基于環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)的珠江河口魚類多樣性

蔣佩文 李 敏 張 帥 陳作志 徐姍楠

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)開發(fā)重點實驗室, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 廣州510300; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室 (廣州), 廣州 511458)

河口生態(tài)系統(tǒng)一直頻繁往復(fù)地發(fā)生著物質(zhì)交匯、咸淡水混合、徑流和潮汐相互作用, 形成了環(huán)境獨特、資源富庶的自然條件和生物生境, 被認(rèn)為是全球最具有生產(chǎn)力的生態(tài)系統(tǒng)之一[1—3]。魚類多樣性是當(dāng)今水生生態(tài)系統(tǒng)健康監(jiān)測的關(guān)鍵指標(biāo), 對河口生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)學(xué)研究、管理和保護也起著至關(guān)重要的作用[4]。傳統(tǒng)的魚類多樣性的監(jiān)測方法主要通過直接捕獲樣本和視覺或聲學(xué)觀察, 其中直接捕獲樣本通過底拖網(wǎng), 地籠網(wǎng)及流刺網(wǎng)等方式,但這些方式不僅會破壞海床和底棲群落, 而且采樣效率低下, 成本高, 依賴經(jīng)驗豐富的分類學(xué)專家, 一直受到限制[5—8]。視覺或聲學(xué)觀察相對環(huán)保, 不會損傷魚類, 但河口生態(tài)系統(tǒng)的水質(zhì)渾濁, 嚴(yán)重影響其觀察的效率和準(zhǔn)確性。

環(huán)境DNA宏條碼 (Environmental DNA metabarcoding) 技術(shù)很大程度上避開了這些限制[9]。環(huán)境DNA (Environmental DNA)指水生生物通過糞便、黏液和皮膚的脫落及尸體降解物, 殘留在其生活水體中的DNA片段[10]。在收集環(huán)境樣本并提取DNA后, 研究人員可以使用針對多個物種中單個基因區(qū)域的保守引物進行擴增, 然后獲得有關(guān)它們在樣本中的存在和相對豐度的數(shù)據(jù)[8,11,12]。該方法不需要利用目標(biāo)物種的組織或這個生物體, 可以無創(chuàng)地檢測目標(biāo)生物?，F(xiàn)場工作也僅限于收集水樣, 且水樣所需較少, 相比于傳統(tǒng)方法縮短了現(xiàn)場采樣時間和成本, 非專業(yè)人員也能在較短的時間內(nèi)進行大規(guī)模采樣[13—15]。

珠江河口是中國南部十分重要的河口型生態(tài)系統(tǒng)[16]。珠江徑流挾帶的大量營養(yǎng)鹽和有機物質(zhì)輸入大海為魚類帶來豐富的營養(yǎng)物質(zhì), 使珠江河口成為魚類多樣性和漁業(yè)資源非常豐富的海域[17,18]。由于過大的捕撈強度和海洋開發(fā), 以及生態(tài)環(huán)境惡化, 導(dǎo)致魚類多樣性下降和漁業(yè)資源衰退[19]。在過去, 珠江河口魚類多樣性的評估主要采用底拖網(wǎng)方式進行。黃吉萬等[20]在珠江口伶仃洋使用拖網(wǎng)船調(diào)查捕獲魚類57種, Shannon-Weiner多樣性指數(shù)表現(xiàn)為秋季高于春季。袁夢等[21]珠江口南沙海域通過底拖網(wǎng)獲得24種魚類, Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)為2.07, 顯示群落結(jié)構(gòu)相對簡單。此外了解環(huán)境因子對魚類群落結(jié)構(gòu)的影響對保護其多樣性有著重要意義。Kuang等[22]研究表明濁度、總氮和影響珠江口魚類群落的功能性狀和多樣性。肖瑜璋等[23]研究表明鹽度和溶解氧含量為影響仔稚魚個體數(shù)量的較顯著因子。Hou等[24]研究顯示魚類浮游生物組合結(jié)構(gòu)受到海平面異常、鹽度、水深、10 m深度溫度和離岸距離的強烈影響。

目前, 環(huán)境DNA宏條碼技術(shù)也已經(jīng)初步應(yīng)用于珠江河口海域魚類多樣性研究。Zou等[4]結(jié)合環(huán)境DNA宏條碼(以線粒體12S rRNA片段為標(biāo)記)和底拖網(wǎng)方法調(diào)查了珠江入?？谀仙碀竦厣鷳B(tài)系統(tǒng)中魚類的多樣性及其季節(jié)性變化, 檢測出33科78種魚類, 表明環(huán)境DNA宏條碼方法可用于魚類多樣性季節(jié)性波動的監(jiān)測。Cheang等[25]在珠江口香港水域使用環(huán)境DNA宏條碼(以線粒體COⅠ片段為標(biāo)記)檢測到22種魚類。然而, 這兩項研究的區(qū)域均較小, 為了全面了解珠江河口魚類多樣性現(xiàn)狀, 本研究利用底拖網(wǎng)和環(huán)境DNA宏條碼技術(shù)對整個珠江河口海域進行了研究, 并分析了魚類多樣性空間差異以及與環(huán)境因子的關(guān)系, 以期為珠江河口生物多樣性監(jiān)測和水生生物保護提供新的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 研究水域

珠江河口位于南海北部, 廣東省南部, 屬咸淡水的交匯區(qū)域, 屬亞熱帶海洋季風(fēng)氣候, 是重要的河口型生態(tài)系統(tǒng)。地理坐標(biāo)為21°50′—23°00′N,113°30′—114°00′E, 面積約為3200 km2, 水深8—30 m,鹽度1‰—35‰(圖1)。珠江年徑流量3200多億m3,居全國江河水系的第二位, 流挾帶的大量營養(yǎng)鹽入海使珠江河口成為我國近岸海域最具生產(chǎn)力的水域之一。4—9月為豐水期, 其河口增水現(xiàn)象顯著;10月至次年3月, 河口徑流變小, 為枯水期。

1.2 樣本采集

在珠江河口設(shè)置11個站點, 鹽度2.65‰—32.52‰,基本覆蓋珠江河口水域(圖1)。于2020年3月進行了水樣采集和拖網(wǎng)采樣。

利用環(huán)境DNA宏條碼檢測的水樣通過采水器采集, 采樣站位共11個, 分別采取采集表層水(水下1 m)、中層水(水深小于10 m未取中層水)和底層水(離底1 m), 每層水各5 L, 混合后進行過濾, 濾膜為0.45 μm玻璃纖維濾膜(金晶, 上海), 1張膜過濾1 L水樣, 每個站點過濾8張濾膜, 濾膜置于離心管中,液氮保存。每個站點使用1 L蒸餾水進行過濾作為空白過濾對照。所有采水器和水壺在采樣前均經(jīng)過10%次氯酸鈉消毒。相關(guān)環(huán)境因子數(shù)據(jù)如深度、透明度、水溫、鹽度、pH及溶解氧等采用多功能水質(zhì)參數(shù)儀與水樣同步采集, 每個站位各1次。

底拖網(wǎng)站位共9個(A1和A11站點由于處于航道和垃圾沉積物過多無法進行拖網(wǎng)), 具體如圖 1。單拖網(wǎng)網(wǎng)具的上綱長度為36 m, 網(wǎng)口口目為5 cm,囊網(wǎng)網(wǎng)目為3 cm, 網(wǎng)衣全長50 m, 拖網(wǎng)時間0.5h。底拖網(wǎng)獲取的漁獲物經(jīng)初步分類后, 冷凍保存于船艙,航次結(jié)束后冷藏運回實驗室并于–20℃保存。魚類物種鑒定根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進行鑒定, 鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《中國魚類系統(tǒng)檢索》[26]。

圖1 珠江河口采樣站位Fig. 1 Sampling stations in the Pearl River Estuary正方形圖標(biāo)表示該站點只進行了環(huán)境DNA宏條碼研究, 三角形圖標(biāo)表示該站點只進行了底拖網(wǎng)研究, 圓形圖標(biāo)表示該站點同時使用了兩種方法。實線矩形代表Zou等[4]研究區(qū)域, 虛線矩形代表Cheang等[25]研究區(qū)域The square icon indicates that the site only conducts environmental DNA macro bar code research, the triangle icon indicates that the site only conducts bottom trawling research, and the circular icon indicates that the site uses two methods at the same time. The solid rectangle represents the research area of Zou et al.[4], and the dotted rectangle represents the research area of Cheang et al.[25]

1.3 目的片段的獲取

為減少外來環(huán)境DNA的污染, 本實驗中所有實驗耗材均都先經(jīng)過10%漂白劑消毒, 然后經(jīng)過2h紫外線照射消毒。PCR擴增實驗均使用蒸餾水作為陰性對照, 檢測實驗室是否存在污染。將濾膜剪碎,使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, 德國)依照使用說明進行提取。

使用引物MiFish-U/E-F: 5′-GTCGGTAAAWC TCGTGCCAGC-3′和MiFish-U/E-F: 5′-CATAGTG GGGTATCTAATCCYAGTTTG-3′[27]擴增線粒體12S rRNA片段序列作為標(biāo)記。使用2× ProTaqMaster Mix 試劑盒(艾瑞克公司), 擴增體系(總體積50 μL)如下: 25 μL Mix, 3 μLDNA模板, 正反引物各1 μL, 20 μL去離子水。反應(yīng)程序: 98℃預(yù)變性2min,98℃變性10s, 60℃復(fù)性30s, 72℃延伸20s; 進行25個循環(huán), 最后72℃延伸5min。將PCR產(chǎn)物用去離子水稀釋10倍作為第二次擴增的模板, 在原始引物的5′端添加12個堿基的barcode序列作為第二次PCR擴增引物, 其余組分保持不變。兩次PCR擴增程序不變。兩步PCR擴增后, PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中檢測, 過濾空白或陰性對照均未顯示擴增。此外A5站點所有樣品也未顯示擴增, 故去掉A5站點環(huán)境DNA分析, 剩余10個站點, 每個站點實驗3個重復(fù)樣品, 共30個樣品。每份樣品重復(fù)擴增3次, 將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后, 使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (AXYGEN)純化, 送公司使用Novaseq 6000測序儀器進行高通量測序。

1.4 歷史數(shù)據(jù)調(diào)查

對照往年珠江河口魚類資源調(diào)查文獻[4, 16,20—22, 28, 29], 整理得到珠江河口魚類名錄。珠江河口水域已有兩項基于環(huán)境DNA宏條碼的魚類多樣性研究[4,25], 對其所檢測魚類物種進行統(tǒng)計, 物種的有效學(xué)名以Fishbase數(shù)據(jù)庫(www.fishbase.org)為準(zhǔn)(圖1)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

高通量測序數(shù)據(jù)利用fastp軟件(https://github.com/OpenGene/fastp )對雙端的Raw Reads數(shù)據(jù)進行滑窗質(zhì)量剪裁, 根據(jù)cutadapt 軟件(https://github.com/marcelm/cutadapt/)去除首尾兩端的引物序列, 利用usearch(http://www.drive5.com/usearch/ 預(yù)設(shè)參數(shù)包含最小 overlap 長度設(shè)置為 16 bp, 拼接序列的overlap 區(qū)允許的最大錯配 5 bp 等), 過濾不符合的Tags,獲得原始的拼接序列(Raw Tags)。然后利用 fastp對Raw Tags數(shù)據(jù)進行滑窗質(zhì)量剪裁, 得到有效的拼接片段(Clean Tags)。最后使用UPARSE以97%閾值對OTU進行聚類[30]。

將得到的OTU與Mitofish數(shù)據(jù)庫[31]和Gen-Bank數(shù)據(jù)庫[32]進行序列比對。在使用12S rRNA序列進行環(huán)境DNA宏條碼分析時, 研究者一般采用96%—100%作為種的相似度閾值[4,12,33—35]。我們在之前的研究中收集珠江河口172種魚類12S rRNA序列, 經(jīng)過比較得出最大種內(nèi)遺傳距離為0.017, 等同于98.3%的種的相似度閾值[36]。故在本研究中,選用98.3%作為種的相似度閾值。當(dāng)OTU序列相似度小于98.3%, 直接被排除。此外本研究只進行魚類多樣性分析, 故剔除了非魚物種。每個采樣點3個重復(fù)樣品匹配到物種的序列數(shù)進行合并處理。

使用Excel統(tǒng)計環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)檢測到的魚類目、科、屬和種。為比較環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)方這兩種方法的研究結(jié)果, 僅選取共有的8個站位數(shù)據(jù), 具體站位如圖 1。為比較兩種方法所檢測地區(qū)Alpha多樣性, 使用R軟件中的vegan包計算基于物種豐富度數(shù)據(jù)計算Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù), 隨后采用t檢驗進行兩種指數(shù)的差異分析[37]。為比較兩個方法在檢測各個站點空間分布差異, 使用 R 軟件的vegan包基于Bray-Curtis距離進行主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis,PCoA)[37]。為了解魚類群落與環(huán)境因子的關(guān)系, 使用R軟件中的vegan包進行去趨勢對應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA), 基于環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)兩種方法的Axis length前4個軸均小于4, 所以選用冗余分析(Redundancy analysis, RDA)進行環(huán)境因子分析[37]。

2 結(jié)果

2.1 珠江河口魚類多樣性

環(huán)境DNA宏條碼方法獲得已知物種12S rRNA序列2099125條, 共比對出15 目63科125屬175種魚類(表1)。在珠江河口9個站點底拖網(wǎng)采樣中, 發(fā)現(xiàn)9目22科39屬47種魚類。綜合兩種方法, 共獲得15目63科128屬179種魚類(表1)。共有魚類43種(占底拖網(wǎng)91.49%), 36屬(占總檢測屬94.87%), 22科(占總檢測科100%; 圖 2), 此外通過環(huán)境DNA宏條碼未能檢測到4種物種分別是斑鰶(Konosirus punctatus)、南方?(Callionymus meridionalis)、尖嘴魟(Dasyatis zugei)和硬頭骨鯔(Osteomugil strongylocephalus),這些物種僅由底拖網(wǎng)檢測到。

圖2 基于環(huán)境DNA宏條碼(A)和底拖網(wǎng)(B)檢測到的各采樣點的魚類物種組成Fig. 2 The composition of fish species at each sampling site detected by environmental DNA metabarcoding (left) and bottom trawling(right)Total表示所有站點的魚類組成集合Total represents a collection of fish from all sites

表1 通過環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)檢測珠江河口魚類類群數(shù)量Tab. 1 The number of fish taxa detected in the Pearl River Estuary from eDNA metabarcoding and bottom trawling

通過環(huán)境DNA宏條碼所檢測reads數(shù)最多的8個物種依次是棘頭梅童魚(Collichthys lucidus;21.04%)、黃澤小沙丁(Sardinella lemuru; 19.82%),大黃魚(Larimichthys crocea; 7.05%)、眶棘雙邊魚(Ambassis gymnocephalus; 6.52%)、中華小公魚(Stolephorus chinensis; 5.93%)、鳳鱭(Coilia mystus;5.86%)、銀鯧(Pampus argenteus; 5.04%)和龍頭魚(Harpadon nehereus; 4.14%), 這8種魚類在10個采樣點的總序列豐度遠高于其他物種, 是環(huán)境DNA宏條碼調(diào)查的優(yōu)勢種(圖3A)。通過底拖網(wǎng)所采集最多的6個物種依次是赤鼻棱鳀(Thryssa kammalensis;18.62%)、頸帶鲾(Nuchequula nuchalis; 16.28%)、鹿斑鲾(Secutor ruconius; 16.01%)、杜氏棱鳀(Thryssa dussumieri; 10.50%)、中華小公魚(Stolephorus chinensis; 10.20%)和鳳鱭(Coilia mystus;8.06%), 這6種魚類在9個采樣點的總數(shù)目遠高于其他物種, 表明這6種魚類是底拖網(wǎng)調(diào)查的優(yōu)勢種(圖3B)。

2.2 珠江河口歷史調(diào)查數(shù)據(jù)

綜合文獻調(diào)查, 我們統(tǒng)計得出10年內(nèi)珠江河口底拖網(wǎng)捕獲魚類332種, 與本研究環(huán)境DNA宏條碼方法共同檢測出115種(圖3A)。Zou等[4]通過環(huán)境DNA宏條碼在珠江河口南沙濕地檢測魚類57種, 與本研究環(huán)境DNA宏條碼方法共同檢測出22種(圖3B);Cheang等[25]通過環(huán)境DNA宏條碼在珠江河口外?？跈z測出魚類22種, 與本研究環(huán)境DNA宏條碼方法共同檢測出1種, 為雙帶縞蝦虎(Tridentiger bifasciatus; 圖 3C)。

圖3 基于環(huán)境DNA宏條碼檢測到的魚類物種和珠江河口歷史調(diào)查數(shù)據(jù)的維恩圖Fig. 3 Venn diagrams based on fish species detected by environmental eDNA metabarcoding and historical survey data of the Pearl River Estuary灰色區(qū)域代表本研究環(huán)境DNA宏條碼所檢測物種, 白色區(qū)域分別代表歷史底拖網(wǎng)調(diào)查(A)、Zou等[4](B)、cheang等[25](C)The grey area represents the species detected by the environmental DNA metabarcoding in this study, and the white area represents the historical bottom trawling survey (A), Zou, et al.[4] (B),Cheang, et al.[25] (C)

2.3 不同調(diào)查方法的比較

底拖網(wǎng)8個站點的平均Shannon指數(shù)為2.58, 而環(huán)境DNA宏條碼的平均Shannon指數(shù)為3.37, 環(huán)境DNA宏形碼顯著大于底拖網(wǎng)方法(P<0.001; 圖 4A);底拖網(wǎng)8個站點的平均Simpson指數(shù)為0.77, 環(huán)境DNA宏條碼的平均Simpson指數(shù)為0.82, 環(huán)境DNA宏條碼顯著大于底拖網(wǎng)方法(P<0.05; 圖 4B)。兩種指數(shù)均表示環(huán)境DNA宏條碼所檢測的珠江河口魚類群落α多樣性顯著大于底拖網(wǎng)方式。

圖4 基于Shannon指數(shù)(A)和Simpson指數(shù)(B)珠江河口魚類群落α多樣性Fig. 4 Fish community α diversity based on Shannon index (left)and Simpson index (right) in the Pearl River Estuary*表示P<0.05, ***表示P<0.001* indicates P<0.05, *** indicates P<0.001

由圖 5A可知, 在使用環(huán)境DNA宏條碼檢測珠江河口魚類空間分布時, 基于Bray-Curtis距離的PcoA結(jié)果顯示C1、C2、C4、B4和B5十分接近, 表示這5個站點魚類群落結(jié)構(gòu)具有很大的相似性, 其余A8、A10和B3三個站點相距較遠, 形成了4種魚類群落結(jié)構(gòu)。而使用底拖網(wǎng)方法基于Bray-Curtis距離PCOA分析結(jié)果表示, 8個站點之間魚類群落結(jié)構(gòu)均存在差異, 其中C1和C2較為接近, A8和B5較為接近, B3和B4較為接近, C4和A10較為接近(圖5B)。這表示兩種方法在檢驗珠江河口魚類群落結(jié)構(gòu)的空間分布存在差異。

圖5 基于環(huán)境DNA宏條碼(A)和底拖網(wǎng)(B)各站點所檢測魚類的組成相似性Fig. 5 The composition similarity of fish detected at each site is based on the environmental DNA metabarcoding (A) and bottom trawling (B)

2.4 環(huán)境因子對珠江河口魚類群落的影響

利用環(huán)境因子與各站點魚類序列豐富度進行RDA分析(圖6A), 在使用環(huán)境DNA宏條碼時, 第 1排序軸(RDA1)特征值為42.69%, 第 2 排 序 軸(RDA2)特 征 值 為24.59%, 累積百分率為67.28%。透明度、溶解氧和鹽度與第 1 排序軸的相關(guān)系數(shù)分別是0.44、0.38和0.34, 即沿RDA排序軸第一軸從左到右透明度、溶解氧和鹽度逐漸升高, 在所有6個環(huán)境因子中, 透明度與第一軸的相關(guān)性最大。結(jié)果表明使用環(huán)境DNA宏條碼時, 透明度、溶解氧和鹽度是珠江河口魚類群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。

在使用底拖網(wǎng)方法時, 第 1 排序軸(RDA1)特征值為90.62%, 第2排序軸(RDA2)特征值為5.02%,累積百分率高達95.64%, 表明第一軸含有魚類群落與環(huán)境因子之間關(guān)系的90%以上信息(圖6B)。深度、溶解氧、鹽度和pH與第 1 排序軸的相關(guān)系數(shù)分別是0.88、0.81、0.64和-0.58, 即沿RDA排序軸第一軸從左到右深度, 溶解氧, 鹽度逐漸升高, pH逐漸降低, 在所有6個環(huán)境因子中, 深度與第一軸的相關(guān)性最大。結(jié)果表明使用底拖網(wǎng)時, 深度、溶解氧、鹽度和pH是珠江河口魚類群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。

圖6 基于環(huán)境DNA宏條碼(A)和底拖網(wǎng)(B)所檢測魚類群落與環(huán)境因子的關(guān)系Fig. 6 The relationship between fish community and environmental factors based on environmental DNA metabarcoding (A) and bottom trawling (B)

3 討論

3.1 環(huán)境DNA宏條碼適用于珠江河口魚類多樣性的評估

在本研究中, 環(huán)境DNA宏條碼的物種檢測率為97.77%(175種), 而底拖網(wǎng)方式的物種檢測率為26.26%(47種), 表明環(huán)境DNA宏條碼在檢測魚類物種豐富度上要優(yōu)于拖網(wǎng)方法, 并且檢測到了真鯊目(Carcharhiniformes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、鲉形目(Scorpaeniformes)、海龍目(Syngnathiformes)、巨口魚目(Stomiiformes)及鯉形目(Cypriniformes)的物種。根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示, 環(huán)境DNA宏條碼所檢測的α多樣性也顯著高于底拖網(wǎng), 這表示環(huán)境DNA宏條碼能更加全面地反映魚類豐富度和均勻度。因為傳統(tǒng)的底拖網(wǎng)調(diào)查方法需要訓(xùn)練有素的分類學(xué)專家的參與, 因此受限制比較大, 并且由于棲息地異質(zhì)性的不同, 尤其是地形復(fù)雜的河口地區(qū), 例如珠江河口地區(qū)多航道、河砂開采區(qū)和潮汐通道等, 水下地貌特征變化大, 傳統(tǒng)的拖網(wǎng)調(diào)查就很難實施, 導(dǎo)致無法捕獲到所有種類的魚類, 從而低估其魚類多樣性[38,39]。而環(huán)境DNA在空間上是流動的, 可以在小的空間和時間尺度上整合生物多樣性, 并規(guī)避由棲息地類型和魚類行為差異造成的影響[40,41]。由于單航次的短時間的底拖網(wǎng)捕撈會造成底拖網(wǎng)采集的魚類多樣性偏低, 因此需要與多次的歷史數(shù)據(jù)進行比較。

對比歷史數(shù)據(jù), 環(huán)境DNA宏條碼檢測出115種魚類出現(xiàn)在珠江河口底拖網(wǎng)檢測中, 占自身檢測物種的66%, 這表明環(huán)境DNA宏條碼具有較高的準(zhǔn)確率。此外雖然存在34%的物種沒有出現(xiàn)在本研究歷史統(tǒng)計數(shù)據(jù)中, 例如黃魟(Dasyatis bennetti)、日本燕魟(Gymnura japonica)和花點鰣(Hilsa kelee)等的近海物種, 這可能由于珠江河口外?？诘牡淄暇W(wǎng)數(shù)據(jù)十分稀少, 導(dǎo)致本研究魚類目錄收集不完整,而本研究有5個環(huán)境DNA采樣點處于外?？? 所以造成部分檢測物種沒有出現(xiàn)在歷史統(tǒng)計數(shù)據(jù)中[42,43]。

相比于之前關(guān)于珠江河口水域環(huán)境DNA宏條碼的研究, 本研究所檢測物種遠多于Zou等[4]和Cheang等[25], 這可能由于研究區(qū)域大小的不同(圖1),我們的研究范圍鹽度跨度大, 因此檢測魚類包括了淡水魚類、咸淡水魚類和海水魚類。此外我們的采樣點(A10、A11和C4)處于萬山群島, 該地區(qū)是珠江河口海水魚類重要的產(chǎn)卵育肥場, 魚類種類繁多, 所以本研究能檢測到更多的魚類[43]。Zou等[4]在鹽度偏低的南沙濕地進行環(huán)境DNA采樣, 所以檢測到較多淡水魚, 例如胡子鲇(Clarias fuscus)、廣東魴(Megalobrama terminalis)和草魚(Ctenopharyngodon idella)等, 故能單獨檢測出35種魚類。本研究與cheang等[25]僅檢測出1種相同魚類, 相似的是Zou等[4]與Cheang等[25]也僅檢測出1種相同魚類, 這很大程度上由于選取引物的不同。本研究和Zou等[4]選用擴增12S rRNA基因區(qū)域的Mifish通用引物, 該引物在最近的研究中已證明其性能優(yōu)于其他競爭引物[5,44]。而Cheang等[25]選用擴增COⅠ基因區(qū)域的mICOIintF-jgHCO2198引物進行擴增, 該引物針對后生動物, 而Collins等[45]研究顯示擴增COⅠ基因區(qū)域的引物對原核生物和非魚類真核生物DNA的非特異性擴增會導(dǎo)致大量的測序浪費, 使其在魚類環(huán)境DNA宏條碼中的應(yīng)用較為困難, 所以造成本研究與該研究物種檢測差距巨大。

與本研究底拖網(wǎng)檢測相比, 有4種魚類未被環(huán)境 DNA宏條碼所檢測到。其中南方?和硬頭骨鯔在公共數(shù)據(jù)庫中記錄很少, 這可能造成序列未能匹配到。因此一個完整的比對數(shù)據(jù)庫對環(huán)境DNA宏條碼是十分必要的, 以前的環(huán)境DNA 宏條碼研究也將錯誤識別歸因于比對數(shù)據(jù)庫的不完善[17,39]。此外, 在 PCR 過程中引物和引物結(jié)合位點之間的親和力較低時, 導(dǎo)致有些物種序列無法擴增, 從而導(dǎo)致一些種類不能被識別出來, 這可能是斑鰶和尖嘴魟無法檢測到的原因。為避免今后出現(xiàn)此類情況, 可以使用多對通用引物進行研究[46,47]。

3.2 珠江河口魚類群落結(jié)構(gòu)的特征

在本研究中, 我們采用環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)兩種方式, 在珠江河口共檢測到16 目64科128屬的179種魚類。其中, 物種最多的目為鱸形目, 共104種, 占58.10%, 鯡形目次之, 占13.67%, 這與早期珠江口水域魚類群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致, 珠江口魚類鱸形目占絕對優(yōu)勢[48]。對照往年珠江口魚類資源實地調(diào)查文獻[20, 49—53]顯示, 珠江口咸淡水魚類優(yōu)勢種為棘頭梅童魚、鳳鱭、杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀, 海水優(yōu)勢種為麗葉鲹(Alepes djedaba)、帶魚(Trichiurus lepturus)和銀鯧; 而本研究綜合環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)兩種方式, 得出珠江河口3月優(yōu)勢種為棘頭梅童魚、黃澤小沙丁、赤鼻棱鳀、頸帶鲾、鹿斑鲾、中華小公魚、鳳鱭、杜氏棱鳀、大黃魚和眶棘雙邊魚。與歷史數(shù)據(jù)相比, 本研究優(yōu)勢種缺少3種海水魚類, 它們主要生活在珠江河口以南的近海, 而在歷史數(shù)據(jù)中, 珠江口水域包括淡水, 河口, 近海3個區(qū)域, 而本研究采樣點主要集中在河口區(qū)域, 雖然也檢測到麗葉鲹、帶魚和銀鯧, 但物種比例較少, 不能形成優(yōu)勢種[48,51]。此外珠江河口不同季節(jié)魚類優(yōu)勢種存在顯著差異, 本研究只得出3月魚類優(yōu)勢種, 故與往年珠江口魚類優(yōu)勢種存在些許不同[52]。珠江河口的軟骨魚類一直少有記錄, 本研究檢測到日本燕魟、尖頭斜齒鯊(Scoliodon laticaudus)和黃魟, 其中黃魟在近年珠江口魚類資源實地調(diào)查未被發(fā)現(xiàn), 可能由于該物種屬于海水種, 棲息在珠江口外圍海域, 此外該物種還存在季節(jié)性洄游性, 所以在珠江河口內(nèi)極少捕獲[53]。此外對于珠江河口瀕危物種—黃唇魚(Bahaba taipingensis), 通過環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)兩種方式均未檢測到, 表明該物種可能已十分稀少, 應(yīng)積極開展保護工作。

魚類群落結(jié)構(gòu)在不同區(qū)域存在著差異, 這種組成差異性在維持生態(tài)系統(tǒng)功能方面起著至關(guān)重要的作用[33,54]。在本研究中, 環(huán)境DNA宏條碼方法通過PCoA分析顯示C1、C2、C4、B4和B5這5個站點魚類群落結(jié)構(gòu)十分相似, 而在地理位置上, C1、C2和B4三個站點與C4和B5兩個站點相差較遠, 且A8和A10處于該區(qū)域中間, 這造成了魚類群落結(jié)構(gòu)空間重疊。這可能由于在珠江河口潮汐和徑流的作用下, 形成了強大的水動力, 導(dǎo)致環(huán)境DNA在水體中移動, 一個站點很有可能檢測到另一個站點的物種, 即使該物種留在水體的DNA極其稀少[55]。此外, 在進行高通量測序之前, 多次的PCR擴增可能會放大某些魚的DNA, 所以這可能最終導(dǎo)致相距較遠的魚類群落結(jié)構(gòu)十分相似。而在底拖網(wǎng)檢測中,通過PCoA分析顯示每個站點之間魚類群落結(jié)構(gòu)存在較大差異, B3和B4站點處于珠江河口西面, 該水域淡水入海口多, 受徑流影響大, 鹽度相對較低, 存在淡水魚類; C1和C2站點處于珠江河口東面, 受徑流影響小, 鹽度適中, 以咸淡水魚類為主; 剩余B5、A10、A8及C4站點基本處于海洋環(huán)境, 鹽度較大,以咸淡水魚和海水魚為主[56]。當(dāng)然只基于8個站點的數(shù)據(jù)無法展現(xiàn)出完整的珠江河口魚類群落空間分布格局, 如需展示更加完整的珠江河口魚類群落結(jié)構(gòu)圖, 需要增加更加密集的站位進行研究。

3.3 鹽度和溶解氧對珠江河口魚類群落結(jié)構(gòu)的影響

魚類生長繁殖受外界環(huán)境因子的影響, 例如溫度會影響魚類新陳代謝的反應(yīng)速率, 鹽度會影響魚類呼吸代謝和消化能力, 水深影響游泳動物的生長、發(fā)育和分布等[57—59]。本研究對珠江河口魚類與環(huán)境因子進行RDA分析, 基于環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)方法均顯示鹽度和溶解氧是影響該地區(qū)魚類群落的主要環(huán)境因子, 均呈正相關(guān)。珠江河口魚類優(yōu)勢種一直以咸淡水種為主, 能適應(yīng)鹽度的變化。珠江河口3月處于枯水期, 地表徑流小, 珠江河口內(nèi)灣水交換能力變?nèi)? 食物能量變少[60]。此外在徐姍楠等[61]的研究中, 浮游植物群在枯水期也與鹽度呈正相關(guān), 表示浮游植物群在鹽度高的水域更適合生長, 為魚類提供更多的食物, 導(dǎo)致魚類更喜歡在鹽度更高的外灣, 所以與鹽度呈正相關(guān)。由于珠江河口灣內(nèi)海域接近廣州市區(qū), 珠江徑流帶來大量有機污染物降解消耗了溶解氧, 導(dǎo)致溶解氧含量較低, 此外, 珠江河口處于枯水期, 灣內(nèi)水交換條件差,也是導(dǎo)致溶解氧較低的另一個原因。而魚類在此期間活動在溶解氧高的外圍, 所以導(dǎo)致溶解氧與魚類群落呈現(xiàn)正相關(guān)[62]。

4 結(jié)論

在本研究中, 環(huán)境DNA 宏條碼應(yīng)用于復(fù)雜的河口生態(tài)系統(tǒng), 所檢測魚類大部分符合珠江河口歷史調(diào)查魚類, 表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。對比同一航次底拖網(wǎng)調(diào)查, 環(huán)境DNA 宏條碼可以檢測到更多物種, 這意味著在未來可以大量減少采樣時間和降低檢測頻率。兩種方法均能展示珠江河口魚類群落存在空間結(jié)構(gòu), 不過基于環(huán)境DNA宏條碼的分析顯示空間重疊更多。基于環(huán)境DNA宏條碼和底拖網(wǎng)均顯示溶解氧和鹽度是影響魚類群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。當(dāng)然比對數(shù)據(jù)庫的不完善及通用引物的局限性, 還是可能會導(dǎo)致我們可能低估魚類多樣性, 并且不能替代提供表型信息和目標(biāo)物種準(zhǔn)確位置的傳統(tǒng)方法, 我們建議現(xiàn)代生物監(jiān)測程序應(yīng)將環(huán)境DNA宏條碼與傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)合起來, 可以提供更可靠、更清晰的魚類多樣性圖景。