基于巨噬細(xì)胞極化探究唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（ST6GalⅠ）對(duì)腎透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)及免疫功能的影響①

李前進(jìn) 王玉杰 劉 強(qiáng) 馬雙鈺 拜合提亞·阿扎提

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，烏魯木齊 830054）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是全球第二位高病死率的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于腎小管上皮細(xì)胞［1］。近年來(lái)，RCC的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)［1-2］。腎透明細(xì)胞癌是常見(jiàn)的RCC組織學(xué)類型，占所有RCC病例的80%以上，并且具有高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的特點(diǎn)［2］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腎透明細(xì)胞癌可以在早期階段治愈，而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后不良，五年生存率僅為10%［3］。因此，迫切需要探索腎透明細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找腎透明細(xì)胞癌的新預(yù)后生物標(biāo)志物。

唾液酸化是在各種糖綴合物的末端添加唾液酸的修飾作用，涉及細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)過(guò)程［4］。α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（α-2，6-sialyltransferaseⅠ，ST6GalⅠ）是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，在細(xì)胞唾液酸化的水平中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展及存活與ST6GalⅠ的異常變化密切相關(guān)，例如在結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中ST6GalⅠ呈高表達(dá)［5-7］。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的主要細(xì)胞類型，可響應(yīng)各種外部刺激而被激活，可以根據(jù)系統(tǒng)中刺激類型產(chǎn)生炎癥或抗炎反應(yīng)，因此該過(guò)程依賴于多種信號(hào)通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控來(lái)發(fā)揮作用［8］。本研究通過(guò)檢測(cè)ST6GalⅠ在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)，探討靶向下調(diào)ST6GalⅠ表達(dá)THP-1細(xì)胞與腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)后，對(duì)786-O細(xì)胞存活、凋亡與轉(zhuǎn)移的影響，以闡明ST6GalⅠ在腎透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)中的作用途徑，為腎透明細(xì)胞癌的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集2018年1月至2019年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科治療的50例腎透明細(xì)胞癌患者的腫瘤組織及其未受侵犯的癌旁組織標(biāo)本，且已經(jīng)病理證實(shí)。其中男性36例，女性14例，年齡31～72歲，平均年齡（50.62±7.36）歲。腫瘤分期根據(jù)2010年AJCC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期21例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例；病理分級(jí)按Fuhrman標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)11例，Ⅳ級(jí)3例；按腫瘤直徑大小分為：直徑≤4 cm 22例，直徑＞4 cm 28例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)任何治療，本研究已獲得所有患者及家屬知情同意。

1.1.2 主要材料與試劑 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O和THP-1人單核細(xì)胞由中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。胎牛血清、青霉素-鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司，PMA、IL-4購(gòu)自Sigma公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Transwell小室、Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；免疫組化染色試劑、MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自碧云天生物研究所；IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)自北京全式金生物公司；抗體ST6GalⅠ、CD206、TIM-1、VEGF購(gòu)自Abcam公司；GAPDH購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和ECL發(fā)光液購(gòu)自江蘇凱基生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 將收集的腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織及其癌旁組織置于4%多聚甲醛液中固定，進(jìn)行常規(guī)修剪包埋，浸于梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，切成4μm石蠟組織切片。將切片脫蠟水化，采用2%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液在高溫下進(jìn)行抗原修復(fù)，加入滅活內(nèi)源性3%H2O2處理10 min，PBS洗滌，滴加ST6GalⅠ抗體（1∶200），4℃下孵育過(guò)夜。次日，PBS沖洗切片，再加入二抗（1∶1 000）置于室溫下孵育1 h，PBS沖洗干凈，滴加DAB染核5 min，蘇木精復(fù)染，脫水透明，采用中性樹(shù)膠封片，于電鏡下進(jìn)行觀察。

結(jié)果判定：陽(yáng)性表現(xiàn)為染色呈黃色、棕黃色至棕褐色，隨機(jī)觀察6個(gè)400倍鏡視野，以陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)定。染色強(qiáng)度無(wú)色計(jì)0分；淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例＜5%計(jì)為0分，5%～30%計(jì)為1分，31%～60%計(jì)為2分，＞60%計(jì)為3分。判定結(jié)束后將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例的評(píng)分相乘，＜2分判定為陰性（-）結(jié)果，≥2分判定為陽(yáng)性（+）結(jié)果。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol試劑提取腫瘤組織、癌旁組織及各處理細(xì)胞中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度、濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作合成cDNA，以此cDNA為模板，利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行定量，檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件設(shè)置為：95℃3 min，1個(gè)循環(huán)；95℃30 s、60℃30 s、58℃30 s，40個(gè)循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將THP-1細(xì)胞放在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，且置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，吸取100μl接種于6孔培養(yǎng)板，并鋪板于不含抗生素的Opti-MEM中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、siRNA-NC組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA-NC質(zhì)粒）和siRNA-ST6GalⅠ組（轉(zhuǎn)染siRNA-ST6GalⅠ質(zhì)粒），根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，將轉(zhuǎn)染試劑加入細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h，棄培養(yǎng)液，更換為新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組THP-1細(xì)胞中ST6GalⅠmRNA與蛋白表達(dá)變化，以評(píng)估轉(zhuǎn)染結(jié)果。

1.2.4 誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化 取轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml，吸取100μl接種于6孔培養(yǎng)板，加入終濃度為50 ng/ml的PMA誘導(dǎo)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗后，加入終濃度為20 ng/ml的IL-4誘導(dǎo)48 h，以不進(jìn)行誘導(dǎo)處理的THP-1細(xì)胞作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Arg-1和iNOS蛋白的表達(dá)，檢測(cè)各處理組THP-1細(xì)胞極化情況。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá) 收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，采用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，取適量細(xì)胞懸液，并加入等體積的小鼠血清，置于室溫下封閉30 min，去除非特異性結(jié)合，加入PECD206抗體，置于4℃暗室中反應(yīng)30 min，PBS洗滌細(xì)胞后將其再次重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。

1.2.6 巨噬細(xì)胞與786-O細(xì)胞共培養(yǎng) 在24孔Transwell小室的上室接種轉(zhuǎn)染后的THP-1細(xì)胞，密度為1×104個(gè)/孔，按照1.2.4的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成前1 d，在Transwell小室的下室均接種786-O細(xì)胞，密度為1×104個(gè)/孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。共培養(yǎng)72 h后收集下室中的786-O細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)分組具體設(shè)置為786-O組（上室：細(xì)胞培養(yǎng)液，下室：786-O細(xì)胞）、M2+786-O組（上室：對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理，下室：786-O細(xì)胞）、M2+NC 786-O組（上室：對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA-NC質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理，下室：786-O細(xì)胞）、M2+ST6GalⅠ786-O組（上室：對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA-ST6GalⅠ質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理，下室：786-O細(xì)胞）。

1.2.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集處理72 h后的786-O細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入500μl用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的MTT試劑（0.5 mg/ml）混合均勻，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后棄去培養(yǎng)液，加入600μl DMSO，搖床振蕩至結(jié)晶物完全溶解，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值（A值），檢測(cè)細(xì)胞存活情況。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 收集處理72 h后的786-O細(xì)胞，在6孔培養(yǎng)板大約每隔0.5 cm劃一道橫線，然后在每孔中加入5×105個(gè)各處理組的786-O細(xì)胞，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日，利用移液槍槍頭比對(duì)直尺，沿著垂直于細(xì)胞培養(yǎng)孔背后橫線劃痕，采用PBS洗去劃痕下的細(xì)胞，加入無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h取樣觀察各處理組細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處理72 h后的786-O細(xì)胞，消化離心，制成細(xì)胞懸液，根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，檢測(cè)各處理組細(xì)胞凋亡情況。在細(xì)胞中加入500μl

1×binding buffer輕輕混勻，得到細(xì)胞懸液，在細(xì)胞懸浮液加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，混勻后，置于室溫下避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.10 Western blot 在各處理組細(xì)胞中加入RIPA裂解液裂解并離心取上清液，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)量，取各組等量蛋白樣品上樣，經(jīng)過(guò)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，TBST緩沖液洗膜，加入5%脫脂奶粉液，室溫下封閉1 h。然后加入稀釋 的 一抗ST6GalⅠ（1∶1 000）、TIM-1（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000），以GAPDH（1∶1 000）作為內(nèi)參蛋白，4℃下孵育過(guò)夜。次日，TBST緩沖液清洗后，滴加對(duì)應(yīng)的二抗，置于室溫下繼續(xù)孵育2 h，TBST緩沖液再次洗膜，ECL發(fā)光液曝光，Image J軟件檢測(cè)各蛋白條帶灰度值。

1.2.11 ELISA檢測(cè) 786-O細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后培養(yǎng)72 h，收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1的含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織中ST6GalⅠ表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，在腎透明細(xì)胞癌組織中ST6GalⅠ陽(yáng)性表達(dá)率為84.0%（42/50）；在癌旁組織中，ST6GalⅠ陽(yáng)性表達(dá)率為14.0%（7/50）。與癌旁正常組織比較，腎透明細(xì)胞癌組織中ST6GalⅠ陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌組織與癌旁組織中ST6GalⅠmRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，腎透明細(xì)胞癌組織中ST6GalⅠmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織中ST6GalⅠmRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.01，圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中ST6GalⅠ表達(dá)檢測(cè) 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)各組THP-1細(xì)胞中ST6GalⅠmRNA和蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siRNA-ST6GalⅠ組細(xì)胞中ST6GalⅠmRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05），而siRNA-NC組和對(duì)照組ST6GalⅠmRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中ST6GalⅠmRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig.2 Detection of ST6GalⅠmRNA and protein expressionsin THP-1 cells after transfection

2.3 誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞形態(tài)及巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)變化 通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，如圖3A所示，THP-1細(xì)胞邊緣清晰，呈規(guī)則的圓形或類圓形。經(jīng)誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈不規(guī)則的多邊形，胞體伸出尾足。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PMA+IL-4誘導(dǎo)后，細(xì)胞中Arg-1 mRNA表達(dá)顯著升高，iNOS mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與PMA+IL-4組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-ST6GalⅠ后進(jìn)行誘導(dǎo)處理的細(xì)胞Arg-1 mRNA表達(dá)顯著下降，iNOS mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖3B）。

圖3 誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞形態(tài)變化及巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)檢測(cè)Fig.3 Morphological changes of THP-1 cells and expression of macrophages related markers after induction

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，PMA+IL-4誘導(dǎo)后細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與PMA+IL-4組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-ST6GalⅠ后進(jìn)行誘導(dǎo)處理的細(xì)胞中CD206表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。以上結(jié)果均說(shuō)明下調(diào)ST6GalⅠ可抑制IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M 2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206表達(dá)Fig.4 Flow cytometry to detect expression of M 2 macrophage marker CD206

2.4 下調(diào)ST6GalⅠ表達(dá)的巨噬細(xì)胞對(duì)786-O細(xì)胞存活率的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與786-O組比較，M2+786-O組786-O細(xì)胞的存活率顯著升高（P＜0.05）；M2+ST6GalⅠ786-O組細(xì)胞存活率較M2+786-O組則顯著下降（P＜0.05），而M2+NC786-O組與M2+786-O組的細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 MTT法檢測(cè)各處理組786-O細(xì)胞存活率Fig.5 MTT method to detect survival rate of 786-O cells in each treatment group

2.5 下調(diào)ST6GalⅠ表達(dá)的巨噬細(xì)胞對(duì)786-O細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與786-O組比較，M2+786-O組786-O細(xì)胞劃痕面積減小，劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）；與M2+786-O組比較，M2+ST6GalⅠ786-O組劃痕面積增加，劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05），M2+NC 786-O組與M2+786-O組的細(xì)胞劃痕愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組786-O細(xì)胞遷移Fig.6 Cell scratch test to detect migration of 786-O cells in each treatment group

2.6 下調(diào)ST6GalⅠ表達(dá)的巨噬細(xì)胞對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，M2+786-O組786-O細(xì)胞凋亡率與786-O組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與M2+786-O組比較，M2+ST6GalⅠ786-O組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），M2+NC 786-O組與M2+786-O組的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組786-O細(xì)胞凋亡Fig.7 Flow cytometry to detect 786-O cell apoptosis in each treatment group

2.7 下調(diào)ST6GalⅠ表達(dá)的巨噬細(xì)胞對(duì)786-O細(xì)胞上清液炎癥因子分泌的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與786-O組比較，M2+786-O組細(xì)胞上清液中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著下降，抑炎因子IL-10、TGF-β1含量顯著升高（P＜0.05）；與M2+786-O組比較，M2+ST6GalⅠ786-O組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著升高，同時(shí)，IL-10、TGF-β1含量顯著下降（P＜0.05），而M2+NC 786-O組與M2+786-O組細(xì)胞上清液中各因子含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各處理組786-O細(xì)胞上清中炎癥因子含量比較（±s，ng/L）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in supernatant of 786-O cells in each treatment group（±s，ng/L）

表2 各處理組786-O細(xì)胞上清中炎癥因子含量比較（±s，ng/L）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in supernatant of 786-O cells in each treatment group（±s，ng/L）

Note：1）P＜0.05 vs786-Ogroup；2）P＜0.05 vs M2+786-Ogroup.

Groups 786-O M2+786-O M2+NC 786-O M2+ST6GalⅠ786-O F P IL-1β 32.13±3.08 20.82±1.761）21.45±1.80 27.82±2.332）220.03 0.000 IL-6 26.53±1.67 12.82±1.711）11.92±0.84 22.67±1.862）318.98 0.000 IL-10 8.24±1.58 24.19±1.591）22.80±1.72 12.35±1.052）288.67 0.000 TNF-α 56.75±5.57 24.47±1.591）25.01±1.45 42.82±3.722）109.12 0.000 TGF-β1 358.65±27.89 560.23±44.341）557.38±38.56 416.38±31.952）1052.09 0.000

2.8 下調(diào)ST6GalⅠ表達(dá)的巨噬細(xì)胞對(duì)786-O細(xì)胞中免疫相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)各處理組786-O細(xì)胞中TIM-1、VEGF蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與786-O組比較，M2+786-O組細(xì)胞中TIM-1蛋白表達(dá)下降，VEGF蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與M2+786-O組比較，M2+ST6GalⅠ786-O組TIM-1蛋白表達(dá)升高，而VEGF蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；M2+NC 786-O組與M2+786-O組兩個(gè)蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 Western blot檢測(cè)各處理組786-O細(xì)胞中TIM-1、VEGF蛋白表達(dá)Fig.8 Western blot detection of TIM-1 and VEGF protein expressions in 786-O cells in each treatment group

3 討論

腎透明細(xì)胞癌是一種高度侵入性的泌尿外科惡性腫瘤，對(duì)于局部性腎透明細(xì)胞癌可以通過(guò)手術(shù)切除與放化療等手段進(jìn)行治療，而這些常規(guī)的治療方法對(duì)于轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的治療效果不佳，治療后復(fù)發(fā)率高，這也是RCC相關(guān)死亡的主要原因［3］。盡管在過(guò)去幾十年中，關(guān)于轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的治療研究取得了顯著進(jìn)展，靶向酪氨酸激酶抑制劑或免疫療法已得到了批準(zhǔn)。但，參與腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展的潛在靶標(biāo)以及確切的分子機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步深入探討以發(fā)掘診治腎透明細(xì)胞癌的新策略。

蛋白質(zhì)糖基化是一個(gè)復(fù)雜的翻譯后修飾過(guò)程，涉及將糖基部分轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上，通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）形成糖苷鍵。在各種糖基化類型中，唾液酸化能夠?qū)⑼僖核峒拥教堑鞍谆蛱侵暇厶擎湹哪┒?，唾液酸參與信號(hào)識(shí)別、神經(jīng)發(fā)育、免疫反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程［9］。一般而言，細(xì)胞中唾液酸水平的平衡由兩組酶調(diào)節(jié)，即唾液酸轉(zhuǎn)移酶和唾液酸酶。目前的研究已經(jīng)揭示ST6GalⅠ水平異常與多種疾病有關(guān)，如微生物感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥。WATTANAVISES等［10］研究報(bào)道指出膽管癌中ST3GalI和ST6GalⅠ的水平上調(diào)，且ST6GalⅠ與患者生存期密切相關(guān)；WICHERT等［11］研究分析了ST6GalⅠ在預(yù)測(cè)卵巢癌預(yù)后中的作用，表明ST6GalⅠmRNA高水平表達(dá)與淋巴管浸潤(rùn)有關(guān)，而ST6GalⅠ蛋白高水平表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和晚期階段相關(guān)；SCHULTZ等［12］研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3中過(guò)表達(dá)ST6GAL1后，腫瘤細(xì)胞呈較高的存活力和遷移能力，并且降低的Caspase-3活化從而抑制了細(xì)胞的凋亡，從而表明ST6GalⅠ誘導(dǎo)的唾液酸化可能對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，ST6GalⅠ在腎透明細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，由此推測(cè)ST6GalⅠ參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

遷移和細(xì)胞死亡導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)常駐巨噬細(xì)胞數(shù)量減少時(shí)，生長(zhǎng)因子和促炎細(xì)胞因子的刺激使血液中單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞并遷移到組織中以維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，并通過(guò)吞噬作用，抗原呈遞確保適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生［13］。因此，單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化是生物過(guò)程的重要組成部分。在體外實(shí)驗(yàn)中，THP-1巨噬細(xì)胞由于具有穩(wěn)定的敏感性與均一遺傳的背景而常用于各項(xiàng)研究［14］。作為腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞受多種趨化因子的影響可分化為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞響應(yīng)IFN、Toll樣受體配體、病原體相關(guān)分子復(fù)合物的作用而極化，分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子。M2型巨噬細(xì)胞因子IL-4和IL-13誘導(dǎo)所激活，并分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子［15-16］。本實(shí)驗(yàn)選取腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞和THP-1源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建腎透明細(xì)胞癌相關(guān)巨噬細(xì)胞模型，驗(yàn)證ST6GalⅠ在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)對(duì)腎透明細(xì)胞癌的作用，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ST6GalⅠ的THP-1細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后再與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞具有抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡并減少其遷移。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制ST6GalⅠ表達(dá)可逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，由此推測(cè)ST6GalⅠ可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化參與腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)程。

慢性炎癥和免疫反應(yīng)是腫瘤微環(huán)境的兩個(gè)核心要素。腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫/炎癥細(xì)胞，包括腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和髓樣來(lái)源抑制性細(xì)胞，以及細(xì)胞因子如IL-6、IL-10、TGF-β等，這種既有慢性炎癥狀態(tài)又有免疫抑制的作用共同調(diào)節(jié)了腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗癌藥物的敏感性［17］。一方面，分泌的細(xì)胞因子改變了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的功能，從而抑制了腫瘤特異性的免疫反應(yīng)，從而為腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)了特殊的免疫抑制性微環(huán)境；另一方面，腫瘤細(xì)胞通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路改變了腫瘤微環(huán)境中免疫/炎癥細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［18］。研究表明，在一些因素的影響下，可降低腫瘤的免疫抑制引發(fā)腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡。而腫瘤微環(huán)境中分泌的免疫抑制因子，如VEGF是引起腫瘤免疫逃逸的一個(gè)主要原因，而TIM-1可調(diào)節(jié)多種效應(yīng)性T細(xì)胞的表達(dá)，影響Th1/Th2細(xì)胞平衡［19］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)ST6GalⅠ的THP-1細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量升高，同時(shí)，TIM-1蛋白表達(dá)升高而VEGF蛋白表達(dá)下降，由此推測(cè)ST6GalⅠ可能與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞免疫相關(guān)分子表達(dá)相關(guān)，進(jìn)而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞免疫功能。

綜上所述，ST6GalⅠ促使腎透明細(xì)胞癌惡化的途徑可能是通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，增加促腫瘤生長(zhǎng)因子等的分泌來(lái)調(diào)控免疫相關(guān)功能，而誘發(fā)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。但具體調(diào)控過(guò)程尚未闡明，還需后續(xù)進(jìn)行深入的探索，以期為腎透明細(xì)胞癌治療的潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。