A),而浮游動物則占據(jù)了全部OTUs的17% (原生動物14%、輪蟲1%、枝角類1%和橈足類1%)。在保安湖原生動物群落中, 又以纖毛蟲(Ciliophora, 39%)、眼蟲(Euglenozoa, 29%)、絲足蟲(Cercozoa, 12%)和頂復(fù)門(Apicomplexa, 5%)為主, 占到了全部原生動物OTUs的85% (圖4B)。

圖4 保安湖浮游動物物種組成Fig. 4 The composition of zooplankton in Bao’an Lake

基于內(nèi)參細(xì)胞均一化后的OTUs豐度表, 計算了保安湖不同季節(jié)下各樣點Alpha多樣性指數(shù)、指示物種及進(jìn)行Beta多樣性分析。在OTU水平上, 保安湖浮游動物多樣性以夏季最高, 秋季第二, 春季次之, 冬季最低(表1)。

表1 各季節(jié)保安湖浮游動物多樣性指數(shù)Tab. 1 Diversity index of zooplankton in Bao’an Lake in four seasons

在不同季節(jié)下, 保安湖浮游動物的指示物種類群也存有較大差異(表2)。在春季, 保安湖浮游動物指示物種主要為枝角類和原生動物, 其中枝角類主要為溞屬(Daphnia)、低額溞屬(Simocephalus)和盤腸溞屬(Chydorus)等, 原生動物則以(Salpingoeca)屬為主。在夏秋兩季, 保安湖浮游動物指示物種則以原生動物為主, 主要為苔扭蟲屬(Bryometopus)、格魯博蟲屬(Gruberia)、Vorticellides屬、波豆蟲屬(Bodo)、網(wǎng)紋蟲屬(Favella)等。而在冬季, 保安湖浮游動物指示物種則以橈足類為主, 主要為劍水蚤屬(Cyclops)和小劍水蚤屬(Microcyclops)。其中, 在春夏季均有觀測到喜好分布于富營養(yǎng)環(huán)境或α-中污帶的浮游動物[16], 如在春季觀測到枝角類圓形盤腸溞(Chydorus sphaericus), 在夏季觀測到原生動物舞行波豆蟲(Bodo saltans)等, 而在秋冬季節(jié)并無觀測到明顯的水污染指示生物。

表2 不同季節(jié)下保安湖浮游動物指示物種Tab. 2 Indicator species of zooplankton in Bao’an Lake

2.3 保安湖浮游動物季節(jié)變化

對保安湖浮游動物群落進(jìn)行 Beta多樣性分析(圖5)。通過基于Bray-Curtis距離算法的PCOA分析揭示了不同季節(jié)下浮游動物不同的聚類模式, 對于2019年保安湖浮游動物數(shù)據(jù), 季節(jié)因素是浮游動物的主要解釋變量(R=0.7275,P=0.001)。而湖區(qū)對浮游動物群落結(jié)構(gòu)的影響較小(R=0.2982,P=0.001)。

圖5 保安湖浮游動物Beta多樣性分析結(jié)果Fig. 5 Beta diversity of zooplankton in four season and lake areasA. 季節(jié); B. 湖區(qū)A. Seasons; B. Lake areas

隨后, 我們進(jìn)一步分析了保安湖浮游動物的季節(jié)變化趨勢。從觀測到的浮游動物OTU數(shù)目上來看, 在肖四海和主體湖區(qū)可觀測到更多的浮游動物種類。從浮游動物總數(shù)來看, 保安湖浮游動物以冬季最高, 春、夏季次之, 秋季最低, 并主要分布于扁擔(dān)塘與肖四海(圖6)。

圖6 不同湖區(qū)浮游動物OTU數(shù)目和豐度的季節(jié)變化Fig. 6 Seasonal changes of the numbers of zooplankton OTUs and abundance in different lake areasA. OTU數(shù)目; B. 豐度A. Number of OTUs; B. Abundance

2.4 保安湖浮游動物群落與環(huán)境因子的關(guān)系

選取保安湖豐度前十的原生動物類群、輪蟲、枝角類和橈足類與環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析和Spearman秩相關(guān)性分析。保安湖浮游動物群落與環(huán)境因子的冗余分析表明: 溫度、pH、溶氧、氨氮、葉綠素a和硝氮對保安湖浮游動物群落結(jié)構(gòu)有較大的影響(圖7)。在不同季節(jié), 環(huán)境因子對保安湖浮游動物群落有著不同的相互作用。春、冬季節(jié)的樣點主要分布于第三、第四象限, 說明在本次調(diào)查中春冬季節(jié)的浮游動物群落與溫度、pH、葉綠素a濃度呈負(fù)相關(guān)。而夏、秋季節(jié)的樣點主要分布于第一象限, 說明在本次調(diào)查中夏秋季節(jié)的浮游動物群落與溫度、pH、葉綠素a濃度呈正相關(guān)。保安湖浮游動物群落與環(huán)境因子的Spearman秩相關(guān)性分析表明: 保安湖不同類群的浮游動物與環(huán)境因子的相互作用關(guān)系有所不同, 其中N、P作為合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的關(guān)鍵元素, 其含量與浮游動物各類群均有顯著的正相關(guān), 而溫度、pH、葉綠素a、溶氧與浮游動物的關(guān)系則更為復(fù)雜。根據(jù)聚類關(guān)系主要可以分為五類: 纖毛蟲(Ciliophora)、絲足蟲(Cercozoa)和輪蟲(Rotifer)主要與硝氮、化學(xué)需氧量呈正相關(guān), 與溫度、氨氮呈負(fù)相關(guān); 帕金蟲(Perkinsozoa)和變形蟲(Amoebozoa)則主要與化學(xué)需氧量、總磷呈正相關(guān), 與正磷酸根呈負(fù)相關(guān); 而領(lǐng)鞭毛蟲(Choanoflagellata)和雙環(huán)門(Bigyra)則與多數(shù)環(huán)境因子并無明顯的相關(guān)性關(guān)系; Aphelidea和頂復(fù)門 (Apicomplexa)等則與溫度、葉綠素a、pH呈正相關(guān); 橈足類與枝角類主要與硝氮呈正相關(guān), 與溶氧、溫度和葉綠素a呈負(fù)相關(guān)。

圖7 保安湖浮游動物多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Fig. 7 Correlation analysis between zooplankton diversity and environmental factors in Bao’an Lakea. 典范對應(yīng)分析; 紅色箭頭代表 11種環(huán)境因子, 藍(lán)色箭頭代表不同的浮游動物群落; A. 纖毛門; B. 輪蟲門; C. 枝角目; D. 橈足類;E. 帕金蟲門; F. 絲足蟲門; G. 眼蟲門; H. 雙環(huán)門; I. 定鞭藻門; J. Aphelidea; K. 變形蟲門; L. 領(lǐng)鞭蟲綱; M. 頂復(fù)門; b. spearman秩相關(guān)系數(shù)的熱圖。根據(jù)spearman秩相關(guān)系數(shù)計算相關(guān)性矩陣; *P<0.05; **P<0.01; 紅色和綠色分別代表正相關(guān)和負(fù)相關(guān), 顏色越深, 相關(guān)性越強(qiáng)a. The canonical correlation analysis. The red arrows represent 11 environmental factors, the blue arrows represent different zooplankton communities; A. Ciliophora; B. Rotifer; C. Cladocera; D. Copepoda; E. Perkinsozoa; F. Cercozoa; G. Euglenozoa; H. Bigyra; I. Haptista;J. Aphelidea; K. Amoebozoa; L. Choanoflagellata; M. Apicomplexa; b. The heatmap correlation coefficients. The matrix was calculated using spearman’s correlation coefficients; *P<0.05; **P<0.01; Red and green represent positive and negative correlations, and the darker the color, the stronger the correlation

2.5 保安湖浮游動物群落結(jié)構(gòu)季節(jié)變化及作用關(guān)系

選取不同季節(jié)浮游動物OTUs的豐度數(shù)據(jù)計算兩兩OTU之間的spearman秩相關(guān)系數(shù), 并以此繪制2019年不同季節(jié)保安湖浮游動物的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)(圖8)。其中節(jié)點代表OTUs, 邊代表存在的相互作用。保安湖春季浮游動物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)共包含了617個節(jié)點和8130條邊, 夏季共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)包含669個節(jié)點和4407條邊, 秋季共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)包含686個節(jié)點和3013條邊, 冬季共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)包含418個節(jié)點和4255條邊。對不同季節(jié)的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化計算, 并統(tǒng)計其網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)可以發(fā)現(xiàn), 保安湖秋季浮游動物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)平均聚集系數(shù)最高, 而平均連通度和模塊性最低, 說明相比于其他季節(jié), 保安湖秋季浮游動物形成了一個“小世界網(wǎng)絡(luò)”, 而保安湖夏季浮游動物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)拓樸結(jié)構(gòu)參數(shù)則與此相反, 而春、冬兩季的網(wǎng)絡(luò)拓樸結(jié)構(gòu)參數(shù)則介于夏、秋季之間(表3)。從各季共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的模塊劃分上來看, 保安湖浮游動物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)主要可以分為8個主要的模塊(只統(tǒng)計了OTU占比大于1%的模塊), 其中模塊代表的是一組能位于同一生態(tài)位的物種的集合, 他們之間可能發(fā)生密切的相互作用。結(jié)果表明保安湖浮游動物群落結(jié)構(gòu)響應(yīng)季節(jié)變化動態(tài)而呈現(xiàn)出時間網(wǎng)絡(luò)動態(tài), 秋季最為簡單,夏季最為復(fù)雜, 也與夏季具有較高原生動物多樣性相對應(yīng)。從秋季到夏季, 保安湖浮游動物群落結(jié)構(gòu)存在著由簡單向復(fù)雜的變化趨勢。

圖8 保安湖浮游動物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)Fig. 8 Co-occurrence network of zooplankton in Bao’an Lake

表3 微生物共生網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)Tab. 3 Characteristic parameters of the molecular ecological network of organism

3 討論

3.1 宏基因組法在浮游動物調(diào)查中的優(yōu)點

本研究利用宏基因組測序, 從分子水平開展2019年度4個季節(jié)保安湖浮游動物多樣性和群落結(jié)構(gòu)研究。針對浮游動物中部分類群體型微小難以鑒定的特點, 我們通過宏基因組法建立了一套基于rDNA基因序列的物種分類流程及標(biāo)準(zhǔn), 通過提取樣本中的rDNA信息并與SLIVA NR99、PR2、nt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 選取注釋更準(zhǔn)確, 精度更高的結(jié)果。最終的分類結(jié)果表明, 在浮游動物中通過宏基因組法優(yōu)化注釋結(jié)果的類群主要為纖毛蟲、眼蟲和變形蟲等。

通過在不同樣品中加入定量的嗜熱四膜蟲, 在保證宏基因組測序深度相近的前提下, 根據(jù)四膜蟲的定量結(jié)果, 矯正了因樣品個體差異所導(dǎo)致的豐度計算誤差, 使樣品間的比較結(jié)果更加可靠。

3.2 保安湖浮游動物群落的時空分布

2019年全年保安湖浮游動物共鑒定出浮游動物OTUs 374種, 種類組成主要以原生動物為主, 枝角類次之, 橈足類和輪蟲最少。在20世紀(jì)90年代基于形態(tài)學(xué)方法對保安湖浮游動物鑒定的結(jié)果中, 浮游動物主要為纖毛蟲, 本研究采用的宏基因組方法很大地提升了浮游動物鑒定能力, 除纖毛蟲外, 肉足蟲、鞭毛蟲和孢子蟲等門類均可鑒定到。同時,兩次保安湖浮游動物的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示, 保安湖浮游動物的物種組成和季節(jié)動態(tài)變化也存在差異。造成這種差異的因素有很多, 保安湖湖泊類型的轉(zhuǎn)變和氣溫升高可能是比較重要的兩個因素。同20世紀(jì)90年代相比, 2019年保安湖各站點的總氮、總磷(春季)的平均值較歷史數(shù)據(jù)提升了約2倍, 湖泊類型由貧營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)橹懈粻I養(yǎng)型, 浮游植物承擔(dān)的初級生產(chǎn)力增加, 浮游動物的食物源相對擴(kuò)大[17,18],同時浮游動物組成中藻食性種類相對增多[19—21], 形成了保安湖浮游動物種群數(shù)量春夏高峰的季節(jié)變化。受強(qiáng)暖冬影響, 在夏季達(dá)到種群高峰的臂尾輪蟲數(shù)量下降, 導(dǎo)致類群間競爭減少, 而疣毛輪蟲對溫度的適應(yīng)性較強(qiáng), 其種群數(shù)量增加, 因此冬季保安湖浮游動物種群數(shù)量較高但種類較為單一[22]。因此, 保安湖浮游動物現(xiàn)存量的季節(jié)變化受浮游植物與水生植物季節(jié)性變化的雙重影響, 以及其他環(huán)境因子如溫度、pH和溶氧等也同時影響種群的季節(jié)變化, 其結(jié)果便形成了保安湖浮游動物種群數(shù)量春夏冬高峰的季節(jié)變化。

而在空間上, 在肖四海和主體湖區(qū)可觀測到更多的浮游動物種類。從不同湖區(qū)浮游動物總數(shù)來看, 除原生動物在保安湖全湖均有較高的數(shù)量分布外, 其余類群的浮游動物均主要分布于扁擔(dān)塘與肖四海。而這可能與在20世紀(jì)90年代, 根據(jù)肖四海水淺, 面積小, 主要生物元素氮、磷含量低的特點, 采取施化肥、投青料的強(qiáng)化培育措施有關(guān)。從湖的理化性質(zhì)上來看, 保安湖是一個較好的漁業(yè)水體,水質(zhì)呈弱堿性, 透明度大, 為中營養(yǎng)型湖泊, 且春、夏季的富營養(yǎng)化程度高于秋、冬季節(jié)。而從浮游動物的種類數(shù)量和豐度來看, 保安湖浮游動物集中分布于肖四海。綜合來看, 保安湖肖四海湖區(qū)群落結(jié)構(gòu)多樣性良好, 同時在中富營養(yǎng)水體中, 由于營養(yǎng)鹽類較多, 可以為浮游植物提供較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì), 因此也促進(jìn)了浮游動物的生長[23]。因此, 保安湖肖四海湖區(qū)有著較高的漁業(yè)生產(chǎn)潛力, 可放養(yǎng)一些濾食性魚類如鰱、鳙等[24]。

3.3 浮游動物群落對環(huán)境因子的響應(yīng)

浮游生物群落結(jié)構(gòu)一般受多種環(huán)境因子影響,在不同的湖泊水體中, 影響群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子也存在差異[25]。杜明勇等[26]對太湖流域的研究顯示,影響浮游動物群落變化的主要環(huán)境因子為硝氮、總氮和溫度。為了確定水體理化因子對浮游動物群落組成的影響, 本研究進(jìn)行了Spearman秩相關(guān)性分析, 其中溫度、pH、硝氮和葉綠素a是影響保安湖浮游動物群落的主要環(huán)境因子。pH很大程度上依賴于浮游藻類的豐度(與葉綠素a濃度相關(guān)), 因此, pH與浮游動物之間可能是間接相關(guān)。在本研究中, 原生動物優(yōu)勢種主要為混合營養(yǎng)的纖毛蟲、絲足蟲和肉足蟲, 且原生動物群落與總氮、水溫有明顯的相關(guān)性與Sun 等[27]和Cai等[28]在先前發(fā)表的結(jié)果相似。因為浮游動物都有一個利于生存的最適溫度, 所以溫度往往是潛在的限制性因素[29,30], 而在楊宇峰等[31]研究顯示, 浮游動物密度和生物量都隨水體富營養(yǎng)化程度增加而增加, 而在相關(guān)性分析結(jié)果中, 纖毛蟲、枝角類、橈足類、輪蟲均與溫度和硝氮具有明顯的相關(guān)性, 這與之前的研究相符[32]。

3.4 浮游動物群落的互作模式

生物群落中各種生物之間存在共生、合作、競爭、掠食等相互作用, 這些相互作用決定了生物共存的模式[33]。微生物共生模型是評價微生物群落功能的重要工具。它可以揭示微生物之間潛在的相互作用[34], 并被廣泛用于研究自然環(huán)境中微生物之間的共存關(guān)系[35]。在保安湖秋季的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中, 其所包含的節(jié)點數(shù)與邊數(shù)均低于其他3個季節(jié), 表明與其他季節(jié)相比, 秋季浮游動物的群落復(fù)雜度最低, 浮游動物之間的相互作用更簡單或生態(tài)位的重疊更低。而秋季保安湖氮、磷、有機(jī)物的含量均較低, 同時隨著水位的降低, 保安湖水動力通量減小, 由此形成營養(yǎng)濃度較低的環(huán)境, 可能是造成秋季浮游動物群落簡單的主要因素。而營養(yǎng)物質(zhì)相對豐富, 則可能導(dǎo)致相互作用更加復(fù)雜, 生態(tài)位重疊, 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊密。例如, Zhang等[36]在分析大陸尺度土壤與大豆根際微生物共生格局差異時,華南地區(qū)的降水量和氣溫高于北方地區(qū), 導(dǎo)致大豆根際土壤微生物共生網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜, 生態(tài)位重疊程度高于南方地區(qū)。而在秋末冬初, 隨著保安湖水生植物的腐敗凋零, 堆積在湖底的有機(jī)物逐漸開始腐敗分解, 同時2019—2020年冬季平均氣溫較同期偏高1.5℃, 為分解者的活動提供了有利條件。而分解出來的營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了細(xì)菌的生長, 也就促進(jìn)了纖毛類和輪蟲的生長繁殖。因此, 保安湖其余季節(jié)的營養(yǎng)物質(zhì)相對豐富, 也就造成了保安湖浮游動物群落復(fù)雜度在春夏較高, 冬季其次, 秋季最低的季節(jié)性變化規(guī)律。

3.5 江湖阻隔下保安湖浮游動物多樣性變化

歷史上, 長江流域的湖泊均與長江自然連通,從而形成典型的江湖復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)。近幾十年來,由于大規(guī)模的圍墾造田、修筑堤壩等人類活動的干擾, 嚴(yán)重地破壞了江湖復(fù)合的生態(tài)系統(tǒng), 而保安湖也于1964年為便于控制水位, 即以隔斷梁子湖而建設(shè)東溝閘。同1986年調(diào)查數(shù)據(jù)相比, 保安湖浮游動物種類數(shù)量呈上升趨勢, 而這可能與洄游及半洄游魚類消失和保安湖營養(yǎng)水平增加兩方面因素所致。受江湖阻隔的影響, 保安湖漁業(yè)多樣性降低,魚類對浮游動物攝食的能力降低[37]。另外, 江湖阻隔影響了湖泊的水文節(jié)律、換水周期, 大大增加了流域內(nèi)入湖污染物在湖體的滯留時間, 使得湖區(qū)富營養(yǎng)化加重, 從而影響了保安湖浮游動物的種類數(shù)量[38, 39]。

4 結(jié)論

本研究基于宏基因組測序技術(shù)揭示保安湖湖泊系統(tǒng)中浮游動物的物種多樣性, 展現(xiàn)出其檢測低豐度稀有物種的潛力, 彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)方法的不足[40]。而宏基因組測序技術(shù)在分析環(huán)境樣品生物多樣性中存在一些不足, 例如, 不同類群的18S rDNA 基因的拷貝數(shù)存在很大差異, 因此18S豐度只能反映環(huán)境中DNA的豐度, 而不能真實反映物種個體的絕對數(shù)目; 物種注釋對rDNA數(shù)據(jù)庫的完整性存有很大依賴, 部分類群的序列信息的缺乏會影響分類的準(zhǔn)確性及種類數(shù)量的評估[41]。未來, 通過優(yōu)化現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫、篩選其他的 DNA條形碼等途徑建立一套鑒定精度更高的分析方法, 將對環(huán)境樣品生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)研究具有重意義。