小鼠心臟移植排斥反應(yīng)抑制的研究進(jìn)展*

郭 磊 唐一鑫 魏 然 辛本凱 朱翠琳 張紀(jì)周

(1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，長春 130021)(2.吉林大學(xué)白求恩第二臨床醫(yī)院 心血管外科，長春 130022)

心臟移植是針對終末期心力衰竭患者進(jìn)行的手術(shù)治療，患者術(shù)后盡管接受了適當(dāng)?shù)拿庖咭种苿┑闹委?，但仍?huì)引發(fā)并發(fā)癥。當(dāng)受體免疫系統(tǒng)通過啟動(dòng)免疫反應(yīng)對供體器官中的外來抗原作出反應(yīng)時(shí)，就會(huì)發(fā)生心臟移植排斥反應(yīng)(heart transplantation rejection, HTR)[1]。近年來，盡管圍手術(shù)期管理取得了進(jìn)展，但同種異體移植排斥仍然是心臟移植后常見的并發(fā)癥，可導(dǎo)致同種異體移植物功能障礙和抗體介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)，并顯著損害患者的短期和長期預(yù)后[2]。

心臟移植動(dòng)物模型是進(jìn)行移植免疫學(xué)研究的重要實(shí)驗(yàn)手段，小鼠心臟移植模型經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，已經(jīng)形成了一系列完備的建立方法，其中以小鼠和大鼠的頸部和腹腔異位心臟移植模型最為常用[3-4]。本文就小鼠心臟移植后如何抑制其免疫排斥反應(yīng)作一綜述。

1 小鼠心臟移植動(dòng)物模型

建立大鼠和小鼠的心臟移植模型是研究移植排斥反應(yīng)較為理想的選擇，其中，大鼠異位心臟移植模型所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體型大，血管粗，容易建立成功，而小鼠體型小，建立小鼠異位心臟移植模型難度較大。但是由于近交系小鼠品種較多，實(shí)驗(yàn)成本較低，并有大量與之匹配的抗體和試劑，因此，小鼠心臟移植動(dòng)物模型是研究移植免疫學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)手段。目前，建立小鼠心臟移植模型主要有兩種方法：頸部異位心臟移植術(shù)和腹腔異位心臟移植術(shù)。這兩種建立方法各具特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用。

1991年，Chen等[5]首次創(chuàng)建了小鼠頸部異位心臟移植模型，此模型通常使用20～30 g雄性BALB/c和C57BL/6小鼠進(jìn)行手術(shù)。該模型主要優(yōu)點(diǎn)有：小鼠頸部血管相對容易分離、手術(shù)創(chuàng)口小、感染率低、術(shù)后存活率高等。主要缺點(diǎn)有：小鼠頸部血管直徑細(xì)，對手術(shù)設(shè)備的要求較高，需要在至少30倍的手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行，手術(shù)難度大[3-4,6]。

目前，小鼠腹腔異位心臟移植手術(shù)方法多借鑒大鼠Ono法，并加以改進(jìn)[7]。該模型主要優(yōu)點(diǎn)有：小鼠腹腔空間大，方便手術(shù)操作，小鼠腹主動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈相比血管直徑粗，在25倍手術(shù)顯微鏡下就可完成。主要缺點(diǎn)有：開腹手術(shù)創(chuàng)口大，感染概率高，并且腹部血管粘連緊密，血管分離難度較大[3-4,8]。

以上兩種小鼠心臟移植模型的構(gòu)建方法，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用，基本滿足心臟移植后排斥反應(yīng)和驗(yàn)證免疫抑制藥物療效等實(shí)驗(yàn)的需要。下面對抑制移植排斥反應(yīng)的不同方法進(jìn)行介紹。

2 抑制小鼠HTR的制劑

抑制小鼠HTR的制劑可以根據(jù)其作用免疫細(xì)胞的不同分為mTOR免疫抑制劑和阿司匹林、自組裝前藥納米顆粒、微小RNA-146a拮抗劑，下面分別介紹這些藥物對HTR的抑制作用。

2.1 mTOR免疫抑制劑

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target of rapamycinm,mTOR)于1991年首次被鑒定為釀酒酵母中雷帕霉素的靶標(biāo)。mTOR在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長中起重要作用，mTOR抑制劑對T淋巴細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用，是移植后抗排斥反應(yīng)常用的免疫抑制劑[9]。

mTOR抑制劑是器官移植受者的主要免疫抑制藥物。西羅莫司及其衍生物是常用的mTOR抑制劑。西羅莫司原名雷帕霉素，是一種天然大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是吸水鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物。在細(xì)胞質(zhì)中，mTOR復(fù)合物可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)不同的分子復(fù)合物：mTORC1和mTORC2，雷帕霉素與FK506結(jié)合蛋白12(FK506 binding protein,FKBP12)形成復(fù)合物，然后與mTORC1結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖[10]。

Nakamura等[9]研究表明，通過給心臟移植的小鼠腹腔注射雷帕霉素(3 mg/kg，在術(shù)后第0、2、4和6天進(jìn)行)，結(jié)果顯示雷帕霉素治療導(dǎo)致骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的募集并增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)分析表明，雷帕霉素誘導(dǎo)表達(dá)iNOS的MDSCs遷移到同種異體移植血管內(nèi)的內(nèi)膜下空間，與未治療組相比，雷帕霉素治療顯著延長移植物存活時(shí)間。

2.2 阿司匹林

阿司匹林(乙酰水楊酸)是非甾體抗炎藥中最主要的成員，通過干擾環(huán)加氧酶II(cyclo-oxygenase II,COX II)治療炎癥、疼痛和發(fā)熱，并有效抑制前列腺素的合成。

已有研究報(bào)道阿司匹林通過不依賴COX的途徑作為樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)成熟和活化的抑制劑，抑制DCs的免疫刺激功能。此外，阿司匹林還抑制DCs產(chǎn)生細(xì)胞因子，使DCs處于免疫耐受狀態(tài)。即使存在刺激劑，阿司匹林處理的DCs的免疫抑制功能仍然保留[11-12]。大量臨床研究[13]表明，阿司匹林成功降低了心臟移植患者移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)，延長了移植的生存期。在同種異位心臟移植小鼠模型中，腹腔注射阿司匹林后，阿司匹林通過影響核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路抑制DCs的成熟，并誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫低反應(yīng)性，然后減弱心臟移植后的急性HTR。可以有效延長小鼠的同種異體移植物存活率。此外，阿司匹林與FK506協(xié)同可有效提高移植排斥反應(yīng)的治療效果，表示阿司匹林與現(xiàn)有T細(xì)胞免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可能是抑制HTR更好的治療方案[14]。

2.3 自組裝前藥納米顆粒

心臟移植后，為防止HTR，mTOR免疫抑制劑是最常用的治療手段，但傳統(tǒng)的免疫抑制劑具有半衰期短、利用度低和劑量限制性毒性等缺點(diǎn)[15]。這些缺點(diǎn)阻礙了移植物的長期存活。mTOR抑制劑PP242是一種新型的第二代三磷酸腺苷競爭性mTOR抑制劑，通過與三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)的相互作用有效抑制mTORC1/mTORC2的激活。為更好地抑制HTR，用二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)對mTOR抑制劑PP242進(jìn)行化學(xué)連接，使其能夠在水溶液中自組裝成納米顆粒(DHA-PP242 nanoparticle,DPNP)。通過全身給藥的DPNP能夠在外周免疫器官內(nèi)的巨噬細(xì)胞中積累，它能夠以不依賴巨噬細(xì)胞的方式抑制T細(xì)胞增殖，同時(shí)以依賴巨噬細(xì)胞的方式調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化。DPNP可有效抑制同種異體小鼠心臟移植模型HTR的發(fā)展并顯著延長移植物存活時(shí)間[16]。與FK506相比，DPNP廣泛用于臨床器官移植治療，可以誘導(dǎo)更長的移植物存活時(shí)間，DPNP可以作為心臟移植后HTR的治療選擇。

2.4 微小RNA-146a拮抗劑

微小RNA-146a(microRNA-146a,miRNA-146a)拮抗劑通過調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,tregs)功能，可以改善小鼠HTR。CD4+CD25+Tregs細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3,Foxp3)，是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊群體，可抑制自身抗原的過度激活，監(jiān)測淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，并有效抑制過度的免疫反應(yīng)[17]。在抑制HTR的治療中，Tregs療法已用于臨床試驗(yàn)，旨在減少或替代可能導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用的免疫抑制劑的使用[18]。miRNA是非編碼單鏈小RNA分子，通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA-146a在免疫細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和功能中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，與常規(guī)CD4+T細(xì)胞相比，miRNA-146a在CD4+Tregs中高度表達(dá)，并控制Tregs的表達(dá)和功能[19]。在小鼠同種異位心臟移植模型的HTR中，miRNA-146a與CD4+Tregs的靶基因信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-1(signal transducer and activator of transcription, STAT 1)結(jié)合，主要通過STAT1/干擾素(interferon, IFN)-γ信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)Tregs細(xì)胞。使用miRNA-146a拮抗劑能夠降低miRNA-146a表達(dá)，同時(shí)協(xié)同應(yīng)用IFN-γ中和抗體可以抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，減輕排斥過程，延長供體心臟的存活時(shí)間[20]。在HTR發(fā)生時(shí)，Tregs的自噬活性受到損害。自噬是降解細(xì)胞內(nèi)成分的過程，它介導(dǎo)細(xì)胞死亡、淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和增強(qiáng)Tregs細(xì)胞功能。而miRNA-146a下調(diào)可以誘導(dǎo)Tregs自噬的發(fā)生。miRNA-146a介導(dǎo)的Tregs自噬上調(diào)有效延長了同種異體移植物的存活并防止同種異體移植物損傷[21]。以上均表明，已miRNA-146a為代表的miRNAs在抑制心臟移植免疫排斥反應(yīng)方面具有重要作用。

3 小結(jié)

心臟移植后發(fā)生的HTR是不可避免的，小鼠心臟移植模型的制作一方面可以模擬HTR的發(fā)生，另一方面可以對能夠抑制HTR發(fā)生的制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。目前能夠抑制HTR的制劑有mTOR免疫抑制劑、阿司匹林、自組裝前藥納米顆粒和miRNA-146a拮抗劑4類，其抑制機(jī)制不同，抑制效果不一，但是均有抑制HTR的效果。希望后續(xù)可以有更多的制劑或方法為小鼠心臟移植動(dòng)物模型的建立提供免疫抑制治療新策略，從而提高動(dòng)物模型建立的成功率。